2-1 實驗技術
2-1.1 單分子實驗技術
單分子實驗技術 (single-molecule experiment techniques) 近年來發展快 速，目前在包含物理學、生物學與化學中的不同領域具有相當多的應用。其 tweezers)、利用雷射操控聚合球的光鉗 (optical tweezers)、微流道拉伸 (flow stretch) 和原子力顯微鏡 (atomic force microscopy, AFM) 等[9]。另一類型則 為單分子螢光光譜，藉由觀察目標上的螢光分子來得知每個目標分子的行為，
按照激發的三維空間，可分為全內反射式螢光 (total internal reflection fluorescence, TIRF)、共軛焦 (confocal) 與廣視場 (wide-field) 顯微鏡等[9]。
其中全內反射式螢光顯微鏡因其所產生的背景雜訊較低，相當適合配合螢光 共振能量轉移的方法來觀察分子動態學。
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圖 十二、單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡；(B) 光鉗；(C) 磁鉗；(D) 單 分子螢光光譜。摘錄自參考資料[9]。
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2-1.2 螢光共振能量轉移
螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)，為螢 光分子間利用非放光過程進行能量轉移的機制[10]。在此系統中存在供體 (donor) 與受體 (acceptor) 兩種螢光分子，供體被能量激發至激發態後，會 以放光的形式回到基態。若同時存在一受體分子，且滿足以下三個條件，此 時激發態的供體將藉由偶極-偶極作用 (dipole-dipole interaction) 將能量轉 移給受體，使之躍遷至激發態，隨後經由發出螢光返回其基態。
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圖 十三、螢光共振能量轉移。(A) 能量轉移效率與距離關係圖；(B) 能量轉移與偶極矩關 係。摘錄自參考資料[10]。
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2-1.3 全內反射螢光顯微鏡
全內反射螢光顯微鏡 (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF-M) 可分為兩種，如圖十四所示、物鏡型 (objective-type) 與稜鏡型 (prism-type)，而實驗室所使用的系統為稜鏡型全內反射顯微鏡。
當光經由高折射率之高密度介質進入低折射率之低密度介質時，若入射 角大於臨界角 (critical angle, 𝜃𝑐)，則會產生全內反射 (total internal reflection) 現象，並於低密度介質的全反射交界處產生漸逝場 (evanescent field)，穿透 深度約為 100 nm，而漸逝場的強度隨深度呈指數衰減，所以只有極靠近全 反射面的螢光分子才會被激發，大幅降低背景雜訊的干擾，可達成單分子螢 光偵測所需之訊躁比 (signal-to-noise ratio)。
圖 十四、TIRFM 裝置示意圖。(a) 稜鏡型；(b) 物鏡型。
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2-1.4 實驗儀器架設
實驗室使用倒立式光學顯微鏡 (inverted microscopy, Nikon Eclipse Ti-S) 建立稜鏡型全內反射顯微鏡；激發光源使用波長 532 nm 與 638 nm 雷射光 源，以配合供體 (Cy3) 與受體 (Cy5) 的激發波長；由於考慮到樣品槽厚度，
必須使用長工作距離水浸潤物鏡 (long working distance water immersion objective, Nikon CFI Plan Apo VC 60XWI)；而偵測器則是使用電子放大式電 荷耦合元件 (Electron Multiple Charge-coupled Device, EMCCD, Andor iXon Ultra 897)。
如圖十五所示，532 nm 雷射會以電子快門 (shutter) 切換開關，而 638 nm 雷射則以電子訊號進行開關。兩道雷射首先皆會通過調整光偏振方向的 半波片 (Half-wave plate)，並經由偏振分光鏡 (polarization beam splitter)，
能使 P 偏振光完全通過，而 S 偏振光以 90 度角反射，藉由轉動半波片，
