以單分子光譜觀測 CTG 重複序列的滑動現象

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department of Chemistry College of Science National Taiwan Normal University Master Thesis. 以單分子光譜觀測 CTG 重複序列的滑動現象 Real-time Observation of DNA Slippage Motions in Tandem CTG Repeats Using Single-molecule Spectroscopy. 倪丞緯 Cheng-Wei Ni 指導教授：李以仁博士 Advisor : I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國 106 年 7 月 July 2017.

(2) 致謝感謝指導教授李以仁老師給予學生自由的研究空間，讓我學習上能夠師逸功倍，從初來乍到之時，經歷過由零開始的環境、程式編寫的自我學習、簡單的實驗操作以及精密儀器的裝卸，除了學識和技術的指導外，更強調應有的研究心態與自由思考的重要性，這將予我在往後生涯中，即使在各個不同領域也將受用無窮。. 而在漫長的研究工作中，難免遭遇難題與碰壁之時，感謝任何幫助過我的師長，李弘文老師、溫進德老師、范秀芳老師與洪偉修老師提供的學術研究上的交流和指點。感謝實驗室顥頤、佳諭、子芸和建棋所給予的建議與鼓勵，讓問題皆是迎刃而解。也感謝實驗室的夥伴們，洋逸、巧穎和語潔在繁重工作量的分憂解勞，傾訴實驗失敗的時刻、分享成果收穫的喜悅以及閒聊著日常的瑣碎，致使我的研究生活增添不少色彩。. 時光荏苒，即將於化學所畢業，回首就讀研究所的兩年中，有著剛到實驗室的摸索與學習，同儕生活的陪伴與鼓勵，師長教導的思考與啟發，研究工作的困難與突破，論文撰寫的成長與收穫，短短的兩年將值得我一再細細回味。. i.

(3) 摘要三核苷酸重複序列會導致許多種神經退化性遺傳疾病，而其中的 CTG 重複序列是導致神經退化性脊髓小腦失調症第 8 型、肌強直性型肌肉萎縮症後群第一型、類亨丁頓舞蹈症第二型的主要因素，這些疾病的病患的染色體上，能夠發現其所擁有的 CTG 重複序列會有過表達的現象 (至少 35 組以上)。造成 DNA 重複序列擴張的原因，是由於 DNA 本身會形成非典型的二級結構，因此誘導 DNA 在複製、修復與重組的過程中發生滑動現象。在本篇研究中，我們使用單分子螢光共振能量轉移光譜研究 CTG 重複序列的結構動態學，其結構會與 CTG 的重複次數有關，偶數重複的 (CTG)n 會穩定折疊成兩端對齊髮夾結構；而奇數重複的 (CTG)n 則會在兩端對齊髮夾結構與單組 CTG 突出的髮夾兩種結構間，進行互相轉換，且無論重複次數多寡，構型皆傾向於兩端對齊髮夾結構。我們提出一個構型間轉換過程的局部不穩定傳遞模型，其是先由髮夾結構中的環處改變構型，並形成氣泡狀突出，之後以氣泡移動的方式，連續往末端移動，直到構型改變。而重複序列增長時，雖然總體穩定性增加，但因為構型轉換是由局部不穩定所驅動，因此此一滑動機制可以延伸到更長的序列，可能為導致 DNA 擴張而致病的原因之一。. 關鍵字：單分子、螢光共振能量轉移、CTG 重複序列、DNA 滑動、三核苷酸重複序列擴張疾病. ii.

(4) Abstract Tandem nucleotide repeats are responsible for many genetic neurodegenerative disorders. Among them, the trinucleotide, CTG, repeat is the primary cause of Spinocerebellar Ataxia Type 8, Myotonic Dystrophy Type I, and Huntington disease like 2. Overexpression (>35 bases) of CTG repeat can be found in the chromosome of every patient. The possible cause of error-prone expansion is the DNA slippage induced by the folded atypia structures during DNA replication, repair or recombination process. Here, we present our single-molecule fluorescence resonance energy transfer study on the size-dependent structure and structural dynamics. A parity (even or odd) dependence was found: The even-numbered sequence folds into a stable blunt-end hairpin structure, while the odd-numbered repeat mainly folds into two hairpin structures including single-repeat overhang structure and blunt-end hairpin structure. Interestingly, dynamic interconversions between the blunt-end and the overhang configurations were observed in the longer odd-numbered-repeat sequences and the equilibrium lean toward to the blunt-end configuration. We propose a multi-step bulge transfer model: Local conformational transition at the looping region induces a bulge formation followed by stepwise bulge transferring toward the end of the hairpin and ultimately achieves the conformational change. This mechanism allows the DNA slippage extends to longer repeats that carry greater global stability and can possibly be the cause of the disease-prone expansion.. Keyword：Single-molecule、Fluorescence resonance energy transfer、DNA slippage、 FRET、CTG tandem repeats、Triplet repeat expansion disease、TREDs. iii.

(5) 目錄致謝................................................................................................................................. i 摘要................................................................................................................................ii Abstract ........................................................................................................................ iii 目錄............................................................................................................................... iv 圖目錄..........................................................................................................................vii 表目錄............................................................................................................................ x 第一章、. 緒論........................................................................................................ 1. 1-1. 前言............................................................................................................ 1. 1-2. 致病原因.................................................................................................... 3. 1-3. 非典型二級結構........................................................................................ 4. 1-4. 重複序列擴張............................................................................................ 6. 1-5. (CTG)n 重複序列之結構與熱力學穩定性.............................................. 8. 1-6. 研究動機.................................................................................................. 11. 第二章、 2-1. 2-2. 實驗...................................................................................................... 12 實驗技術.................................................................................................. 12. 2-1.1. 單分子實驗技術.......................................................................... 12. 2-1.2. 螢光共振能量轉移...................................................................... 14. 2-1.3. 全內反射螢光顯微鏡.................................................................. 16. 2-1.4. 實驗儀器架設.............................................................................. 17. 2-1.5. 電子放大式電荷耦合元件.......................................................... 19. 實驗樣品製備.......................................................................................... 20 2-2.1. 樣品槽製備.................................................................................. 20. 2-2.2. 樣品槽組裝.................................................................................. 22. 2-2.3. 實驗序列設計.............................................................................. 23 iv.

(6) 2-2.4. 螢光分子標記.............................................................................. 25. 2-2.5. DNA 黏合反應 ............................................................................ 26. 2-2.6. 分子間二聚體去除...................................................................... 27. 2-2.7. 固定樣品於樣品槽...................................................................... 28. 2-2.8. 光漂白與閃爍現象...................................................................... 29. 2-2.9. 影像緩衝溶液.............................................................................. 31. 2-2.10. 互補股序列之真實濃度計算...................................................... 32. 2-3. 實驗程式與數據分析.............................................................................. 33 2-3.1. 儀器控制...................................................................................... 33. 2-3.2. 數據分析...................................................................................... 35. 2-3.3. 擬合分析...................................................................................... 38. 第三章、. 結果...................................................................................................... 41. 3-1. 單分子實驗設計...................................................................................... 41. 3-2. 結構鑑定.................................................................................................. 42. 3-3. 長時間軌跡圖.......................................................................................... 46. 3-4. 轉換密度圖分析...................................................................................... 49. 3-5. 髮夾結構與環尺寸模擬.......................................................................... 50. 3-6. 互相關分析.............................................................................................. 53. 3-7. 狀態轉換之動力學.................................................................................. 54. 3-8. 狀態轉換之平衡常數.............................................................................. 57. 3-9. 改變狀態轉換之能量障礙...................................................................... 59. 3-10. 3-9.1. 髮夾末端修改.............................................................................. 59. 3-9.2. 近環端修改.................................................................................. 65. 互補股競爭實驗.................................................................................. 67 3-10.1. 實驗設計...................................................................................... 67. 3-10.2. 互補股競爭.................................................................................. 68 v.

(7) 3-10.3. 互補股競爭之動力學.................................................................. 69. 3-10.4. 有效速率常數.............................................................................. 71. 第四章、. 討論...................................................................................................... 74. 4-1. (CTG)n 結構............................................................................................ 74. 4-2. (CTG)n 穩定性........................................................................................ 75. 4-3. 奇數重複的 (CTG)n 之狀態轉換機制 .................................................. 77. 4-4. DNA 複製過程中的擴張機制 ............................................................... 83. 第五章、. 結論...................................................................................................... 84. 參考文獻...................................................................................................................... 85. vi.

(8) 圖目錄圖一、重複序列在特定基因位置所產生的疾病。.................................................. 1 圖二、RNA 形成 RNA 凝膠示意圖。 ................................................................... 3 圖三、典型的華生-克里克鹼基對與 T-T 錯誤配對。 .......................................... 5 圖四、二級結構示意圖。.......................................................................................... 5 圖五、複製過程所造成重複序列擴張與收縮。...................................................... 6 圖六、不平等交換重組過程所造成重複序列擴張與收縮。.................................. 7 圖七、複製過程中，所發生之重組現象造成的重複序列擴張。.......................... 7 圖八、Gupta 研究團隊以 NMR 方法解出的 (CTG)n 結構................................. 8 圖九、Lam 研究團隊以 NMR 所解出之偶數重複的 (CTG)n 結構。 ............... 9 圖十、Lam 研究團隊以 NMR 所解出之奇數重複的 (CTG)n 結構。 ............... 9 圖十一、以 DMS footpritng 解出之 (CTG)n 結構。 ......................................... 10 圖十二、單分子實驗技術示意圖。 ....................................................................... 13 圖十三、螢光共振能量轉移。 ............................................................................... 15 圖十四、TIRFM 裝置示意圖。 ............................................................................. 16 圖十五、光學零件架設示意圖。 ........................................................................... 18 圖十六、樣品槽製備步驟示意圖。 ....................................................................... 21 圖十七、樣品槽組裝示意圖。 ............................................................................... 22 圖十八、實驗序列設計。 ....................................................................................... 23 圖十九、Cy3 NHS ester 與 NH2C6 修飾之 DNA 的交聯反應。 ....................... 25 圖二十、黏合反應示意圖。 ................................................................................... 26 圖二十一、分子間二聚體去除示意圖。 ............................................................... 27 圖二十二、單分子實驗設計。 ............................................................................... 28 圖二十三、電子躍遷與放光過程示意圖與各過程所需時間。 ........................... 29 圖二十四、放光過程與光漂白機制示意圖。 ....................................................... 30 vii.

