實驗之細胞培養方法

1. 藥品製備

(1) DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養基(購自 HyClone Co.):

實驗中所使用之培養基為DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle

Medium），提供MG63似骨母細胞生長所需之養分。配置方法為加入10 ％ 的胎牛血清(BS)(購自HyClone Co.)和加入1% penicillin (購自HyClone Co.)，然後分裝並冷藏在4℃冰箱裡。

(2) α−modified MEM培養基(購自HyClone Co.):

實驗中提供MC3T3-E1似骨母細胞生長所需之養分，所使用之培養基為 α−modified MEM。配置方法須加入10 % FBS (購自HyClone Co.)和1%

penicillin(購自HyClone Co.)，然後分裝並冷藏在4℃冰箱裡。

(2)PBS（phosphate-buffered saline）

PBS 為一種緩衝溶液，在繼代過程中，可將培養皿內殘留的Ca²⁺ 、Mg²⁺

離子洗去，使細胞呈現懸浮狀態以利計數，本研究所使用的PBS(PH 7.2)

配方如下: 先將0.2克的KCl、0.24克的K₂HPO₄、0.14克的Na₂HPO₄及8克的 胞外基質蛋白如 osteonectin 和 osteopontin ，以合成細胞外基質(matrix)。此外，

骨母細胞可受多種激素，生長因子影響及調控(如 PTH、PGE2、TGF-β，

1α,25-(OH)2D₃ 等)。此外骨母細胞本身尚能合成並分泌一些生長因子，包括 PDGF， IGFs，TGF-β 及 endothelin-1 等，它們可能對本身或其他骨母細胞 產生調控作用。骨母細胞之細胞型態隨著造骨過程之進展而改變，其前驅細 胞(pre-osteoblasts)之核較大較圓，當造骨進行後，其核會愈來愈平。骨母細胞 也 參 與 骨 質 之 礦 化 (minerilization) 過 程 ， 它 分 泌 之 鹼 性 磷 酸 酶 可 與 1α,25-(OH)2D₃ 相 互 作 用 ， 使 Ca²⁺與 PO₄^3-形 成 不 規 則 的 鈣 磷 混 合 物 (amorphous calcium phosphate) 及 其 後 之 calcium hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)。此外它分泌之基質蛋白(matrix proteins) 為含有 90%第一型 膠原蛋白(type I collagen)及其它非膠原蛋白類(non-collagenous)蛋白質，(如 BGP，osteocalcin，osteopontin 等)對骨礦化過程也扮有重要角色。

本研究所使用的 MG63 細胞株(ATCC CRL-1427)來源為人類前驅骨癌細胞 (human osteogenic sarcoma)。其具有單層生長及如同纖維母細胞般的梭狀型態 (圖 1-11)。由於此細胞可以表現許多的骨母細胞特徵，因此已被廣泛用於骨母 細胞相關的研究。例如，其會在 1α,25-(OH)2D3刺激下表現高度的鹼性磷酸酶 活性、合成骨鈣素、抑制生長再生、並表現不同的細胞型態(Franceschi et al., 1985)，並在 PTH 及 PGE2 的刺激下產生環腺苷磷酸(cyclic AMP)(Sollazzo et al., 1997; Lohmann et al., 2000)，此外 MG63 細胞具有表現基質小泡(matrix vesicles) 的能力(Bassett, 1993)。Boyan 等人(1998)的研究亦發現，MG63 對物理環境改 變後的反應與骨母細胞相類似。因此 MG63 細胞被視為似骨母細胞

(osteoblast-like cell)，並廣泛用為骨母細胞增殖、分化與功能的體外實驗(in vitro)模型。

MC3T3-E1 細胞株

此細胞株來自新生的老鼠頭蓋骨，細胞生長是屬於貼附的方式，外型類 似纖維母細胞的型態(圖 1-12)，和此細胞之間會有大量的纖維產生(Sudo et al, 1983)。Quarles 等人(1992)的研究對 MC3T3-E1 似骨母細胞的生長做了分析，

在培養初期(1-9 天) MC3T3-E1 細胞複製速度很活躍，並有大量的 DNA 合成 和細胞數目增加，細胞呈現紡錘形的型態，而鹼性磷酸酶活性和礦物化的細 胞外基質表現並不明顯。MC3T3-E1 細胞生長到了第 9 天，呈現立方體的型

態，生長速度趨緩，並且達到單層細胞貼滿的狀態，同時，開始表現骨母細

比例轉移至新的培養皿中。實驗進行時，所有細胞均先等24小時，以使細胞 electron microscopy, SEM)對細胞的型態進行觀察。實驗進行時將細胞培養於 已置入聚乳酸試片的 24 孔培養盤中，實驗分為暴露組與未暴露組，時間點到 時，對細胞進行前處理。首先去除細胞培養液，並以 PBS 清洗細胞三次，接 著將細胞以2.5%戊二醛(glutaraldehyde)及 2%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定 20 分鐘，然後再以 1% (in 0.1 M PBS)四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 30 分鐘。

在初步固定之後，樣品再以 1%鋨酸後固定 1 小時。接著將樣品以 PBS 清洗並 依序以 70%、80%、90%、95%及 100%酒精進行脫水與臨界點乾燥(HCP-2, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)。脫水乾燥後的樣品以鍍金器(IB-2, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)噴鍍一層鈀金(palladium gold)。處理後的細胞利用 Hitachi S-2400 電子顯微鏡系統加以觀察(Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)。每一實驗組準備 3 個樣 品，每個樣品均對九個區域進行觀察與攝影。