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兩道光以小夾角同時通過另一消色差凸透鏡 (f = 250 mm)，最終將影像會聚 在位於焦面 (focal plane) 的影像偵測器上，而兩個不同波長的影像可藉由調 整前述雙色鏡與反射鏡，使之水平並列，立於同時觀察此二頻道的影像。
圖 十五、光學零件架設示意圖。
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2-1.5 電子放大式電荷耦合元件
電 子 放 大 式 電 荷 耦 合 元 件 的 運 作 原 理 是 基 於 電 荷 耦 合 元 件 (charge-coupled device, CCD)，是一種積體電路，具有許多排列整齊的感光 元件，當感光元件感應到後，會產生電荷，電荷數量會與入射光強度成正比，
接著電荷會移動至電容中，經由讀出暫存器讀取並儲存，最後再由倍增暫存 器將電荷轉移並使電子放大數倍，而 EMCCD 與其最大的不同在於倍增暫 存器之後，被放大的電子再經由低雜訊的讀出倍增器放大並轉換成電壓輸出，
以產生影像。
由於 EMCCD 本身擁有致冷器，可將感測晶片降溫至 -70 度以下，因 此有效降低暗電流的產生，增加訊躁比，且能夠選擇讀出訊號的所需倍增的 區段，在有背景訊號的情況下有效提升動態範圍 (dynamic range)，特別適合 應用於單分子螢光實驗上。
20 機 (Harrick Plasma, PDC32G1051059)，以空氣電漿清洗五分鐘。
另取兩個玻璃染色壺作為反應容器。按照以下步驟：
1. 裝滿氫氧化鉀，超音波震盪30 分鐘，以超純水洗淨容器。
2. 裝滿甲醇，超音波震盪30 分鐘，用甲醇潤洗容器，以氮氣吹乾。
3. 將處理過之載、蓋玻片放入反應容器中。
4. 取 100ml 甲 醇 、 5ml 醋 酸 、 1ml 三 甲 氧 矽 丙 基 乙 二 胺 (N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylwnwdiamine, aminosilane) 配 製 成反應溶液，其功能為與玻片產生鍵結。 (biotin-PEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) 與[玻片數+0.5]*64 μL 的0.1 M 碳酸氫鈉配製為 PEG 溶液，混合均勻後以冷凍離心機離 心，其功能為與修飾 aminosilane 的玻片產生鍵結。
8. 將PEG 溶液上清液 70 μL 放在載玻片兩邊小洞間，覆蓋蓋玻片，
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靜置4 小時。
9. 以超純水洗淨，氮氣吹乾，裝入蓋子打孔的50 ml 離心管內，再放 入真空包裝中抽真空，最後保存至 -20℃ 冰箱。
圖 十六、樣品槽製備步驟示意圖。
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2-2.2 樣品槽組裝
實驗前將載、蓋玻片之真空包裝取出，並回到室溫後取出，按照以下步 驟 (圖十七)：
1. 載玻片之聚乙二醇面朝上，將兩個小洞作為迴流通道，共四個，並 以雙面膠間隔。
2. 以蓋玻片之聚乙二醇面覆蓋於通道上方。
3. 以環氧樹脂密合通道末端，移至暗處等待環氧樹脂凝固即可使用。
圖 十七、樣品槽組裝示意圖。
23 (CTG)10 NH2C6 (CTG)10 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)11 NH2C6 (CTG)11 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)12 NH2C6 (CTG)12 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)13 NH2C6 (CTG)13 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)14 NH2C6 (CTG)14 GCCTCGCTGCCGTCGCCA
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序列名稱 5' 修飾 序列 – 3’ 修飾