(9) 圖二十五、單分子實驗所使用的 Labview 程式之人機操作介面。 ................. 34 圖二十六、單分子實驗中，所圈選出的螢光分子對影像。 ............................... 35 圖二十七、經由 MatLab 程式計算後，所得的 EFRET。 .................................... 36 圖二十八、長時間軌跡圖。 ................................................................................... 37 圖二十九、HaMMy 程式介面。 ............................................................................ 38 圖三十、TDP 分析程式介面。 .............................................................................. 39 圖三十一、互相關函數分析圖。 ........................................................................... 40 圖三十二、單分子實驗設計 ................................................................................... 41 圖三十三、(CTG)4-15 的 EFRET。 ............................................................................ 42 圖三十四、輔助序列 (CTG)6T3 和 T3(CTG)6 的 EFRET 比較。 ........................ 43 圖三十五、輔助序列 (CTG)6T3 和 (CTG)7 的 EFRET 比較。 ........................... 43 圖三十六、較長的奇數重複的 (CTG)21-37 之 EFRET。 ........................................ 44 圖三十七、(CTG)25、(CTG)31 和 (CTG)37 的 EFRET 比較。 .............................. 45 圖三十八、偶數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖。 ........................................... 46 圖三十九、奇數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖。 ........................................... 47 圖四十、奇數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖中，具有極少數非預期的狀態變化。 ........................................................................................................... 48 圖四十一、奇數重複的 (CTG)n 之機率轉換密度圖 ........................................... 49 圖四十二、奇數重複的 (CTG)n 之兩個狀態分離結果與結構模擬。 ............... 50 圖四十三、模擬奇數重複的(CTG)n 髮夾結構，其不同環尺寸的輔助序列之 EFRET。................................................................................................. 51 圖四十四、模擬偶數重複的(CTG)n 髮夾結構之 EFRET`， .................................... 52 圖四十五、(CTG)13 的互相關分析圖。 ................................................................ 53 圖四十六、奇數重複的 (CTG)n 的兩個結構間互相轉換的行為。 ................... 54 圖四十七、重複次數為 15 以上的奇數重複序列，正、逆反應的動力學常數之倒數。.................................................................................................. 56 viii.

(10) 圖四十八、重複次數為 15 以上的奇數重複序列的平衡常數。 ....................... 58 圖四十九、CAG 修改位置示意圖 ......................................................................... 59 圖五十、mCAG 與 m4CAG 的 EFRET 。 ............................................................. 60 圖五十一、mCAG、m4CAG 與對照組的 EFRET 比較。 ..................................... 61 圖五十二、mCAG 與 m4CAG 的長時間軌跡圖。 ............................................. 62 圖五十三、mCAG 與 m4CAG 的轉換密度圖。 ................................................ 63 圖五十四、mCAG、m4CAG 與對照組的動力學常數之倒數 ............................. 64 圖五十五、CAG 修改於近環端示意圖。 ............................................................. 65 圖五十六、loop_mCAG 與對照組 (CTG)25 的 EFRET。 ..................................... 65 圖五十七、loop_mCAG 的長時間軌跡圖。 ......................................................... 66 圖五十八、互補股競爭實驗設計。 ....................................................................... 67 圖五十九、(CTG)8 進行互補股競爭實驗，隨時間變化的 EFRET。................... 68 圖六十、(CTG)8 進行不同濃度之互補股競爭實驗，隨時間變化的兩個 EFRET 比值。 ............................................................................................................. 70 圖六十一、(CTG)8 的有效速率常數之檢量線。 .................................................. 72 圖六十二、(CTG)5-8 的有效速率常數之檢量線。 ................................................ 72 圖六十三、偶數與奇數重複的 (CTG)n 之結構示意圖，和其環尺寸與 EFRET。 ................................................................................................................ 74 圖六十四、(CTG)n 的髮夾結構與互補股序列競爭的可能途徑示意圖。 .......... 75 圖六十五、正、逆反應 ln𝑘 與重複次數關係圖。 .............................................. 79 圖六十六、反應過程的化學勢能圖。 ................................................................... 80 圖六十七、正反應轉換機制示意圖。 ................................................................... 82 圖六十八、逆反應轉換機制示意圖。 ................................................................... 82 圖六十九、DNA 複製過程中的擴張示意圖。 ..................................................... 83. ix.

(11) 表目錄表一、三核苷酸於編碼區與非編碼區所導致之疾病。.......................................... 2 表二、單分子實驗所使用之 DNA。 ..................................................................... 24 表三、影像緩衝溶液配方。.................................................................................... 31 表四、互補股序列原液之真實濃度。.................................................................... 32 表五、重複次數為 15 以上的 (CTG)n，其正、逆反應之速率與誤差值。...... 55 表六、重複次數為 15 以上的 (CTG)n，其正、逆反應之平均滯留時間與誤差值。 ....................................................................................................................... 55 表七、重複次數為 15 以上的 (CTG)n，其狀態轉換之平衡常數與誤差值。.. 57 表八、mCAG、m4CAG 與對照組的動力學常數及平衡常數。 ......................... 64 表九、互補股競爭實驗所需配製的樣品之真實濃度。........................................ 69 表十、(CTG)n 的正反應速率。.............................................................................. 73 表十一、不同重複序列將髮夾結構全開的吉布斯自由能之變化量。 ............... 81. x.

(12) 第一章、. 緒論. 1-1 前言微衛星 (microsatellite) 序列，是以二至六個核苷酸 (nucleotide) 為單位重複排列的序列，也稱為簡單重複序列 (simple sequence repeats，SSRs) 或短串聯重複序列 (short tandem repeats，STRs)。重複序列在不同的個體間，具有. 高度多樣性與多變性，且廣泛地存在於真核生物 (Eukaryote) 的基因組中，其分佈包含編碼區 (coding region)、非編碼區 (non-coding region)、啟動子 (promotor) 和三端非轉譯區 ( 3’ untranslated region, 3’ UTR) 與五端非轉譯區 ( 5’ untranslated region, 5’ UTR)，並能夠遺傳至子代[1]。. 三核苷酸重複序列 (trinucleotide repeats, TNRs) 是一種特殊的微衛星序列，如圖一所示，主要原因是當某些三核苷酸重複序列存在於特定的基因位置，且長度超過一定值時，序列的不穩定性會增加，進而造成重複序列不斷擴張，可能會導致超過 20 種三核苷酸重複序列擴張疾病 (triplet repeat expansion disease, TREDs)，而這些疾病大多屬於神經退化性或神經肌肉失調遺傳疾病，且具有遺傳預測 (genetic anticipation) 的現象，當疾病遺傳至下一代時，將會有更長的重複序列，隨著重複序列更長，病情會更加嚴重且發病年齡更早[2-4]。. 圖一、重複序列在特定基因位置所產生的疾病。摘錄自參考資料[4]. 1.

(13) 其中 CTG/CAG 重複序列會產生至少 13 種的遺傳疾病，如表一所示，以 (CTG)n 為例，當 CTG 重複序列位在 JPH3 基因位置時，健康的人擁有 6-27 組重複序列，此基因能夠穩定的遺傳給子代，且此重複序列可在範圍內改變；若重複序列增加至 29-35 組時，稱為準突變 (pre-mutation)，其本身並無症狀，但 CTG 重複序列不穩定性將會增加，進一步造成子代的重複序列擴張；當重複序列長度超過 39 組時，即會造成類亨丁頓舞蹈症第二型 (Huntington disease like-2, HDL2)，在病人身上能夠發現其擁有數百，甚至數千組 CTG 重複序列，序列長度越長，發病年齡越早，且病情越嚴重。除 HDL2 之外，當 CTG 重複序列分別位在 DMPK 與 ATXN8OS 時，並且長度超過一定值時，會造成肌強直性型肌肉萎縮症後群第一型 (Myotonic Dystrophy type I, DM1) 與神經退化性脊髓小腦失調症第 8 型 (Spinocerebellar ataxia type 8, SCA8) [2,4]。. 表一、部分三核苷酸於編碼區與非編碼區所導致之疾病。摘錄自參考資料 [2]。. 2.

