第一章 序論
六、 實驗原理
biotinylated sunitinib 和鏈黴卵白素樹脂形成了 sunitinib-beads (圖 3C)與 蛋白質複雜樣品做混合，其標的蛋白質就會被鍵結在 sunitinib-beads 管柱 中。Negative control compound (圖 4A)也是利用一樣的原理，形成了 negative-beads，如圖 4B 所示，導入實驗設計當作背景值以去除非專一 性鍵結之影響。
當 sunitinib-beads 與 negative-beads 和蛋白質複雜樣品進行混合時，
為了得到標的蛋白質，會進行一些純化的步驟。要使欲分離的標的蛋白質 和配位體分離，通常會採用改變 pH 值、離子濃度或緩衝溶液的組成，來 使其親和力降低，洗脫出標的蛋白質。若配位體與標的蛋白質的親和力不
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10 (acrylamide)經 TEMED 催化以及 APS 活化後，產生連鎖反應形成高分子 聚合物，再和交聯劑(methylene-bisacrylamide)連接成了三維網狀結構的 凝膠。網狀的孔徑可以藉由改變單體分子和交聯劑的濃度來決定，濃度高 者孔徑的形成就會比較小。所以根據想要分離蛋白質的分子量範圍來配置 膠體的濃度，5% acrylamide 適用於分離 60-200 kDa，7.5% acrylamide 為 50-120 kDa，10% acrylamide 為 16-70 kDa，12.5% acrylamide 為 15-60 kDa，15% acrylamide 為 12-45 kDa。分子的電泳遷移率取決於它的電荷 質量比(Q/m)，而 SDS 為一種界面活性劑，易和蛋白質鍵結，會在兩個胺
11 (stacking gel, pH 6.8)與分離膠體(resolving gel, pH 8.8)，其所配製的 pH 值不同。在電場驅使下，蛋白質樣品會先往正極移動，因緩衝溶液 pH 值 約為 6.8 在焦集膠體不易移動，使樣品與緩衝溶液之間形成一空乏區而在 焦集膠體處聚集等待緩衝溶液下來，待緩衝溶液到達時會帶動樣品往正極 移動使蛋白質進行分離，如圖 5 所示。
經過電泳分離完蛋白質後，利用庫瑪西染劑(coomassie brilliant blue R-250)染色可直接觀察蛋白質分離的狀況。庫瑪西染劑上的苯環與蛋白質 analyzer)和偵測器(detector) 。而早期常用的電子 撞擊游離法(electron
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impact ionization, EI)和化學游離法(chemical ionization, CI)等游離法受到 樣品需具揮發性及熱穩定性的限制，且分子量不大於 500 Da 的小分子化 合物，不適合應用在蛋白質的分析。在 1984 年 Fenn, J.B.提出了電噴灑 游離法(electrospray, ESI)後，如圖 6 所示，成為了目前最常使用在蛋白質 的分析方法之一，在蛋白質體學的研究中是不可或缺的工具 61。ESI 是一
在 1984 年 Alksandrov, M.L.等人成功地將液相層析儀與電噴灑游離質 譜法結接。電噴灑所用的溶劑需是具有極性，所以液相層析的移動相選擇 相當受到限制，否則無法得到相當好的離子訊號。 由於 ESI 具備了 concentration-dependent 的特性，微量的進樣系統可以有效的提升質譜偵 測的靈敏度，進而可以減少樣品進樣量，分析微量樣品 62。此研究實驗使 用奈米級液相層析質譜，參考 Goodlett, D.R.等人提出的 nano-LC 分流進 樣裝置63，裝置由 analytical column、trapping column 和連接兩根管柱的 microtee 組成。Microtee 以一小段毛細管接上提供高電壓的 metal union，
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透過 liquid junction 使 analytical column 進行電噴灑。分流裝置在 load mode 樣品會進入 trapping column 進行線上去鹽，而不會通過 analytical column，如圖 8 所示；在 inject mode，trapping column 和 analytical column 之間的 microtee 一端封住，使得樣品會往 analytical column 流去，而進 入質譜儀分析，如圖 9 所示。經過此分流裝置，其電噴灑的流速約為 200 nL/min，以此分析生化大分子。
經過 ESI 游離化的生化樣品離子進入到質譜儀後，經由質量分析器進 行質荷比分析。本篇所使用的儀器為 LTQ XL (Thermo Scientific)其質量分 析器為線性離子阱，如圖 10 所示，由環形離子阱所改良而成，其形狀如 fragment fingerprinting, PFF)比對64,65。
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(5) Label-free 蛋白質定量方法
本論文實驗所使用的質譜分析方法為 shotgun proteomics，是以 bottom-up proteomics 的技術結合液相層析與質譜儀來鑑定蛋白質。將蛋 標定，同位素標定像是 SILAC、ICAT、TMT 和 iTRAQ 是用同位素標記的 試劑來與胜肽反應，其因同位素的關係在相同胜肽離子分子量上有些許差 異，在質譜儀上可以清楚的分析出其 m/z 值。而非同位素標定定量是本論 文所使用的相對定量方法 label-free quantification，不用同位素的標記，
由質譜分析完的圖譜資訊來做相對定量，其判斷有兩種方式為胜肽離子的 目來判定(spectral counting)，含量高的蛋白質其胜肽離子經 MS/MS 分析 的圖譜數會較多，因此兩個不同樣品的同個蛋白質可以藉著圖譜數目的比 值來做相對定量。此定量方法的優點是不受限於定量的樣品數目，分析的 動態範圍(dynamic range)也很廣；但其缺點為定量上準確度的問題，因含 量低的蛋白質在分析上可能會受含量高的蛋白質遮蔽而影響其訊號。
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