化學蛋白質體學搭配質譜技術分析Sunitinib之標的候選蛋白質

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(1)國立臺灣師範大學化學系研究所碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 化學蛋白質體學搭配質譜技術分析 Sunitinib 之標的候選蛋白質 Chemical Proteomics Analysis of Sunitinib Target Candidates by Mass Spectrometry. 研究生：鄭堯聰. 撰. Graduate Student: Yao-Tsung Cheng 指導教授：陳頌方博士 Advisor: Sung-Fang Chen, Ph.D. 中華民國一百零二年七月 July, 2013.

(2) 謝誌碩士的生涯轉眼間就過去了，在這期間非常感謝陳頌方教授的帶領與教導，讓懵懂無知的我們一路成長到現在。老師在專業及研究上認真的教學外，在球場上的較勁以及談論許多的時事與想法，讓碩士的兩年生活充實了不少。老師也不吝分享自身的經歷，讓即將要出社會的我們吸收了許多經驗來突破所面臨的難題。在此由衷感謝老師的諄諄教誨，使我獲益良多。在這邊也感謝工業技術研究院黃瑞雯博士給予耐心的指導，以及柯景懷博士不吝嗇地提供樣品來源，讓我如期完成研究。感謝芷葳學姊辛苦處理實驗室大大小小的事情，並和我們解決在質譜上所遇到的難關；感謝沛倫學長在質譜軟體上的幫忙，出遊時載我們到處吃美食；昀諭學長感謝你指導我進行實驗，讓懵懂的我在研究上迅速上手；育廷學長、德蕙學姊感謝你們在實驗上的幫助以及提供寶貴的經驗；郡倫學姊、俞靜學姊、子瑋學長感謝你們在實驗室帶來許多的歡樂，團購的美食、宏亮的聊天聲音、早上的咖啡香氣都讓我們有著難忘的回憶；感謝群皓在實驗上提供的許多幫助以及生活上的意見交流；感謝立平一起在質譜室打拼奮鬥，空閒時的促膝談心；感謝珮琳在實驗上所提供的建議，也是休閒玩樂的好夥伴；祖儀、羽薇、昀昇、佳穎謝謝你們協助實驗的進行，在休息時有歡樂的氣氛來紓解疲憊的身心。此外感謝工研院的黃瑞雯博士與周民元博士，長庚大學的陳怡婷博士，百忙撥冗前來參加學生我的口試，謝謝你們的指導與修正，使我的論文更臻完善。在實驗室的生活都是我難以忘記的回憶，我們離開後，實驗室也交給 C404 的學弟妹們來共同努力了。最後感謝父母的鼓勵與支持，讓我能順利完成碩士學位。在此這份喜悅給我的家人以及好朋友們來一起分享。 I.

(3) 目錄圖目錄 .................................................................................................... IV 表目錄 .................................................................................................... VI 中文摘要 ............................................................................................... VII Abstract ............................................................................................... VIII 縮寫 ........................................................................................................ X 第一章. 序論 ......................................................................................... 1. 一、. Sunitinib malate ................................................................... 1. 二、. 急性骨髓性白血病 ................................................................ 2. 三、. 化學蛋白質體學 ................................................................... 3. 四、. 活性為基礎的探針 ................................................................ 5. 五、. 親和性層析 .......................................................................... 6. 六、. 實驗原理 .............................................................................. 8. 七、. 實驗動機與目標 ................................................................. 15. 第二章. 實驗材料 ............................................................................... 16. 一、. 樣品 ................................................................................... 16. 二、. 藥品 ................................................................................... 16. 三、. 試劑 ................................................................................... 17. 四、. 儀器設備 ............................................................................ 18. 五、. 耗材 ................................................................................... 19. 第三章. 實驗方法 ............................................................................... 20. 一、. 溶液配製 ............................................................................ 20. 二、. MV4-11 的蛋白質萃取 ....................................................... 20. 三、. 蛋白質濃度測定 ................................................................. 21 II.

