癌症不容易被完全根治，一般對於癌症治療的效果多以〝 年存活率〞為標的。因 為化學藥物與放射性療法為非專一性的治療，所以作用區域並非侷限於病變區域，也容 易對於癌細胞週遭組織的損害與引起強烈的副作用，這些結果會降低治療的效果及造成 病人的負擔。當癌症復發時，再重覆化學藥物與放射性治療，對於週遭正常細胞的重複 性傷害，並不亞於癌症細胞帶來的傷害。目前結合生物科技方式，可將抗癌藥物或是物
質傳送至癌細胞，且不會對週遭正常細胞造成影響，此方式即為〝標靶治療〞。標靶治
療作用只針對癌細胞，並可藉由所攜帶的藥物或是物質造成癌細胞以細胞凋亡方式進行 死亡，不會造成週遭細胞或組織的傷害，可有效的抑制癌症的增生或使癌細胞減少並達 到治療的效果。在本研究中，我們利用結合生長激素的奈米鑽石標定肺癌細胞，並利用 雷射激發使奈米鑽石體積爆炸並對癌症細胞造成傷害; 或利用可與乳癌細胞特殊表現受 體CEACAM6與HER-2結合的單一抗體，達到標靶治療的目的，並藉由探討其死亡分子 機制與抑制癌症增生能力，建立新的癌症治療平台與方法。
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壹、 多光子趨動標靶化奈米鑽石誘發癌細胞死亡之機制
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壹、第一章 研究背景
壹-1-1 肺癌
依世界衛生組織 (World Health Organization，WHO)歷年公布之世界癌症排名，肺 癌 (lung cancer)之致死率一直列於前三名，於 2010 年之統計資料公佈，無論男性或女 性，因肺癌死亡之比率皆佔所有癌症之冠，分別為29%以及 26%，而在新增癌症病例中 也都位居第二名[152]。故本研究在篩選了具有生長激素大量表現的癌細胞中，設定以肺 癌為研究題材，而肺癌通常又粗分為兩類：小細胞肺腺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 與非小細胞肺腺癌 (non small cell lung cancer, NSCLC)。大約 20%-25%的肺癌患者屬於 小細胞肺腺癌，而其他大多數約75%-80%則歸類為非小細胞肺腺癌患者[153, 154]，故 本研究選擇以A549 非小細胞肺腺癌細胞作為主要之研究對象。
壹-1-2 奈米材料於生物醫學之應用
「奈 (nano)」為一數量級單位，等於 10-9，而「奈米 (nanometer)」則為對物質尺 度之描述，等於10-9米。奈米技術於1990 年代開始受到重視，繼機械、電子、資訊科 技後被稱作第四次工業革命，至今已廣泛發展於各領域[155]，其目的是以原子、分子或 巨分子之尺度為基礎[156]，針對這些物質的結構或裝置作探討及應用，並有別於過往能 夠發展出更具功能或效率之目標物。
奈米科技中的一環-奈米材料為科學研究中的熱門題材，舉凡物質之幾何形狀涵蓋 於一奈米至三百奈米間 (即達到奈米尺度)者[156, 157]皆可包含於其中，而其主要之類 型則包含了奈米粉末或奈米顆粒 (nano powder/ nano particle)、奈米纖維 (nano fiber)、
奈米薄膜 (nano film)、奈米塊材 (nano bulk)等等。奈米粉末或奈米顆粒指的是粒徑大小 小於一百奈米以下的粉末或顆粒，為一種介於原子、分子與巨分子間的固體顆粒材料，