(14) 1-2 致病原因 DNA 經過轉錄 (transcription) 之後，會形成 RNA，並與 RNA 結合蛋白 (RNA binding protein) 結合，再通過液體 -液體相分離 (liquid-liquid phase-separate) 或溶膠-凝膠轉化 (sol-gel transition)，形成各種核糖核酸蛋白顆粒 (ribonucleoporotein partical, RNP)，其在正常情況下，具有相當重要的功能[5]。如圖二所示，導致疾病的特定重複序列除了本身會形成分子內的非典型結構外，也可在沒有蛋白質幫助下，產生分子間的多共價鍵鹼基對 (multivalent base-pairing)，且當重複次數越高時，越容易產生分子間鹼基對。此時原本為溶液態的 RNA 會逐漸聚集成球狀，並轉變為凝膠態 (RNA gels)，與液相分離，形成 RNP，且存在於細胞中，即為 RNA foci。在正常的細胞當中，RNA 可以自由通過細胞核與細胞質間的運輸通道，但當重複序列的重複次數過多時，會形成過多的 RNA foci，其與 RNA 結合蛋白間會產生異常的 RNA-蛋白質作用力，因此對細胞產生毒性，使其破壞細胞質的運輸 [5]。. 圖二、RNA 形成 RNA 凝膠示意圖。摘錄自參考資料[5]。. 3.

(15) 1-3 非典型二級結構核苷酸的種類有四種，包含腺嘌呤 (adenine, A)、胸腺嘧啶 (thymine, T)、胞嘧啶 (cytosine, C) 和鳥嘌呤 (guanine, G)，如圖三所示，核苷酸間會配對成典型 (canonical) 的華生-克里克鹼基對 (Watson-Crick base pair)，包括以兩組與三組氫鍵配對的 A-T 與 C-G 鹼基對，此外也可能配對成非典型 (non-canonical) 的鹼基錯誤配對 (mismatch base pair)。. 因此造成許多的重複序列本身會形成不同的非典型二級結構 (non-canonical secondary structure)，如圖四所示，單股 (CNG)n (N = A, T, C, G) 重複序列會以典型的華生-克里克鹼基對與錯誤配對形成髮夾 (hairpin) 結構，以 CTG 重複序列為例，其會以典型的 C-G 鹼基對與 T-T 錯誤配對折疊成髮夾結構；富含鳥嘌呤的重複序列會形成 G-四股結構；由嘌呤-嘧啶組合的 (GAA)n：(TTC)n 可形成三股的 H-DNA 和 stick-DNA；富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的 (ATTCT)n：(AGAAT)n 的重複序列會形成解旋 (unwinding) 結構。這些穩定的非典型結構可能會使重複序列產生雙股斷裂 (double strand breaks, DSBs)、缺口 (nick) 和間隙 (gap)，使其不穩定性增加，進而被認為是導致 DNA 擴張的主要因素[4]。. 4.

(16) 圖三、典型的華生-克里克鹼基對與 T-T 錯誤配對。. 圖四、二級結構示意圖。(a) 髮夾結構、(b) G-四股結構、(c) 雙股 DNA 之髮夾結構、 (d) 三股結構、(e) 解旋結構。摘錄自參考資料[4]。. 5.

(17) 1-4 重複序列擴張造成重複序列擴張的原因並未完全清楚，但最為廣泛接受的原因是在複製 (replication)、修復 (repair) 或重組 (recombination) 的過程發生滑動 (slippage) 所造成，早期認為部分片段於雙股外形成環狀結構，使得下次複製時重複序列擴張[4,6]，但此理論並無法解釋單股 DNA 的折疊門檻以及重複序列僅有部分會產生擴張。隨著特定重複序列的結構逐一被解出，發現其本身容易形成較穩定的非典型結構，造成重複序列不穩定而滑動，因此導致重複序列的擴張[4]。以複製過程為例，如圖五所示，DNA 聚合酶 (polymerase) 在領先股 (leading strand) 是連續合成，而在延遲股 (lagging strand) 上是不連續的，會先合成出許多段的岡崎片段 (Okazaki fragment)，最後再由聚合酶將其黏合，導致新生股生成速率不同。首先雙股 DNA 會先形成複製叉 (replication fork)，若二級結構在延遲股的模板鏈上的岡崎啟動區域 (Okazaki initial zone) 形成，聚合酶進行合成會受到阻礙，並跳過異常結構的合成，且留下間隙，再經由其他蛋白質修復此間隙，而作為模板的二級結構較原本的重複序列短，導致重複序列縮短；若是二級結構在領先股的新生鏈上因為滑動而形成，並造成複製過程將會中斷，使新生鏈無法與模板鏈配對，而當複製過程重新啟動時，將合成出多餘的序列，進而使重複序列擴張[4]。. 圖五、複製過程所造成重複序列擴張與收縮。球為聚合酶、紅線為重複序列、綠線為重複序列之互補股、粉紅線為岡綺片段之引子。摘錄自參考資料[4]。. 6.

(18) 如圖六所示，除了複製過程造成重複序列擴張以外，重組過程也有可能造成擴張，但重組過程並非單純的滑動現象，而是兩條雙股 DNA 以不平等交換重組 (unequal crossing over recombination) 來產生重複序列擴張 [4]。. 圖六、不平等交換重組過程所造成重複序列擴張與收縮。藍、灰線為同源染色體，紅、綠線為重複序列與其互補股。摘錄自參考資料[4]。. 另外，在複製過程也可能會發生重組，在延遲股模板鏈上的重複序列折疊成二級結構時，會阻礙複製叉，容易造成雙股斷裂，因而促使重組反應發生。首先將延遲股模板鏈上的重複序列切除，形成 3’ 單股 DNA，再侵入同源序列的前進股，並進行重組反應，導致重複序列擴張或縮短[4]。. 圖七、複製過程中，所發生之重組現象造成的重複序列擴張。紅線為重複序列，綠線為重複序列之互補股。摘錄自參考資料[4]。. 7.

(19) 1-5 (CTG)n 重複序列之結構與熱力學穩定性 (CTG)n 會以本身的 C-G 配對與 T-T 錯誤配對形成髮夾狀二級結構 [4]，髮夾結構的折疊方式會與重複次數是奇數或偶數有關。1996 年，Gupta 研究團隊以核磁共振光譜學 (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 的方法解出 (CTG)5 與 (CTG)6 的結構[6]，如圖八所示，其分別會以三個與四個核苷酸形成環狀結構，並且折疊成兩端反平行 (anti-parallel) 配對結合的髮夾結構。. 圖八、Gupta 研究團隊以 NMR 方法解出的 (CTG)n 結構。(A) (CTG)5 ；(B) (CTG)6。摘錄自參考資料[6]。. 8.

(20) 2005 年，Lam 研究團隊同樣以 NMR 的方法，解出更多不同重複次數的 (CTG)n 之結構[7]，如圖九所示，偶數重複的 (CTG)n 具有兩種構型，皆以四個核苷酸形成環 (loop)，並以兩端對齊的方式折疊成髮夾結構 (blunt-end hairpin structure)，兩者差別在於其 T-T 錯誤配對靠近與否；如圖十所示，奇數重複的 (CTG)n 同樣具有兩種構型，第一種與偶數重複的 (CTG)n 類似，但是以三個核苷酸形成環的兩端對齊髮夾結構；而另一種則是以四個核苷酸形成環的髮夾結構，但會額外突出一組 CTG 不參與髮夾結構的折疊 (single-repeat overhang hairpin structure)。. 圖九、Lam 研究團隊以 NMR 所解出之偶數重複的 (CTG)n 結構。摘錄自參考資料[7]。. 圖十、Lam 研究團隊以 NMR 所解出之奇數重複的 (CTG)n 結構。摘錄自參考資料[7]。. 9.

(21) 2011 年，Delaney 研究團隊以熱力學穩定性測定與硫酸二甲酯足跡法 (dimethyl sulfate footprinting) 得到 (CTG)n 的結構資訊[8]，如圖十一所示，偶數與奇數重複的 (CTG)n 構型皆以四個核苷酸形成環，偶數重複的 (CTG)n 會形成兩端對齊髮夾結構，其熱力學穩定性較高；奇數重複的 (CTG)n 則折疊成單組突出的髮夾結構，且 3’ 或 5’ 皆可以是未參與鍵結的 CTG 突出端，並同時並存於髮夾結構當中，其在互補股存在下的熱力學穩定性較偶數重複的 (CTG)n 低。. 圖十一、以 DMS footpritng 解出之 (CTG)n 結構。(A) 以 (CTG)10 為例，偶數重複的 (CTG)n 結構；(B) 以 (CTG)11 為例，奇數重複的 (CTG)n 結構。摘錄自參考資料[8]。. 此外，在他們的熱力學穩定性實驗當中，當重複序列的長度越長時，偶數與奇數重複的 (CTG)n 熱力學穩定性皆會提高，但兩者之間的穩定性差距會隨著重複序列的長度增加而有減少的趨勢[8]，所以他們不否認前述 NMR 研究所提出的兩端對齊髮夾結構有同時存在的可能[6-7]，且不排除奇數重複的 (CTG)n 可能存在另一種以七個核苷酸為環的兩端對齊髮夾結構[8]。. 10.

(22) 1-6 研究動機目前因為重複序列擴張所造成的遺傳性疾病並沒有有效的治療方法，且造成擴張的原因也尚未明確[4]，為了更了解重複序列擴張的機制，我們選擇了佔了多數疾病的重複序列 (CTG)n 來進行研究。文獻指出，由於偶數與奇數重複的 (CTG)n 間具有不同的結構，且奇數重複的 (CTG)n 可能同時具有兩種構型上的平衡[6-8]，這有可能是造成重複序列擴張的因素，而前述兩個研究團隊所使用傳統巨大觀的方法，並無法即時觀察到 (CTG)n 中所存在之構型變化。. 此外，Delaney 研究團隊也蒐集了亨丁頓舞蹈症患者的臨床資料，觀察其所擁有的重複序列是否因此造成擴張，但臨床資料顯示患者的重複序列並沒有明顯傾向於奇數或偶數。除了患者本身的重複序列擴張以外，也觀察了患者後代所擁有的重複序列，結果顯示其本身的重複序列也與無論奇數或偶數無關，且無論親代的重複序列為奇數或偶數，子代的重複序列都會比親代的重複序列更長。與先前實驗當中，兩端對齊 (偶數重複的 (CTG)n) 之髮夾結構比起具有突出端者，更容易被延長的結果並不相符[8]。. 在本論文中，我們利用單分子螢光共振能量轉移光譜，對於不同長度的 (CTG)n 序列進行系統性的研究，並進行結構動力與動態學分析，期望能藉由單分子光譜在動態平衡系統上的優勢解答上述的問題，並建立結構轉換的模型。. 11.

