第二章、 文獻查證
第三節 靜磁場對骨母細胞的影響
磁附連體是口腔醫學常使用的一種裝置，其最早的應用多集中於全口假 牙的固定及作為牙齒贋復的連接裝置(Javid, 1971)。然而由於早期的磁附連體 材料如鋁-鎳-鈷合金(AlNiCo)或鈷-鉑合金(PtCo)的磁力強度仍然不足，因此在 應用上仍有相當的限制。近幾年來，由於稀土金屬(rear earth metal)磁附連體 製作技術的進步，尤其是銣鐵硼磁附連體(NdFeB)的發明，使得磁附連體得以 在小型化之後仍能擁有足夠的磁力，這不僅使得磁附連體可以提供贋復義齒 所需的結合力(Melissa et al., 2001; Ai and Shiau, 2004)，更可作為臨床矯正所需 的力量來源(Darendeliler et al., 1997)，或應用靜磁場來促進前驅骨母細胞分化 (Huang et al., 2006)。
磁鐵的形式依其產生的原因可以分為電磁鐵與永久磁鐵，其中電磁鐵依 其供電方式的不同又可以產生不同的磁場形式；分別為交流磁場、直流脈衝 式磁場及直流靜磁場三種。
由於脈衝式電磁場刺激骨癒合的成功率可以達到 80%以上，且幾乎不受 骨折位置、不癒合期及手術次數的影響(Garland et al., 1991)，因此早在 1979 年美國食品藥物管理局(FDA)即已核准這項治療技術，迄今已實際普遍的應用 在臨床治療上，並獲致很好的療效(Gossing et al., 1992; Trock, 2000)。
在靜磁場對骨質或骨細胞的影響上，臨床觀察曾發現，永久磁鐵產生的 靜磁場與脈衝式磁場有相同的作用，均會加速牙齒的移動速度(Tengku et al.,
2000)。雖然他們具此推論認為，靜磁場也可以增加未成熟的前驅細胞成熟為
後續的似骨母細胞(osteoblast-like cell TE-85)實驗亦發現靜磁場明顯的增加了 IGF-II receptor 的數目(Fitzsimmon et al., 1995)。
骨母前驅細胞的基因表現主要可以分為三個時期：增殖期(proliferation)、
細胞外基質成熟期(extracellular matrix maturation)、礦化期(mineralization)。在 整個骨質形成過程中有兩個限制點(restriction point) ，在沒有訊號的情形下，
細胞是無法跨過這兩個限制點的：第一個限制點是當增殖表現減少，而與細 胞外基質成熟期有關的基因表現被引發時。第二個限制點是當礦化發生時。
一開始活化的增生細胞表現細胞週期(histone)及細胞生長(c-myc, c-fos)調控基 因，並開始製造 type I collagen、fibronectin、TGF-β1 (準備進入細胞外基質成 熟期)。接著，細胞增生減少而與細胞外基質成熟期有關的基因便會開始表現。
一旦細胞增殖被抑制，細胞會開始將富含鹼性磷酸酶的基質小泡(matrix vesicle)分泌至細胞外形成骨基質(bone matrix)，使得骨母前驅細胞分化
(differentiate)成骨母細胞所具有的特異性標記(marker)如鹼性磷酸酶活性馬上
增加十倍，此外造骨蛋白(osteopntin)也會大量的表現。接著在進入礦化期時， (可以分化成 monocytic, macrophage, myogranulocytic)及 adipocytes (由 3T3-l1 分化成)等細胞也具有這樣的特性(Stein et al., 1990)。
靜磁場對似骨母細胞的影響實驗發現，在 4000 高斯的靜磁場暴露下，特 定的初始細胞培養密度下(1x104 cells/ml)，細胞數目會在第 24 小時開始被抑 制，生長速率會明顯低於未暴露組，掃描式和穿透式電子顯微鏡觀察實驗裡，
發現似骨母細胞在靜磁場刺激下表現出更成熟的型態和更多的細胞外基質，
此外，靜磁場暴露組的鹼性磷酸酶活性、膠原蛋白、TGF-β、骨鈣素(osteocalcium) 和造骨蛋白(osteopontin)表現都明顯增加。此研究證明了似骨母細胞在靜磁場 刺激下，會藉由影響局部分化因子的釋放來促進似骨母細胞的分化程度 (Huang et al.,2006)。此研究作者更進ㄧ步推論，靜磁場促進似骨母細胞分化是 藉由影響細胞膜流動性，進而激發細胞內訊息傳遞路徑，而有之後似骨母細 胞分化的表現。