例如：奈米金、奈米鑽石等；奈米纖維即為三維空間中，有兩個維度處於奈米尺度之線 狀材料，亦及直徑或厚度達到奈米尺度並且長度較長之線狀材料；常見如；奈米線、奈 米碳管；奈米薄膜係指由奈米尺度之顆粒或晶體所構成之薄膜狀結構，此材料每一層厚 度皆於奈米等級的單層膜或多層膜，例如：矽、砷化鎵等，這些材料具有良好之光電特 性，多應用於光電、半導體產業；奈米塊材則是將奈米粉末以高壓或高溫之方式使材料 成型，通常依此方式所得之奈米材料在特性上會與一般材料有高度特異性，像是具有高 比熱、高強度、高導電性、高韌性、高熱膨脹性質等等。而以上這些奈米材料所表現之 結構特性更有別於一般，像是尺寸小、具有高表面積與體積比、為高密度堆積之結構，
並有高結構組合彈性，這些奈米材料在結構上的特點與優勢造就了其更高的利用價值。
以下列舉一些常見於生醫領域所應用之奈米材料：
(一) 奈米金 (nanogold)：在多種奈米金屬材料中，奈米金粒子因為良好的生物相容性及 特殊光學性質，而被研究最為廣泛。目前奈米金粒子應用於生物醫學上的項目包括了光 子標靶治療、生物檢測、活體影像觀察等。在光學上，奈米金粒子的特殊吸收波長會因 粒徑大小增加而產生紅位移的情形，舉例來說，當奈米金粒子直徑為3 nm 時，其吸收
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波長為509 nm，而當直徑增加到大約 10 nm 時，其特殊吸收波長則會紅位移至 518 nm 左右，此特殊光學性質較常應用於免疫檢測部分，如驗孕棒等，當分散的奈米金粒子因 其上所接合之抗原抗體反應而聚集時，會從原本的淡粉紅色變為深藍色，可供肉眼直接 判定檢驗結果。此外，奈米金也因為擁有強的吸光係數即可改變的特殊吸收波長特性，
故在光敏治療法中也佔有一席之地[158, 159]。
(二) 奈米碳管 (carbon nanotube，CNT)：於 1991 年由日本 NEC 公司研究員 Sumio Iijima 以弧狀放電法置備碳60，並以穿透式電子顯微鏡觀察碳的團簇（cluster）時意外發現直 徑約1-30 奈米石墨平面捲曲而成之管狀材料，此即為多層奈米碳管（multi-walled）的 發現[160, 161]。在生物醫學上，奈米碳管因為其生物毒性，導致應用的範圍較為侷限[162, 163]，不過仍有人成功將奈米碳管應用於細胞的微注射[164]。
(三) 微脂體 (liposome)：細胞膜 (cell membrane)由脂質雙層膜 (lipid bilayer)組成，成分 主要為磷脂類 (phospho-lipid)，其中脂肪酸鏈為疏水端，磷酸端為親水性，脂肪酸鏈包 埋於雙層膜之中，而磷酸端裸露於外層，造成整體親水性之構型。微脂體的構型與細胞 膜相似，可均勻分布於水溶液中，並具有高度生物相容性即可分解性，故被應用於生物 載體部分。水溶性物質與疏水性物質可被分別包埋於球心及脂雙層內，並藉由細胞膜的 吸附 (absorption)、融合 (fusion)與膜間轉換 (inter-membrane transfer)等方式將所攜帶的 藥物或物質帶入細胞[165-167]。
(四) 量子點 (quantum dot)：當量子點的三維皆被限制於100 nm以下時，其電子與電洞 會被侷限於非常小的空間中，使其再結合的機率變大，導致發光效率相對增加。而量子 點在激發光的能量超過其能隙 (band gap)時，會吸收光子並導致電子由共價帶 (valence band)躍升至導電帶 (conduction band)，當電子由導電帶回到共價帶時，會放出螢光。當 塊材的大小變小時，因原子數減少，造成能階密度 (density of states)降低，能階間隔變 大，有效能帶增大，導致吸收與螢光光譜產生藍位移 (blue shift)現象。換句話說，當粒 子越小，相同材料所製成之量子點會有更短之螢光光譜。所以即便是單一光源，量子點 可以因為大小不同而產生不同的螢光顏色，另外量子點相較於傳統螢光染劑，擁有更佳 之亮度與穩定度。故量子點可用於長時間與即時的生物分子追蹤，對於診斷與醫療治療 有相當大的應用空間[168-170]。