(23) 第二章、. 實驗. 實驗技術. 2-1 2-1.1. 單分子實驗技術單分子實驗技術 (single-molecule experiment techniques) 近年來發展快. 速，目前在包含物理學、生物學與化學中的不同領域具有相當多的應用。其中對於生物物理學的研究，具有相當大的貢獻[9]。. 過去在研究生物分子系統時，傳統的巨觀研究方法，所得結果為所有分子的平均性質，若生物分子具有個體變異性 (heterogeneity)，或具有動態改變的性質，此時這些資訊會在平均過程中被除去，而近年發展的單分子實驗技術，能透過直接觀察與分析每一個分子個別的行為，避免平均所造成的影響，可獲得結構、動力學、動態學 (dynamics) 等資訊[9]。. 如圖十二所示，單分子實驗技術可分為兩個類型，其一是利用施力操控分子，藉由在目標分子末端修飾球體，並對此球施力，以達到操作目標分子的目的。依照不同球體或方法能夠分為利用磁力操控磁球的磁鉗 (magnetic tweezers)、利用雷射操控聚合球的光鉗 (optical tweezers)、微流道拉伸 (flow stretch) 和原子力顯微鏡 (atomic force microscopy, AFM) 等[9]。另一類型則為單分子螢光光譜，藉由觀察目標上的螢光分子來得知每個目標分子的行為，按照激發的三維空間，可分為全內反射式螢光 (total internal reflection fluorescence, TIRF)、共軛焦 (confocal) 與廣視場 (wide-field) 顯微鏡等[9]。其中全內反射式螢光顯微鏡因其所產生的背景雜訊較低，相當適合配合螢光共振能量轉移的方法來觀察分子動態學。. 12.

(24) 圖十二、單分子實驗技術示意圖。(A) 原子力顯微鏡；(B) 光鉗；(C) 磁鉗；(D) 單分子螢光光譜。摘錄自參考資料[9]。. 13.

(25) 2-1.2. 螢光共振能量轉移螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)，為螢. 光分子間利用非放光過程進行能量轉移的機制[10]。在此系統中存在供體 (donor) 與受體 (acceptor) 兩種螢光分子，供體被能量激發至激發態後，會以放光的形式回到基態。若同時存在一受體分子，且滿足以下三個條件，此時激發態的供體將藉由偶極-偶極作用 (dipole-dipole interaction) 將能量轉移給受體，使之躍遷至激發態，隨後經由發出螢光返回其基態。. 1.. 吸收光譜與供體的放光光譜重疊. 2.. 與供體間距離小於 10 nm. 3.. 受體與供體的偶極矩向量夾角非垂直. 若兩個螢光分子可自由轉動，其相對偶極矩，則是隨機分布平均值，螢光共振能量轉移效率 (EFRET) 之關係式定義如下式 (1)：. 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 =. 𝐼𝐴𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 𝑅 6 = [1 + ( ) ]−1 𝐼𝐷𝑜𝑛𝑜𝑟 + 𝐼𝐴𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 𝑅0. (1). 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 為螢光共振能量轉移之效率，𝐼𝐴𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 為受體放光強度，𝐼𝐷𝑜𝑛𝑜𝑟 為供體放光強度，𝑅 為兩螢光分子間距離，𝑅0 定義為產生 50% 的能量轉移效率時，兩螢光分子間的距離，為供體與受體配對之特徵參數。. 當螢光分子間距離越靠近時，𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 越高，反之，距離越遠則 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 越低。而 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 與距離的關係如圖十三所示，在距離約 3-7 nm 具有較高的距離靈敏度。. 14.

(26) 圖十三、螢光共振能量轉移。(A) 能量轉移效率與距離關係圖；(B) 能量轉移與偶極矩關係。摘錄自參考資料[10]。. 15.

(27) 2-1.3. 全內反射螢光顯微鏡全內反射螢光顯微鏡 (total internal reflection fluorescence microscopy,. TIRF-M) 可分為兩種，如圖十四所示、物鏡型 (objective-type) 與稜鏡型 (prism-type)，而實驗室所使用的系統為稜鏡型全內反射顯微鏡。. 當光經由高折射率之高密度介質進入低折射率之低密度介質時，若入射角大於臨界角 (critical angle, 𝜃𝑐 )，則會產生全內反射 (total internal reflection) 現象，並於低密度介質的全反射交界處產生漸逝場 (evanescent field)，穿透深度約為 100 nm，而漸逝場的強度隨深度呈指數衰減，所以只有極靠近全反射面的螢光分子才會被激發，大幅降低背景雜訊的干擾，可達成單分子螢光偵測所需之訊躁比 (signal-to-noise ratio)。. 圖十四、TIRFM 裝置示意圖。(a) 稜鏡型；(b) 物鏡型。. 16.

(28) 2-1.4. 實驗儀器架設實驗室使用倒立式光學顯微鏡 (inverted microscopy, Nikon Eclipse Ti-S). 建立稜鏡型全內反射顯微鏡；激發光源使用波長 532 nm 與 638 nm 雷射光源，以配合供體 (Cy3) 與受體 (Cy5) 的激發波長；由於考慮到樣品槽厚度，必須使用長工作距離水浸潤物鏡 (long working distance water immersion objective, Nikon CFI Plan Apo VC 60XWI)；而偵測器則是使用電子放大式電荷耦合元件 (Electron Multiple Charge-coupled Device, EMCCD, Andor iXon Ultra 897)。. 如圖十五所示，532 nm 雷射會以電子快門 (shutter) 切換開關，而 638 nm 雷射則以電子訊號進行開關。兩道雷射首先皆會通過調整光偏振方向的半波片 (Half-wave plate)，並經由偏振分光鏡. (polarization beam splitter)，. 能使 P 偏振光完全通過，而 S 偏振光以 90 度角反射，藉由轉動半波片，以控制激發光強度，兩道雷射在偏振分光鏡結合後，再將光導至架設在 XYZ 控制平台 (XYZ positioning stage) 的聚焦透鏡 (focusing lens) ，利用 XYZ 控制平台調整激發光入射角度進入稜鏡 (prism) 使其折射，以在水與玻片的交界處產生全反射現象，並且利用漸逝場激發樣品。當樣品被激發後所放出螢光，通過物鏡收集後，且利用濾光片 (filter) 過濾激發光，再經由顯微鏡內部的光學元件，將其投射至顯微鏡側面之主要影像平面 (primary image plane)。. 為了同時觀察供體與受體的螢光訊號，須在顯微鏡後架設雙視 (dual-view) 光學元件。先藉由置於顯微鏡出口主要影像平面處的狹縫將螢光影像裁切為長條形，再通過第一個消色差透鏡 (achromat, f =100 mm)，將影像向後投射，接著利用雙色鏡 (dichroic mirror) 使兩道不同波長的光通過 (> 650 nm) 或以 45 度角反射 (< 650 nm)，而通過的光再經由平面鏡反射， 17.

(29) 兩道光以小夾角同時通過另一消色差凸透鏡 (f = 250 mm)，最終將影像會聚在位於焦面 (focal plane) 的影像偵測器上，而兩個不同波長的影像可藉由調整前述雙色鏡與反射鏡，使之水平並列，立於同時觀察此二頻道的影像。. 圖十五、光學零件架設示意圖。. 18.

(30) 2-1.5. 電子放大式電荷耦合元件電子放大式電荷耦合元件的運作原理是基於電荷耦合元件. (charge-coupled device, CCD)，是一種積體電路，具有許多排列整齊的感光元件，當感光元件感應到後，會產生電荷，電荷數量會與入射光強度成正比，接著電荷會移動至電容中，經由讀出暫存器讀取並儲存，最後再由倍增暫存器將電荷轉移並使電子放大數倍，而 EMCCD 與其最大的不同在於倍增暫存器之後，被放大的電子再經由低雜訊的讀出倍增器放大並轉換成電壓輸出，以產生影像。. 由於 EMCCD 本身擁有致冷器，可將感測晶片降溫至 -70 度以下，因此有效降低暗電流的產生，增加訊躁比，且能夠選擇讀出訊號的所需倍增的區段，在有背景訊號的情況下有效提升動態範圍 (dynamic range)，特別適合應用於單分子螢光實驗上。. 19.