(CTG)15 NH2C6 (CTG)15 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)18 NH2C6 (CTG)18 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)21 NH2C6 (CTG)21 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)22 NH2C6 (CTG)22 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)27 NH2C6 (CTG)27 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)29 NH2C6 (CTG)29 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)31 NH2C6 (CTG)31 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)33 NH2C6 (CTG)33 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)35 NH2C6 (CTG)35 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)37 NH2C6 (CTG)37 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)6T3 NH2C6 (CTG)6T3 GCCTCGCTGCCGTCGCCA T3(CTG)6 NH2C6 T3(CTG)6 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)2CT4G(CT
G)2
NH2C6 (CTG)2CT4G(CTG)2GCCTCGCTGCCGTCGC CA
(CTG)2CT4G(CT G)3
NH2C6 (CTG)2CT4G(CTG)3GCCTCGCTGCCGTCGC CA
(CTG)3T3(CTG)3 NH2C6 (CTG)3TTT(CTG)3GCCTCGCTGCCGTCGCC A
mCAG NH2C6 CAG(CTG)24 GCCTCGCTGCCGTCGCCA m4CAG NH2C6 (CAG(CTG)2)4(CTG)13GCCTCGCTGCCGTC
GCCA
mloop NH2C6 (CTG)11CAG(CTG)13GCCTCGCTGCCGTCG CCA
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2-2.4 螢光分子標記
生物分子的螢光標記較常使用氨基的交聯反應 (cross-linking reaction)，
反應式如圖十九所示，藉由將主序列 5’ 第一個核苷酸修飾以六個碳為距離 tetraborate decahydrate, SIGMA-ALDRICH)。
2. 將氨基修飾的主序列 (Protech, Taiwan) 加入 Cy3 溶液，室溫下慢
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2-2.5 DNA 黏合反應
螢光分子修飾完成後，必須先與具有生物素標記的副序列黏合。如圖二 十所示，當 DNA 溫度超過熔點 (melting point, Tm) 時，其構型會被完全打 開，此時將溫度以緩慢降溫 (annealing) 的方式，DNA 將會形成最穩定的 構型，以達成主、副序列黏合。而由此方法進行製備的 DNA 樣品，在高 濃度下有部分分子會形成分子間二聚體 (dimer)，之後會再以其他方法去除。
依照以下步驟進行黏合反應：
1. 取1 μL、100 μM 副序列，3 μL 主序列與 16 μL T100 buffer (含有 100 mM NaCl 與 1 M Tris buffer, pH ~ 7.8) 配置成樣品原液。由於 必須與副序列的黏合後才能固定於玻片上，所以此時樣品濃度為 5 μM，未黏合的過量主序列置換溶液時，將會被沖出，因此並不影 響實驗的觀察。
2. 使 用 溫 度 梯 度 熱 循 環 反 應 儀 (Thermal cycler, Bio-Rad, T100 Thermal Cyder)，加熱至 95 度並維持 5 分鐘，再以每分鐘降 1 度 的速率降至 22℃，主、副序列將會形成其最穩定的結構，即雙股 黏合，此為 DNA 樣品原液。
圖 二十、黏合反應示意圖。
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2-2.6 分子間二聚體去除
欲去除分子間二聚體，必須將樣品配製至低濃度後，加熱至能使分子間 二聚體解開，但不至於將雙股解開的溫度，再以 annealing 的方式回到室溫，
如圖二十一所示。按照以下步驟：
1. 取 0.2 μL、10 nM 樣品原液，2 μL、20μg/μL 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA)，197.8 μL T100 buffer 配製成 10 pM 樣品溶 液。
2. 使用溫度梯度熱循環反應儀，加熱至 50 度並維持 5 分鐘，再以 每 4 分鐘降 1 度的速率降至 22℃。由於此時 DNA 濃度相當低，