近年來，由於牙科植體的盛行，許多關於加快植體表面骨整合的研究紛 紛被提出，其中有研究提到靜磁場於牙科植體上的應用性(Kim et al. 2004)，實 驗設計配合牙科臨床磁性贋復物的實際情況。在臨床上，磁體距離牙科植體 約 3~5mm，此處的磁力強度約 10mT，實驗結果發現，培養在鈦金屬片上的 TE-85 似骨母細胞，在靜磁場的刺激下，雖然 fibronectin peptide 貼附於鈦金屬 的量和控制組一樣，然而，在 1mT 的靜磁場刺激下，TE-85 似骨母細胞的貼 附能力和生長速率皆比未刺激組來的高。此外，TE-85 似骨母細胞在靜磁場的 刺激下，外觀趨向更平坦的型態。作者提到靜磁場影響組織細胞可能的機轉，
其中之ㄧ是 magnetomechanical effect，也就是靜磁場可能會對細胞產生力矩般 的機械外力，進而導致細胞生長分化上的改變，至於正確的機轉則還須釐清 (Kim et al. 2004)。
第四節、Mechanotransduction 的概念
人體生活的物理環境是隨時接觸多樣的機械外力，例如：施予人體上的 重力和肌肉作用於骨頭上的拉力。其它包括，步行和運動時在軟骨細胞與骨 細胞上所造成的壓力(compressive force)、血液流動在血管內所造成的靜液體 壓力（hydrostatic pressure）與剪應力(shear stress)等均屬於力學作用。同樣地，
肺臟組織也是週期性地受到呼吸所造成的機械力，其他如心臟也不斷受到因 為血液體積和壓力改變而產生的機械力。近年來實驗發現組織的生長和重新
塑造會因為機械外力刺激的改變而有反應，證明機械力負載、力學傳遞機制
ECM-integrin-cytoskeleton pathway 是其中一項傳遞路徑，指的是細胞藉由 integrin 貼附到細胞外基質(ECM)，而 integrin 會連接到細胞骨架
(cytoskeleton)，這個結構的連接提供一條傳導機械訊息的路徑，導致整個力學 能量可由細胞外傳遞至細胞內，進而開啟許多細胞內的訊息傳遞路徑。隨著 這方面的研究蓬勃發展，歸納出主要參與細胞力學傳遞機制的分子，如：
integrin、G coupled receptor protein 、receptor tyrosine kinase (酪胺酸磷酸酶受 器)與 stretch- activated ion chnnels(拉伸-誘導的離子通道)等(Coppolino and Dedhar., 2000; Clark et al., 2002)。關於力學誘導細胞內分子生物訊息之啟動、
傳遞路徑之研究，此一傳導路徑稱為力學訊息傳遞路徑(Mechanotransduction)。
近年來已有許多有關骨母細胞力學生物學的實驗，當在培養的骨母細胞
上給予流動的液體時，流體在細胞膜表面產生剪切力，可明顯觀察出有大量 並快速的一氧化氮與前列腺素 E2 釋放(Walker et al., 2000)。另外也有實驗把細 胞培養在可被外力曲折的培養皿上(Peake et al., 2000)，然後施予機械力，研究 觀察到許多不同的生化反應，如生長因子、賀爾蒙的合成。此外，醫學上很 早便認為超音波對骨折後的恢復極有幫助，分子生物學的研究也指出，經超 音波刺激的人類似骨母細胞(MG63)，其鹼性磷酸酶與骨鈣素(Osteocalcin) mRNA 的表現量有明顯的上昇(Maddi et al., 2006)。超音波本身即是一種機械 波，此種機械波作用於細胞上，亦使細胞受到力量。目前已知，此亦為力學 生物學之作用。所以物理性的機械力在骨母細胞上，確實有重要的角色。然 而目前雖然已清楚知道機械力與細胞間的生理關係, 但仍不清楚細胞如何感 受機械力並且轉換這類力學訊號至生物反應。
第三章 、研究 材料與方法
第一節、聚乳酸試片之製備與清洗
本研究所使用的聚乳酸試片生物材料為分子量 140,000Da 的聚乳酸複合 材(Bio-tech one Incorporation, Taipei, Taiwan)，由 95%聚左乳酸(Poly-L-lactic acid, PLLA )和 5%聚右乳酸(Poly-DL-lactide, PDLA )組成，利用自動射出成形 機器(圖 1-5、圖 1-6 和圖 1-7)製備成聚乳酸圓形試片，直徑 14 mm (此尺寸與 24-well 培養皿相同，並利用 24-well 培養皿作為細胞培養載具)，厚度 1 mm(圖 1-9)，經γ-ray(20kGy)滅菌後(分子量 100,000-140,000kGy)，分批真空包裝並保 存於防潮箱內。進行細胞實驗之前，先將聚乳酸試片放入燒杯內並加入洗潔 高斯。根據McDonald (1993)的報告，磁場方向對細胞的效應影響不大，因此 在本研究計劃中，所有實驗之細胞一律控制暴露於 N 極下。在假暴露組中，
細胞放置於相同尺寸之未充磁銣鐵硼金屬塊。在所有的實驗中，細胞在受磁 場暴露前均先培養 24 小時以待細胞貼附，並以此時間定義為 0 小時。觀察時 間為 0、1、2、3、4 和 5 天。