(31) 實驗樣品製備. 2-2 2-2.1. 樣品槽製備取 25 mm*76 mm 的石英載玻片，於寬邊各鑽四個洞 (∅ = 0.75 mm)，. 再以熱水浸泡、丙酮擦拭、超純水洗淨後，放入染色壺中；另取 24mm*40mm 蓋玻片以超純水洗淨，並放入另一個染色壺中。接著依以下步驟 (圖十六)： 1.. 使用丙酮淹沒玻片，以超音波震盪半小時後，以超純水洗淨。. 2.. 使用 3M 氫氧化鉀淹沒玻片，以超音波震盪半小時後，以超純水沖淨。. 3.. 使用氮氣吹乾玻片，載玻片以火燒兩分鐘，蓋玻片則使用電漿清洗機 (Harrick Plasma, PDC32G1051059)，以空氣電漿清洗五分鐘。. 另取兩個玻璃染色壺作為反應容器。按照以下步驟： 1.. 裝滿氫氧化鉀，超音波震盪 30 分鐘，以超純水洗淨容器。. 2.. 裝滿甲醇，超音波震盪 30 分鐘，用甲醇潤洗容器，以氮氣吹乾。. 3.. 將處理過之載、蓋玻片放入反應容器中。. 4.. 取. 100ml 甲醇、 5ml 醋酸、 1ml 三甲氧矽丙基乙二胺. (N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylwnwdiamine, aminosilane) 配製成反應溶液，其功能為與玻片產生鍵結。 5.. 使用反應溶液淹沒玻片，靜置 10 分鐘，以超音波震盪 1 分鐘，再靜置 10 分鐘。. 6.. 以超純水洗淨載、蓋玻片，並以氮氣吹乾。. 7.. 取 [ 玻片數 +0.5]*16 mg 聚二乙醇 (mPEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) 、 [ 玻片數 +0.5]*0.3 mg 生物素修飾之聚二乙醇 (biotin-PEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) 與[玻片數+0.5]*64 μL 的 0.1 M 碳酸氫鈉配製為 PEG 溶液，混合均勻後以冷凍離心機離心，其功能為與修飾 aminosilane 的玻片產生鍵結。. 8.. 將 PEG 溶液上清液 70 μL 放在載玻片兩邊小洞間，覆蓋蓋玻片， 20.

(32) 靜置 4 小時。 9.. 以超純水洗淨，氮氣吹乾，裝入蓋子打孔的 50 ml 離心管內，再放入真空包裝中抽真空，最後保存至 -20℃ 冰箱。. 圖十六、樣品槽製備步驟示意圖。. 21.

(33) 2-2.2. 樣品槽組裝實驗前將載、蓋玻片之真空包裝取出，並回到室溫後取出，按照以下步. 驟 (圖十七)： 1.. 載玻片之聚乙二醇面朝上，將兩個小洞作為迴流通道，共四個，並以雙面膠間隔。. 2.. 以蓋玻片之聚乙二醇面覆蓋於通道上方。. 3.. 以環氧樹脂密合通道末端，移至暗處等待環氧樹脂凝固即可使用。. 圖十七、樣品槽組裝示意圖。. 22.

(34) 2-2.3. 實驗序列設計序列的設計可分為主、副序列。如圖十八所示，主序列由能夠修飾作為. 受體的螢光分子 Cy3 的氨基 NH2C6、目標序列與副序列互補股所組成；而副序列功用為將主序列固定於玻片上，由能夠與主序列形成雙股的 18 個核苷酸序列、作為供體的螢光分子 Cy5 與生物素 (biotin) 組成。由於主、副序列形成穩定的雙股，所以不影響目標序列的行為。. 圖十八、實驗序列設計。. 本實驗所使用的序列，如表二所示，包含觀察的目標為重複次數 5-37 的(CTG)n 重複序列，與用來模擬折疊的輔助序列和動力學實驗之互補序列。序列名稱. 5' 修飾. 序列 – 3' 修飾. (CTG)4 (CTG)5. NH2C6 NH2C6. (CTG)4 GCCTCGCTGCCGTCGCCA (CTG)5 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)6. NH2C6. (CTG)6 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)7. NH2C6. (CTG)7 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)8. NH2C6. (CTG)8 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)9. NH2C6. (CTG)9 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)10. NH2C6. (CTG)10 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)11. NH2C6. (CTG)11 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)12. NH2C6. (CTG)12 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)13. NH2C6. (CTG)13 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)14. NH2C6. (CTG)14 GCCTCGCTGCCGTCGCCA 23.

(35) 序列名稱. 5' 修飾. 序列 – 3’ 修飾. (CTG)15. NH2C6. (CTG)15 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)18. NH2C6. (CTG)18 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)21. NH2C6. (CTG)21 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)22. NH2C6. (CTG)22 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)27. NH2C6. (CTG)27 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)29. NH2C6. (CTG)29 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)31. NH2C6. (CTG)31 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)33. NH2C6. (CTG)33 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)35. NH2C6. (CTG)35 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)37. NH2C6. (CTG)37 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)6T3. NH2C6. (CTG)6T3 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. T3(CTG)6. NH2C6. T3(CTG)6 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. (CTG)2CT4G(CT G)2 (CTG)2CT4G(CT G)3 (CTG)3T3(CTG)3. NH2C6. mCAG. NH2C6. (CTG)2CT4G(CTG)2GCCTCGCTGCCGTCGC CA (CTG)2CT4G(CTG)3GCCTCGCTGCCGTCGC CA (CTG)3TTT(CTG)3GCCTCGCTGCCGTCGCC A CAG(CTG)24 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. m4CAG. NH2C6. (CAG(CTG)2)4(CTG)13GCCTCGCTGCCGTC. NH2C6 NH2C6. (CAG)5. GCCA (CTG)11CAG(CTG)13GCCTCGCTGCCGTCG CCA (CAG)5. (CAG)6. (CAG)6. (CAG)7. (CAG)7. (CAG)8. (CAG)8. 副序列. TGG CGA CGG CA /iCy5/ G CGA GGC – biotin. mloop. NH2C6. 表二、單分子實驗所使用之 DNA。紅色標記為 3 ‘ 修飾. 24.

(36) 2-2.4. 螢光分子標記生物分子的螢光標記較常使用氨基的交聯反應 (cross-linking reaction)，. 反應式如圖十九所示，藉由將主序列 5’ 第一個核苷酸修飾以六個碳為距離的氨基 (NH2C6)，氨基能夠與 Cy3 NHS ester 產生反應，而使 Cy3 標記到目標序列上，此時 Cy3 僅以一個碳鍵結，距離主序列約 2 nm，能夠遠離主序列的單雙股交接處，並不影響目標序列的行為，且由於螢光分子是由六個碳的單鏈連接，因此螢光分子可以自由轉動，所以可假設 Cy3 與 Cy5 間的偶極距的相對位置為隨機分布，EFRET 仍然只受距離影響。修飾螢光分子按照以下步驟： 1.. 配製 Cy3 溶液。0.2 mg. Cy3 NHS ester (sulfo-Cyanine3 NHS ester,. Lumiprobe) 加入 35μL、0.1M、pH = 8.6 的四硼酸鈉 (sodium tetraborate decahydrate, SIGMA-ALDRICH)。 2.. 將氨基修飾的主序列 (Protech, Taiwan) 加入 Cy3 溶液，室溫下慢速震盪 12 小時。. 3.. 依序加入 3.5 μL、3M NaCl 與 -20℃、87.5 μL、99.5% 乙醇，靜置半小時，再以 4℃、11200rpm 下高速離心半小時。. 4.. 去除上清液，再次加入-20℃、99.5%乙醇，同樣依序靜置與高速離心半小時。. 5.. 去除上清液，以氮氣吹乾，再以超純水回溶至所需濃度。. 圖十九、Cy3 NHS ester 與 NH2C6 修飾之 DNA 的交聯反應。. 25.

(37) 2-2.5. DNA 黏合反應螢光分子修飾完成後，必須先與具有生物素標記的副序列黏合。如圖二. 十所示，當 DNA 溫度超過熔點 (melting point, Tm) 時，其構型會被完全打開，此時將溫度以緩慢降溫 (annealing) 的方式，DNA 將會形成最穩定的構型，以達成主、副序列黏合。而由此方法進行製備的 DNA 樣品，在高濃度下有部分分子會形成分子間二聚體 (dimer)，之後會再以其他方法去除。依照以下步驟進行黏合反應： 1.. 取 1 μL、100 μM 副序列，3 μL 主序列與 16 μL T100 buffer (含有 100 mM NaCl 與 1 M Tris buffer, pH ~ 7.8) 配置成樣品原液。由於必須與副序列的黏合後才能固定於玻片上，所以此時樣品濃度為 5 μM，未黏合的過量主序列置換溶液時，將會被沖出，因此並不影響實驗的觀察。. 2.. 使用溫度梯度熱循環反應儀 (Thermal cycler, Bio-Rad, T100 Thermal Cyder)，加熱至 95 度並維持 5 分鐘，再以每分鐘降 1 度的速率降至 22℃，主、副序列將會形成其最穩定的結構，即雙股黏合，此為 DNA 樣品原液。. 圖二十、黏合反應示意圖。. 26.

(38) 2-2.6. 分子間二聚體去除欲去除分子間二聚體，必須將樣品配製至低濃度後，加熱至能使分子間. 二聚體解開，但不至於將雙股解開的溫度，再以 annealing 的方式回到室溫，如圖二十一所示。按照以下步驟： 1.. 取 0.2 μL、10 nM 樣品原液，2 μL、20μg/μL 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA)，197.8 μL T100 buffer 配製成 10 pM 樣品溶液。. 2.. 使用溫度梯度熱循環反應儀，加熱至 50 度並維持 5 分鐘，再以每 4 分鐘降 1 度的速率降至 22℃。由於此時 DNA 濃度相當低，其在溶液中相當分散，因此不容易再次形成分子間二聚體，即可達到去除的目的。. 圖二十一、分子間二聚體去除示意圖。. 27.