(4) 四、. 製備親和性管柱 ................................................................. 22. 五、. 活性探針固定於管柱中含量的測定 .................................... 23. 六、. MV4-11 細胞裂解液測試 .................................................... 23. 七、. 一維膠體電泳 ..................................................................... 25. 八、. 膠體內水解 ........................................................................ 27. 九、. 液相層析串聯質譜分析 ...................................................... 28. 十、. 蛋白質資料庫搜尋 .............................................................. 34. 第四章. 實驗結果與討論 ..................................................................... 35. 一、. MV4-11 的蛋白質萃取 ....................................................... 35. 二、. 蛋白質濃度測定 ................................................................. 36. 三、. 親和性管柱 ........................................................................ 36. 四、. 親和性層析 ........................................................................ 38. 五、. 蛋白質數據處理 ................................................................. 41. 六、. 生物資訊分析 ..................................................................... 42. 七、. 標的蛋白質探討 ................................................................. 43. 第五章. 結論 ....................................................................................... 46. 附圖 ....................................................................................................... 47 附表 ....................................................................................................... 75 參考文獻 .............................................................................................. 108. III.

(5) 圖目錄圖 1. 化學蛋白質體學實驗流程圖 ................................................................47 圖 2. 親和性層析洗滌與洗脫流程圖 ............................................................48 圖 3. Sunitinib、biotinylated sunitinib 與 sunitinib-beads 結構示意圖 .........49 圖 4. Negative control compound 與 negative-beads 結構示意圖 ...............50 圖 5. 一維膠體電泳之 SDS-PAGE 圖 ..........................................................51 圖 6. 電噴灑游離源機制示意圖 ...................................................................52 圖 7. 泰勒錐形成示意圖 ..............................................................................53 圖 8. 液相層析分流進樣系統(load mode) ....................................................54 圖 9. 液相層析分流進樣系統(inject mode) ..................................................55 圖 10. LTQ XL 裝置圖 ..................................................................................56 圖 11. 串聯式質譜儀之碰撞誘導模式(CID)示意圖 .......................................57 圖 12. 胜肽離子碎裂形式圖 .........................................................................58 圖 13. Label-free 蛋白質定量方法................................................................59 圖 14. 化學蛋白質體學實驗總流程圖 ..........................................................60 圖 15. 牛血清蛋白標準溶液之檢量線圖 .......................................................61 圖 16. Biotinylated sunitinib 標準品溶液及樣品之 UV-Vis 吸收曲線圖 .........62 圖 17. Biotinylated sunitinib 標準溶液之檢量線圖 ........................................63 圖 18. MV4-11 細胞裂解液與 sunitinib-beads 之一維膠體電泳洗滌結果 .....64 圖 19. MV4-11 細胞裂解液與 negative-beads 之一維膠體電泳洗滌結果 .....65 圖 20. MV4-11 細胞裂解液與親和性層析之一維膠體電泳洗脫結果 .............66 圖 21. CD44 胜肽序列 ALSIGFETCR 之 MS/MS 譜圖 ................................67 圖 22. 不同 exclusion duration 鑑定蛋白質與胜肽之 Venn diagram ...........68 IV.

(6) 圖 23. Sunitinib 組鑑定到蛋白質在不同 exclusion duration 設定下之胜肽圖譜數目圖 .......................................................................................................69 圖 24. Muscle contraction relaxin 路徑圖.....................................................70 圖 25. Development VEGF signaling via VEGFR2 - generic cascades 路徑圖 ..............................................................................................................71 圖 26. Cell adhesion chemokines and adhesion 路徑圖 .............................72 圖 27. Translation insulin regulation of translation 路徑圖...........................73 圖 28. 鑑定到蛋白質的功能與細胞過程相關之分類圖 .................................74. V.