(五) 奈米鑽石 (nanodiamond): 奈米鑽石大約在 1980 年代被發展出來，主要的製造方法 為使用黃色炸藥-三硝基甲苯 (trinitrotoluene, TNT)在負氧的環境下爆炸產生，因為奈米 鑽石於短時間 (<10-6秒)的高溫高壓下生成，故其顆粒大小大約只有 4~10 nm。由結晶學 來看，因為奈米鑽石生成的時間短，溫度高 (103 K)，加熱速度過快 (109 K/s)，導致鑽 石內的晶體生成時容易出現大量的晶格缺陷，稱為氮空位缺陷中心 (nitrogen-vacancy defect center, NV center)，有研究指出，奈米鑽石中的氮空位缺乏中心與螢光有關[171, 172]。一般而言，最外層與最內層電子軌域間之能量差即為能隙 (band gap)，而在奈米 鑽石中，因所含有的原子數減少，各原子被周圍原子的影響也變少，產生量子侷限效應 (quantum confinement effect)，產生非連續性的離散電子能階，而能隙也會因奈米化而變 寬，電子能階非連續化及能隙變寬現象，稱為量子尺寸效應 (quantum size effect)[173, 174]。
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奈米鑽石已經被證明有高度生物相容性及低生物毒性，可當做輸送基因與藥物的載體 [175-177]，並且經由吸收雷射的能量後，會因熱聲子效應而使其轉換為石墨結構 (sp3 to sp2)，造成體積膨脹[178]，可破壞特定目標，達到治療的目的。
壹-1-3 多光子效應 (multiphoton effect)
多光子激發 (multiphoton absorption)為一非線性之光學效應，指的是於高強度之激 發光激發下，一個分子同時吸收多個光子，由基態轉變為激發態之過程，其吸收能量等 同於頻率為n 個單光子所提供之能量，即能量為 n。於單光子效應中，分子經由逐次吸 收單個光子先躍遷至中間態，再藉由吸收單個光子而躍遷達到最終激發態，故在單光子 吸收效應中，分子會停留在許多不同能階的階段性激發態；而雙光子激發則是受激發之
分子同時吸收兩個光子而躍遷至激發態，其所受能量相當2之單光子激發能量，但因需
要兩個光子同時激發而躍遷至激發態，故躍遷機率 (transition rate)正比於入射光強度的 平方，且雙光子受吸收截面低之緣故使得其須極高之瞬間功率方可產生有效激發；而於 多光子吸收過程中，分子會直接由基態躍升至最終激發態，不會有任何的階段性激發態 存在，此為三者最大之差異[179, 180]。
一般來說，多光子效應所需吸收之光子密度非常高，一般於自然界中不易發生，本 實驗室使用高密度脈衝雷射來做為實驗工具，而使用多光子效應激發時須考量生物分子 與細胞所能承受之最大能量[181]，而對於奈米鑽石之多光子吸收效應，雖然其因此原理 激發可造成結構上劇烈改變，但應用於生物體中則必須配合在生物分子或細胞所能承受 之功率範圍，故須進一步探討此奈米分子於生物醫學之應用性。
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壹、第二章 研究動機與策略
壹-2-1 研究動機
本研究結合了奈米科學及生物技術開發了一項新的癌症奈米標靶粒子 (nano targeting complex)，其利用奈米鑽石為基礎，接合上與癌細胞具有靶向性之生物分子來 做為一治療工具。奈米鑽石本身內部為一穩定的sp3結構並具有高度生物相容性，由本
本研究結合了奈米科學及生物技術開發了一項新的癌症奈米標靶粒子 (nano targeting complex)，其利用奈米鑽石為基礎，接合上與癌細胞具有靶向性之生物分子來 做為一治療工具。奈米鑽石本身內部為一穩定的sp3結構並具有高度生物相容性，由本