(39) 2-2.7. 固定樣品於樣品槽主、副序列黏合反應完成後，利用抗生物素醣蛋白 (NeutrAvidin, Thermo. Fisher Scientific Inc.) 能夠與至多四個生物素結合的特性，同時將玻片與副序列上的生物素結合，進而將樣品固定於玻片上。將以控制樣品濃度與反應時間，以進行單分子實驗的觀察。按照以下步驟： 1.. 注入 0.2 μg/μL NeutrAvidin 至樣品通道中，靜置兩分鐘。置換成 T100 buffer。. 2.. 注入去除分子間二聚體的樣品溶液至樣品通道中，靜置兩分鐘。置換成 T100 buffer，即完成固定樣品於樣品槽，如圖二十二所示。. 圖二十二、單分子實驗設計。摘錄自參考資料[13]。. 28.

(40) 2-2.8. 光漂白與閃爍現象如圖二十三所示，螢光分子被激發至激發單重態 (excited singlet state)，. 電子會先由振動鬆馳 (vibrational relaxation) 到第一激發單重態 (S1) 的最低能階，再經由不同途徑釋放能量並回到基態，而利用放光的方式稱為螢光 (fluorescence)，其過程僅有 10-7~10-9 秒，此時視為亮態。放出螢光前，電子若經過系統間跨越 (intersystem crossing) 過程，跨越至較低能量且擁有不同自旋的激發三重態 (excited triplet state, T1)後，若以放光的方式回到基態，稱為磷光 (phosphorescence)，由於放出磷光的選擇律 (selection rule) 是被禁止的，所以此過程需要相當長的時間，約 10-3 – 102 秒，因此其單位時間可被偵測的光子量相當低，此時將其視為暗態 (dark state)。電子的亮、暗態轉換過程，在實驗中即會觀察到螢光分子產生閃爍 (blinking) 現象，其解決方法在溶液中加入三重態淬熄劑 (triplet quencher)，即可降低閃爍現象發生的頻率[14]。. 圖二十三、電子躍遷與放光過程示意圖與各過程所需時間。摘錄自參考資料[10]。. 29.

(41) 如圖二十四所示，在單分子螢光實驗中，必須使用雷射激發螢光分子，而在高強度的雷射長時間照射下，溶液中的氧氣會形成具活性氧的單重態 (singlet oxygen)，並與激發後的螢光分子產生反應，造成螢光分子無法再放光，此種現象稱為光漂白 (photobleaching) 現象[10]。解決光漂白現象的方法有許多中，通常利用控制激發光強度與照射時間或更換結構較強的螢光分子來減緩發生光漂白的速率，而在此實驗中則是在溶液中加入除氧系統，以除去氧氣，避免其產生活性氧而破壞螢光團。. 圖二十四、放光過程與光漂白機制示意圖。摘錄自參考資料[10]. 30.

(42) 2-2.9. 影像緩衝溶液為了減少實驗中的干擾，需配製含有除氧系統與三重態淬熄劑的影像緩. 衝溶液，減緩光漂白與閃爍現象的發生，如表三所示。. 除氧系統是利用吡喃糖氧化酶 (pyranose oxidase, P2Ox, Sigma-Aldrich) 使葡萄糖與溶液中的一莫耳氧氣進行反應，生成過氧化氫與半莫耳的氧氣，再利用過氧化氫酶 (catalase, Sigma-Aldrich) 使其生成水，以除去溶液中的氧氣。. 三重態淬熄劑則是使用水溶性維生素 E (Trolox, Sigma-Aldrich)，將其溶解於對螢光分子與生物分子較穩定，且酸鹼值與生理條件 (pH = 7.7 - 7.9) 相仿的緩衝溶液 Tris buffer。再經由紫外光照射並與氧氣反應，生成 Trolox quinone，即為三重態淬熄劑[14]。. 藥品名. 原液濃度. 加入體積 (µL). Trolox. 3 mM. 50. Glucose. wt = 25%. 2. Catalase. 108000 U/µL. 1. P 2 Ox. 0.135 unit/µL. 2. NaCl. 1M. 10. ddH2O. 35. 表三、影像緩衝溶液配方。. 31.

(43) 2-2.10. 互補股序列之真實濃度計算進行互補股序列競爭實驗時，為了計算其動力學常數，必須先計算互補. 序列 (CAG)n 的濃度。首先使用微量分光光度計 (NanoPhotometer, IMPLEN GMBH NanoPhotometer NP80 Tough) 測量核苷酸之吸光值 (absorbance, A)，其單位是光密度 (optical density, OD)。核苷酸的吸光值主要是在波長 230 nm、260 nm 和 280 nm 。其中 230 nm 的吸收值是由有機鹽類貢獻、260 nm 是核苷酸所貢獻、280 nm 則是由蛋白質貢獻。而 A260/280 的比值可估算核苷酸純度；A260/230 的比值則可確認樣品中是否有有機鹽類汙染。因此須選擇波長為 260 nm 的吸光值 (OD260)，才能計算其真實濃度，並且使用線上計算軟體 (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)，根據下式 (2) 計算:. 𝑂𝐷 =. 𝐴 1 𝐼 = (−log ) = α × c 𝐿 𝐿 𝐼0. (2). A 為吸光度；L 為光徑長度；I 為樣品吸收後的光強度；I0 為入射光的強度，α 為吸收係數，c 為樣品濃度。表四即為計算後互補股序列的真實濃度互補股序列. M.W. (µg/µmole) OD260. Real Concentration (µM). (CAG)5. 4596.06. 26.92. 165.616. (CAG)6. 5527.67. 27.85. 149.932. (CAG)7. 6459.27. 47.11. 196.314. (CAG)8. 7390.87. 40.42. 152.62. 表四、互補股序列原液之真實濃度。. 32.

(44) 2-3. 實驗程式與數據分析. 2-3.1. 儀器控制實驗儀器的控制是以自己編寫的 Labview (Laboratory Virtual. Instrument Engineering Workbench, National instruments) 程式，來操控雷射與電子放大式電荷耦合器，並記錄其所偵測的訊號。. 儀器控制的流程分為雷射與偵測器兩部分。雷射部分是由電腦以數位的方式輸出電壓，並搭配資料擷取介面卡 (DAQ, National instruments)，做為電腦與外部硬體，雷射和電子快門之間的溝通橋樑，以控制其開關。偵測器部分則直接以電腦與其溝通。首先必須初始化偵測器，設定讀出影像為實驗所需之解析度 (image resolution)，再開啟冷卻器 (cooler)，降低並監控晶片溫度，待溫度穩定之後，設定實驗相關條件，包含曝光時間 (exposure time)、電子放大模式與放大倍率 (gain)，即可開始偵測影像。. 如圖二十五所示，實驗在晶片溫度為攝氏 -70 度下進行，以減少暗電流的產生。影像的解析度為 512x512，並利用光路將偵測影像分為螢光分子供體與受體兩窗格同時偵測。偵測條件為每幀 (frame) 30 毫秒的曝光時間，但由於曝光時間是每個影像所偵測的時間，不包含影像間的快門時間，因此每幀的實際時間為 30.175 毫秒。影像讀出訊號以訊號最小值作為背景雜訊，並且將扣除背景雜訊之訊號放大 200 倍，以增加訊雜比。影像的觀測以橫軸 256 的位置作為影像的分界，每個圓點為單分子螢光訊號，左邊是螢光分子供體的訊號，而在其鏡像的相對位置上可觀察到受體的訊號，即為螢光分子對。在數據上數據的儲存可分為兩種，皆會將訊號轉成 2 維陣列 (2D array)，並以 8 位元 (8-bit) 的形式儲存成一錄影檔，第一種為短時間錄影，是每個錄影檔含有三十幀，前二十幀為綠光激發樣品之訊號，後十幀為以紅 33.

(45) 光雷射激發樣品之訊號，並至少錄製 20 個錄影檔；第二種則為長時間錄影，以綠光雷射激發樣品，並錄製至少 3000 偵的影像。. 圖二十五、單分子實驗所使用的 Labview 程式之人機操作介面。. 34.

(46) 2-3.2. 數據分析使用由哈佛大學 (Harvard University, USA) 莊小威 (XiaoWei Zhung). 實驗室所提供的 smFRET 分析[36]，以進行螢光訊號處理，如圖二十六所示，將每個錄影檔的供體與受體影像重疊，並扣除背景訊號，即可圈選出螢光分子對，並剔除兩個或以上距離太近的分子，以確保實驗條件皆為單分子，再分別比對原影像，以得到供體與受體螢光分子隨時間變化之訊號。. 圖二十六、單分子實驗中，所圈選出的螢光分子對影像。影像左、右側分別為供體與受體螢光分子訊號。. 35.

(47) 利用 MATLAB (Matrix Laboratory, The MathWorks, Inc) 程式，將已校正之數據進行分析，分析方法可分為短時間與長時間兩種。如圖二十七所示，短時間的分析方法取錄影檔的第 3 幀至第 12 幀，將每個螢光分子對訊號作平均，即可得到每個分子的 EFRET 值，由於供體螢光分子的螢光訊號通過偵測器前的濾光片時，會有部分逸漏 (leakage)，因此可在受體螢光分子的影像中觀察到部分由供體產生的螢光訊號 (donor leakage)，而我們在計算 EFRET 值時可用下列公式 (3) 修正：. 𝐸FRET =. 𝐼A − 𝛼 𝐼D 𝐼A + 𝐼D. (3). 𝐼A 及 𝐼D 分別為受體與供體螢光分子的放光強度，𝛼 為逸漏之修正值。而在本實驗室的系統 𝛼 值約為 0.2。將約 20-30 個錄影檔中所有的分子 (約 400 個) 的 EFRET 值繪製成直方圖。. 圖二十七、經由 MatLab 程式計算後，所得的 EFRET。. 36.