第三節、實驗之細胞培養方法
1. 藥品製備
(1) DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養基(購自 HyClone Co.):
實驗中所使用之培養基為DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle
Medium），提供MG63似骨母細胞生長所需之養分。配置方法為加入10 ％ 的胎牛血清(BS)(購自HyClone Co.)和加入1% penicillin (購自HyClone Co.)，然後分裝並冷藏在4℃冰箱裡。
(2) α−modified MEM培養基(購自HyClone Co.):
實驗中提供MC3T3-E1似骨母細胞生長所需之養分，所使用之培養基為 α−modified MEM。配置方法須加入10 % FBS (購自HyClone Co.)和1%
penicillin(購自HyClone Co.)，然後分裝並冷藏在4℃冰箱裡。
(2)PBS（phosphate-buffered saline）
PBS 為一種緩衝溶液，在繼代過程中，可將培養皿內殘留的Ca2+ 、Mg2+
離子洗去，使細胞呈現懸浮狀態以利計數，本研究所使用的PBS(PH 7.2)
配方如下: 先將0.2克的KCl、0.24克的K2HPO4、0.14克的Na2HPO4及8克的 胞外基質蛋白如 osteonectin 和 osteopontin ，以合成細胞外基質(matrix)。此外，
骨母細胞可受多種激素，生長因子影響及調控(如 PTH、PGE2、TGF-β，
1α,25-(OH)2D3 等)。此外骨母細胞本身尚能合成並分泌一些生長因子，包括 PDGF， IGFs，TGF-β 及 endothelin-1 等，它們可能對本身或其他骨母細胞 產生調控作用。骨母細胞之細胞型態隨著造骨過程之進展而改變，其前驅細 胞(pre-osteoblasts)之核較大較圓，當造骨進行後，其核會愈來愈平。骨母細胞 也 參 與 骨 質 之 礦 化 (minerilization) 過 程 ， 它 分 泌 之 鹼 性 磷 酸 酶 可 與 1α,25-(OH)2D3 相 互 作 用 ， 使 Ca2+與 PO43-形 成 不 規 則 的 鈣 磷 混 合 物 (amorphous calcium phosphate) 及 其 後 之 calcium hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)。此外它分泌之基質蛋白(matrix proteins) 為含有 90%第一型 膠原蛋白(type I collagen)及其它非膠原蛋白類(non-collagenous)蛋白質，(如 BGP，osteocalcin，osteopontin 等)對骨礦化過程也扮有重要角色。
本研究所使用的 MG63 細胞株(ATCC CRL-1427)來源為人類前驅骨癌細胞 (human osteogenic sarcoma)。其具有單層生長及如同纖維母細胞般的梭狀型態 (圖 1-11)。由於此細胞可以表現許多的骨母細胞特徵，因此已被廣泛用於骨母 細胞相關的研究。例如，其會在 1α,25-(OH)2D3刺激下表現高度的鹼性磷酸酶 活性、合成骨鈣素、抑制生長再生、並表現不同的細胞型態(Franceschi et al., 1985)，並在 PTH 及 PGE2 的刺激下產生環腺苷磷酸(cyclic AMP)(Sollazzo et al., 1997; Lohmann et al., 2000)，此外 MG63 細胞具有表現基質小泡(matrix vesicles) 的能力(Bassett, 1993)。Boyan 等人(1998)的研究亦發現，MG63 對物理環境改 變後的反應與骨母細胞相類似。因此 MG63 細胞被視為似骨母細胞
(osteoblast-like cell)，並廣泛用為骨母細胞增殖、分化與功能的體外實驗(in vitro)模型。
MC3T3-E1 細胞株
此細胞株來自新生的老鼠頭蓋骨，細胞生長是屬於貼附的方式，外型類 似纖維母細胞的型態(圖 1-12)，和此細胞之間會有大量的纖維產生(Sudo et al, 1983)。Quarles 等人(1992)的研究對 MC3T3-E1 似骨母細胞的生長做了分析，
在培養初期(1-9 天) MC3T3-E1 細胞複製速度很活躍，並有大量的 DNA 合成
在培養初期(1-9 天) MC3T3-E1 細胞複製速度很活躍，並有大量的 DNA 合成