其在溶液中相當分散，因此不容易再次形成分子間二聚體，即可達 到去除的目的。
圖 二十一、分子間二聚體去除示意圖。
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2-2.7 固定樣品於樣品槽
主、副序列黏合反應完成後，利用抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin, Thermo Fisher Scientific Inc.) 能夠與至多四個生物素結合的特性，同時將玻片與副 序列上的生物素結合，進而將樣品固定於玻片上。將以控制樣品濃度與反應 時間，以進行單分子實驗的觀察。按照以下步驟：
1. 注入 0.2 μg/μL NeutrAvidin 至樣品通道中，靜置兩分鐘。置換成 T100 buffer。
2. 注入去除分子間二聚體的樣品溶液至樣品通道中，靜置兩分鐘。置 換成 T100 buffer，即完成固定樣品於樣品槽，如圖二十二所示。
圖 二十二、單分子實驗設計。摘錄自參考資料[13]。
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2-2.8 光漂白與閃爍現象
如圖二十三所示，螢光分子被激發至激發單重態 (excited singlet state)，
電子會先由振動鬆馳 (vibrational relaxation) 到第一激發單重態 (S1) 的最 低能階，再經由不同途徑釋放能量並回到基態，而利用放光的方式稱為螢光 (fluorescence)，其過程僅有 10-7~10-9 秒，此時視為亮態。放出螢光前，電 子若經過系統間跨越 (intersystem crossing) 過程，跨越至較低能量且擁有不 同自旋的激發三重態 (excited triplet state, T1)後，若以放光的方式回到基態，
稱為磷光 (phosphorescence)，由於放出磷光的選擇律 (selection rule) 是被禁 止的，所以此過程需要相當長的時間，約 10-3 – 102 秒，因此其單位時間可 被偵測的光子量相當低，此時將其視為暗態 (dark state)。電子的亮、暗態轉 換過程，在實驗中即會觀察到螢光分子產生閃爍 (blinking) 現象，其解決方 法在溶液中加入三重態淬熄劑 (triplet quencher)，即可降低閃爍現象發生的 頻率[14]。
圖 二十三、電子躍遷與放光過程示意圖與各過程所需時間。摘錄自參考資料[10]。
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如圖二十四所示，在單分子螢光實驗中，必須使用雷射激發螢光分子，
而在高強度的雷射長時間照射下，溶液中的氧氣會形成具活性氧的單重態 (singlet oxygen)，並與激發後的螢光分子產生反應，造成螢光分子無法再放 光，此種現象稱為光漂白 (photobleaching) 現象[10]。解決光漂白現象的方 法有許多中，通常利用控制激發光強度與照射時間或更換結構較強的螢光分 子來減緩發生光漂白的速率，而在此實驗中則是在溶液中加入除氧系統，以 除去氧氣，避免其產生活性氧而破壞螢光團。
圖 二十四、放光過程與光漂白機制示意圖。摘錄自參考資料[10]
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三重態淬熄劑則是使用水溶性維生素E (Trolox, Sigma-Aldrich)，將其溶 解於對螢光分子與生物分子較穩定，且酸鹼值與生理條件 (pH = 7.7 - 7.9)
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2-2.10 互補股序列之真實濃度計算
進行互補股序列競爭實驗時，為了計算其動力學常數，必須先計算互補 序列 (CAG)n的濃度。首先使用微量分光光度計 (NanoPhotometer, IMPLEN GMBH NanoPhotometer NP80 Tough) 測量核苷酸之吸光值 (absorbance, A)，
其單位是光密度 (optical density, OD)。核苷酸的吸光值主要是在波長 230 nm、260 nm 和 280 nm 。其中 230 nm 的吸收值是由有機鹽類貢獻、260 nm 是核苷酸所貢獻、280 nm 則是由蛋白質貢獻。而 A260/280 的比值可估算核 苷酸純度；A260/230 的比值則可確認樣品中是否有有機鹽類汙染。因此須選
其單位是光密度 (optical density, OD)。核苷酸的吸光值主要是在波長 230 nm、260 nm 和 280 nm 。其中 230 nm 的吸收值是由有機鹽類貢獻、260 nm 是核苷酸所貢獻、280 nm 則是由蛋白質貢獻。而 A260/280 的比值可估算核 苷酸純度；A260/230 的比值則可確認樣品中是否有有機鹽類汙染。因此須選