(48) 如圖二十八所示，長時間的分析方法則是利用螢光共振能量轉移公式計算每個螢光分子對隨時間變化之訊號，即可得到單分子隨時間變化的 EFRET 軌跡圖。此外，當螢光分子強度瞬間跌至 0 時，即為螢光分子已被光漂白。. 圖二十八、長時間軌跡圖。紅線為受體隨時間變化的放光強度；綠線為供體隨時間變化的放光強度；灰線為經計算後，所得的隨時間變化 EFRET；箭頭處為第三十秒時，受體螢光分子已被光漂白。. 37.

(49) 2-3.3. 擬合分析利用 HaMMy (由 Taekjip Ha 研究團隊提供) 擬合程式，如圖二十九所. 示，將長時間軌跡圖以隱馬可夫統計模型 (Hidden Markov Model, HMM) 為基礎，用以辨識隱含在雜訊中的動態狀態改變，並使用 Baum-Welch 演算法進行計算，此演算法能夠用來尋找已知的時間序列中，最可能的狀態變化與變化機率，因此可計算單分子在時間內是否有狀態變化[17]。. 圖二十九、HaMMy 程式介面。藍線為軌跡圖；綠線為經演算後，所得到的狀態變化。. 38.

(50) 利用 TDP (由 Taekjip Ha 研究團隊提供) 程式，計算轉換密度圖 (transition density plot, TDP)，如圖三十所示，能夠統計由 HMM 擬合的狀態變化起始點與終點，並將選定兩狀態之間改變的轉換機率 (transition probability) 加總後，用高斯函數擬合，其強度 (以色溫表示) 為狀態變化的數量，即可獲得狀態變化的動力學速率常數[17]。. 圖三十、TDP 分析程式介面。左上圖為 TDP，其橫軸為狀態轉換起點，縱軸則為狀態轉換終點；左下圖為將 TDP 以高斯函數擬合後之結果。. 39.

(51) HMM 有時無法擬合長時間軌跡圖中的狀態變化，其可能的原因包含無狀態變化、狀態變化速率過快或狀態變化不明顯，此時會使用互相關函數 (cross-correlation function) 進行計算，其在訊號分析中表示兩個不同的時間序列間之相關程度[11-12]。供體與受體螢光分子隨時間的放光強度即為時間序列，當兩者同時發生消長時，EFRET 即會產生變化，此時互相關函數經過計算後，在 𝜏 = 0 時為負值；若 EFRET 的變化是由雜訊或其他因素所導致，其互相關函數在 𝜏 ≠ 0 時迅速歸零。兩者隨時間變化的螢光強度，因此可將互相關函數改寫為下式 (4)： ∞. 𝐶𝐶 (𝜏) =. ∫−∞{[𝐼𝐷 (𝑡 − 𝜏) − ⟨𝐼𝐷 ⟩][𝐼𝐴 (𝑡) − ⟨𝐼𝐴 ⟩]} ⟨𝐼𝐷 ⟩⟨𝐼𝐴 ⟩. (4). 如圖三十一所示，經過互相關函數計算後，若其有狀態變化，即為兩時間序列有高度相關，此時會得到單一反向指數衰減. (inversed. single-exponential decay) 函數，經過擬合後的衰減常數即為正、逆反應速率常數之和。. 圖三十一、互相關函數分析圖。(A) 長時間軌跡圖；(B) 不同時間的互相關分析。摘錄自參考資料[11]。. 40.

(52) 第三章、 3-1. 結果. 單分子實驗設計實驗的設計如三十二所示，將供體螢光分子修飾於目標分子 (CTG)n 的 5’ 末端，供體分子修飾於副序列的中間，所以當 (CTG)n 折疊成兩端對齊髮夾結構時，由於兩染料間的距離為七個鹼基對 (~2.2 nm)，相當靠近，預期產生較高的螢光共振能量轉移效率 EFRET；若是折疊成為單組突出髮夾結構，兩染料間的距離為七個鹼基對加上未鍵結的三個核苷酸 (~0.8 nm)，其能量轉移效率會較兩端對齊髮夾結構低，因此能藉由能量轉移效率的差異，以進行實驗的觀察。. 圖三十二、單分子實驗設計。左圖為單組突出髮夾結構；右圖為兩端對齊髮夾結構。藍線為目標分子 (CTG)n；綠星為供體螢光分子；紅星為受體螢光分子。. 41.

(53) 3-2. 結構鑑定首先使用了重複次數為 4-15 的 CTG 重複序列來進行實驗。如圖三十三所示，偶數重複的 (CTG)n 的 EFRET 分布中心為 0.84，具有較高的 EFRET，且當重複次數增加時，並不影響其 EFRET，表示偶數重複的 (CTG)n 結構並不會因為重複次數不同而改變，相當單一；而奇數重複的 (CTG)n 的 EFRET 分布中心為 0.78，較偶數重複的 (CTG)n 低，根據結構上的差異，這些實驗結果是符合 Dalney 等人所預期的[6-8]。. 圖三十三、(CTG)4-15 的 EFRET 。藍色直方圖為偶數重複的 (CTG)n ；紅色為奇數重複的 (CTG)n。. 42.

(54) 為了確認奇數重複的 (CTG)n 折疊的結構，如圖三十四所示，根據文獻，奇數重複的 (CTG)n 會形成兩種單組突出髮夾結構，所以我們使用了兩個模擬折疊的輔助序列，包含能夠穩定折疊成 5’ 單組突出的 (CTG)6T3 與 3’ 單組突出的 T3(CTG)6，兩者的 EFRET 分布皆位於 0.70，因此無法分辨單組突出位於 3’ 或 5’ 端。. 圖三十四、輔助序列 (CTG)6T3 和 T3(CTG)6 的 EFRET 比較。. 接著將輔助序列與 (CTG)7 的 EFRET 疊合並比較，如圖三十五所示，若是其結構相同，應得到相同的 EFRET，但兩者並不相同，因此無法確定其結構，爾後會在加以說明。. 圖三十五、輔助序列 (CTG)6T3 和 (CTG)7 的 EFRET 比較。. 43.

(55) 此外，如圖三十六所示，當奇數重複的 (CTG)n 重複次數逐漸增加時，其 EFRET 分佈會出現消長的情形，向右邊位移，此種情況發生的原因有兩種，有可能是其原本的結構隨著重複數目增加形成漸進式的結構改變，以致於造成 EFRET 的改變；或者是其本身同時存在兩種或以上的結構，所以得到兩個或多個 EFRET 的分佈疊加的直方圖，而當這些結構間的平衡隨著重複數目而改變，進而使 EFRET 產生消長的情況,以致於直觀上狀似特徵峰位移的現象。. 圖三十六、較長的奇數重複的 (CTG)21-37 之 EFRET。. 44.

(56) 因此將重複次數為 15、25 和 37 的重複序列 EFRET 疊合並做比較。如圖三十七所示，當奇數重複的 (CTG)n 重複次數為 15 時，EFRET 分佈尚在 0.78；當重複次數增加至 25 時，0.78 的分佈降低，而 EFRET 為 0.70 與 0.84 的分佈增加；當重複次數增加 37 時，其 EFRET 消長的情形更加的明顯。這些結果顯示，奇數重複的 (CTG)n 不只擁有一種構型，而當重複序列低於 15 時，其特徵峰為兩個構型的混合；重複次數超過 25 時，混合的特徵峰逐漸降低，並生成新的特徵峰，這些結果皆表現在 EFRET 數據上，但尚無法將其完全分離，且 EFRET 的直方圖為每個分子在短時間內 (~0.3 s) 的平均結果，無法觀察是否有即時動態行為，因此接下來將觀察與時間相關的 EFRET 長時間軌跡圖。. 圖三十七、(CTG)25、(CTG)31 和 (CTG)37 的 EFRET 比較。. 45.

(57) 3-3. 長時間軌跡圖為了解決前文所提出的問題，將觀察 (CTG)5-37 的每個分子在長時間下之 EFRET (~3000 frame, 30 fps)，並且將實驗結果進行 HaMMy 擬合。首先我們觀察了偶數重複的 (CTG)n，並展示在圖三十八，其擬合的結果皆為穩定的在 EFRET 為 0.84，且取樣數將近 100% 皆是同一結果，表示偶數重複的 (CTG)n 只有一種結構，且不因重複序列次數而改變，並沒有任何可偵測到的動態行為。. 圖三十八、偶數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖。紅線為受體螢光分子的放光強度；綠線為供體螢光分子的放光強度。灰線為 EFRET；灰線中的紅線為 EFRET 經擬合後的結果。. 46.

(58) 而在奇數重複的 (CTG)n 中，藉由 HMM 擬合 𝑛 ≥ 15 的曲線，皆觀察到有許多的動態行為，如圖三十九所示，可得知其會在 EFRET 為 ~0.84 與 ~0.70 兩個狀態間進行轉換，且每個重複序列的取樣數大約為 90% 的分子皆可觀察到此動態行為，此結果表示大部分的分子具有兩種構型，且構型間能夠互相轉換，但重複次數為 13 以下的重複序列能夠在長時間的軌跡圖中觀察到供體與受體的放光強度有消長的情況，但是 HMM 擬合無法得到與其他重複序列相同的結果，在此我們認為可能的原因是由於這些分子的結構轉換速率過快，導致擬合的程式無法對其進行分析，因此之後會再以其他方法確認無法擬合的重複序列是否也存在動態行為。此外，在長時間的軌跡圖中，可以觀察到當重複次數增加時，其轉換頻率有逐漸減少的現象，意謂兩個構型間的轉換速率會隨著重複次數的增加而下降。. 圖三十九、奇數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖。. 47.

(59) 然而，所有奇數重複的 (CTG)n 除了可觀察到 EFRET 為 0.84 與 0.70 之外，也可觀察到有小部分分子會處於更低 EFRET，取樣數大約占所有分子的 3%，由於此狀態為極少數分子之行為，因此幾乎可忽略不計，如圖四十所示，奇數重複的 (CTG)n 存在著 EFRET 為 0.5 的狀態，為了確認其動態行為細節，之後將進行 TDP 的分析。. 圖四十、奇數重複的 (CTG)n 之長時間軌跡圖中，具有極少數非預期的狀態變化。. 48.

(60) 3-4. 轉換密度圖分析由於在長時間軌跡圖觀察到動態行為，因此我們進行了轉換密度圖 TDP 的分析。如圖三十六展示了奇數重複的 (CTG)21-37 之分析結果，每一個重複序列的皆有兩個 EFRET 主峰，第一個主峰值起點為 0.70，終點為 0.84；而另一個則相反，起點為 0.84，終點為 0.70，且這兩個主峰的事件發生數量相當多。除此之外，可在圖中觀察出主峰外，其他位置也有少數偶發事件發生，但因其事件發生數量與主峰相比是極少數，且有可能是汙染或不純物所導致，因而略去不予處理，因此可以確認奇數重複的 (CTG)n 序列是主要在 EFRET 為 0.84 與 0.70 的兩個狀態間互相轉換。. 圖四十一、奇數重複的 (CTG)n 之機率轉換密度圖。X 軸為狀態轉換之起點；Y 軸為狀態轉換之終點；Z 軸 (色溫圖) 為狀態轉化之事件數。圖中有兩個主峰與其他極少數事件。. 49.

(61) 3-5. 髮夾結構與環尺寸模擬目前已知奇數重複的 (CTG)n 會有兩個狀態互相轉換，但還不知道此狀態為何種構型，因此我們將每個分子兩個狀態分離出來並且進行統計。如圖四十二所示，以 (CTG)21 分離後的結果為例，EFRET 較高的狀態為 0.84，將其與 (CTG)22 的結果進行比較是一致的，可以得知此構型會與偶數重複的(CTG)n 相同；而 EFRET 較高的狀態為 0.70，將其與輔助模擬的序列 (CTG)6T3 進行比較，結果也相同，因此即可確認奇數重複的 (CTG)n 的結構為兩端對齊髮夾結構與單組突出髮夾結構同時存在。. 此外，從圖中可看出對照組的特徵峰皆較 (CTG)21 所分離出的特徵峰窄，原因是由於對照組的 EFRET 是由 10 幀平均而得，幀與幀 (frame-to-frame) 的動態雜訊將會在平均過程中被減低，所以其特徵峰較窄；而實驗組則是由每個 frame 中分離而得，幀與幀雜訊並未被除去，因此造成其特徵峰變得較寬。. 圖四十二、奇數重複的 (CTG)n 之兩個狀態分離結果與結構模擬。上圖為與 (CTG)22 比較圖；下圖為與輔助序列 (CTG)6T3 比較圖。. 50.

(62) 根據文獻，奇數重複的(CTG)n，其單組突出髮夾結構與兩端對齊髮夾結構的環尺寸分別是四個核苷酸與三個核苷酸，為了確認髮夾結構的細節，所以我們將 (CTG)7 的部分連續的核苷酸修改成 T，強制其以連續 T 為環的輔助序列，以模擬髮夾結構，包含以四個核苷酸為環，並形成髮夾結構的 (CTG)7_mT4 (序列請見表二與圖 38)與環尺寸為三個核苷酸，且折疊成髮夾結構的 (CTG)7_mT3。如圖四十三所示，(CTG)7_mT4 的 EFRET 為 0.70，與單組突出髮夾結構相同，所以可以確認其是以四個核苷酸為環；而 (CTG)7_mT3 的 EFRET 為 0.84，也與兩端對齊髮夾結構相同，因此可以得知其環尺寸是三個核苷酸。. 圖四十三、模擬奇數重複的(CTG)n 髮夾結構，其不同環尺寸的輔助序列之 EFRET。上圖為輔助序列 (CTG)7_mT4；下圖為輔助序列 (CTG)7_mT3。. 51.

(63) 而文獻中，偶數重複的 (CTG)n，其髮夾結構的環尺寸是四個核苷酸，所以我們修改了 (CTG)6。如圖四十四所示，(CTG)6_mT4 會以四個核苷酸為環的髮夾結構，而其 EFRET 為 0.84，與兩端對齊髮夾結構相同，因此可以確認偶數重複的(CTG)n 會穩定折疊成以四個核苷酸為環的兩端對齊髮夾結構。. 圖四十四、模擬偶數重複的(CTG)n 髮夾結構之 EFRET`，. 52.

(64) 3-6. 互相關分析由於無法對重複次數為 13 以下的重複序列結果進行 HMM 擬合，為此使用互相關進行分析，當觀察到 EFRET 產生變化時，其螢光分子對間的相關程度大，因此可得知無法進行擬合的重複序列，也存在著動態行為。以 (CTG)13 為例，如圖四十五所示，其經過互相關分析後，得到單一反向指數衰減曲線，在 τ = 0 時是負值，表示其同時間的相關程度極大，且在 τ ≠ 0 時迅速歸零，代表其在不同時間點的螢光訊號是不相關的，因此可得知重複次數為 13 以下的重複序列具有狀態變化，其正、逆反應的速率和約為 22.22 s-1，因此先前推測 HMM 無法解析是合理的，由此一分析可知較短的奇數重複序列亦進行動態的構型轉換。. 圖四十五、(CTG)13 的互相關分析圖。. 53.

(65) 3-7. 狀態轉換之動力學奇數重複的 (CTG)n 的兩個結構間互相轉換的行為，類似於在 DNA 複製過程中的滑動行為。如圖四十六展示正反應 (forward) 和逆反應 (backward) 間的平衡，正反應為由單組突出髮夾結構轉變為兩端對齊髮夾結構，反之，逆反應則為兩端對齊髮夾結果轉變為單組突出髮夾結構。. 圖四十六、奇數重複的 (CTG)n 的兩個結構間互相轉換的行為。. 54.

(66) 如表五所示，我們從重複次數為 15 以上的奇數重複序列的擬合與分析結果中，提取了動力學速率常數 (kinetics constant, 𝑘)。. 重複序列. 正反應速率 -1. 誤差值. 逆反應速率 -1. 誤差值. k (s ). error bar. k (s ). error bar. (CTG)15. 6.39. 0.45. 3.72. 0.35. (CTG)21. 4.69. 0.35. 2.78. 0.37. (CTG)25. 3.52. 0.45. 2.18. 0.06. (CTG)27. 3.30. 0.20. 1.99. 0.11. (CTG)29. 3.07. 0.10. 1.95. 0.06. (CTG)31. 2.84. 0.13. 1.65. 0.08. (CTG)33. 2.78. 0.50. 1.62. 0.35. (CTG)35. 2.56. 0.46. 1.36. 0.35. (CTG)37. 2.75. 0.10. 1.59. 0.13. 表五、重複次數為 15 以上的 (CTG)n，其正、逆反應之速率與誤差值，誤差值為三次以上重複實驗的數據計算所得。. 而動力學常數之倒數為在某狀態的平均滯留時間 (dwell time) 之平均值，即為狀態轉換之所需時間。如表六所示。. 正反應停滯時間. 誤差值. 逆反應停滯時間. 誤差值. 1/k (s). error bar. 1/k (s). error bar. (CTG)15. 0.16. 0.01. 0.27. 0.35. (CTG)21. 0.21. 0.02. 0.36. 0.37. (CTG)25. 0.28. 0.04. 0.46. 0.06. (CTG)27. 0.30. 0.02. 0.50. 0.11. (CTG)29. 0.33. 0.01. 0.51. 0.06. (CTG)31. 0.35. 0.02. 0.60. 0.08. (CTG)33. 0.36. 0.06. 0.62. 0.35. (CTG)35. 0.39. 0.06. 0.74. 0.35. (CTG)37. 0.36. 0.01. 0.63. 0.13. 重複序列. 表六、重複次數為 15 以上的 (CTG)n，其正、逆反應之平均滯留時間與誤差值。. 55.

(67) 如圖四十七所示，將正、逆反應的動力學常數之倒數 (1/𝑘) 對重複次數做圖，正、逆反應所需的時間皆會比正反應多，而無論是正、逆反應，其時間皆會隨著重複次數的增加而呈線性增加，即為轉換速率變慢。依照線性關係式 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏，可以得到下關係式 (5)：. 1 = 𝑎𝑛 + 𝑏 𝑘. (5). 由於當重複次數為 0 時，不會有滯留時間，因此可以將截距 b 假設為 0，而其斜率 a 即表示重複次數與滯留時間的關係。而線性擬合之結果顯示，正、逆反應之 1/k，亦即平均滯留時間與在此範圍 (n = 15-37) 內的重複序列具有良好的線性關係，且逆反應所得到之斜率略大於正反應。. 圖四十七、重複次數為 15 以上的奇數重複序列，正、逆反應的動力學常數之倒數。紅色為正反應；綠色為逆反應。. 56.