(7) 表目錄表 1. RIPA buffer 配製表 ............................................................................75 表 2. SDS-PAGE 膠體溶液配製表 .............................................................76 表 3. HPLC 移動相梯度表 ..........................................................................77 表 4. UPLC 移動相梯度表 ..........................................................................78 表 5. 牛血清蛋白(BSA)標準溶液與樣品蛋白質之濃度與吸收值表.............79 表 6. Biotinylated sunitinib 標準溶液與洗滌液樣品之濃度與吸收值表 .......80 表 7. Sunitinib 組特有之候選標的蛋白質清單 ............................................89 表 8. Spectral counts 大於 1.5 之候選標的蛋白質清單 ............................100 表 9. 不同 exclusion duration 設定下 sunitinib 組之質譜鑑定結果 ..........101 表 10. 不同 exclusion duration 設定下 sunitinib 組鑑定之蛋白質清單 .....104 表 11. 42 個藥物毒性標的蛋白質列表 ......................................................106 表 12. 候選標的蛋白質之前十名 PathwayMaps 清單 ..............................107. VI.

(8) 中文摘要化學蛋白質體學是一門新興的研究領域，主要目的在於鑑定與驗證活性小分子之標的蛋白質，利用化合物與蛋白質間特異性的相互作用力成為一個強而有力的搜尋技術。本篇論文目的為在人類急性骨髓性白血病(AML) 細胞株 MV4-11 中找到 sunitinib 之標的蛋白質。先前文獻中顯示出小分子藥物 sunitinib 有抑制 AML 細胞株中 FLT3 磷酸化的作用，進而有效地抑制掉 MV4-11 的增殖組成。利用化學蛋白質體學的策略，sunitinib 合成的生物素標記藥物固定於鏈黴卵白素粒子上形成親和性管柱，建立活性為基礎的探針於 MV4-11 細胞株中抓取特定蛋白質。實驗設計中導入 negative 控制組，其結構與 biotinylated sunitinib 相似但不具有藥理活性，做為背景值來減少非特異性蛋白質之鍵結。經過親和性層析適當的洗滌與洗脫過程，被洗脫之蛋白質以一維膠體電泳(SDS-PAGE)蛋白質和液相層析串聯式質譜儀(LC-MS/MS)進行分析和蛋白質資料庫比對鑑定出候選標的蛋白質。MV4-11 細胞裂解液中有 248 個標的蛋白質被鑑定到；他們大部分可能為 sunitinib 之新奇作用物和標的蛋白質。藉由 GeneGo 路徑分析，在 muscle contraction relaxin 和 development VEGF signaling via VEGFR2 generic cascades 這兩項路徑中，RAP-1A 和 MAP2K1 被認為是藥物目標物而且他們與血管的生成有關係，造成影響 MV4-11 細胞增殖與存活的原因。. 關鍵字：化學蛋白質體學、sunitinib、質譜儀、親和性層析、急性骨髓性白血病、活性為基礎的探針. VII.

(9) Abstract Chemical proteomics is an emerging field that the goal is to identify and validate target proteins for bioactive small molecules. It utilizes the specific interaction of compound and the target proteins to be a powerful screening technology. The main purpose of this study is to identify sunitinib target proteins in acute myeloid leukemia (MV4-11) cell lines. It has been reported that sunitinib inhibits phosphorylation of FLT3 in AML cell lines, which potently inhibits constitutive proliferation of MV4-11. Using strategy of chemical proteomics, the synthesized biotin-tagged sunitinib was immobilized on streptavidin beads to make affinity column as an activity-based probe that captures the target proteins in MV4-11 cells. A negative control, which structure was similar to biotinylated sunitinib with no pharmacological activity, was designed as a background for eliminating the impact resulting from non-specific binding proteins. After appropriate wash and elution steps in the affinity chromatography, the eluted proteins were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Two hundred forty eight sunitinib-binding proteins were identified in MV4-11 cell lysate. They are potential interactors and targets of sunitinib. These sunitinib-binding proteins were further analyzed by GeneGo and found they were associated with muscle contraction relaxing and development VEGF signaling via VEGFR2 cascades signaling pathways. Among them, RAP-1A and MAP2K1 are considered drug targets and related to VIII.

(10) angiogenesis. They are also contributed to the effects on MV4-11 cell proliferation and survival.. Keywords: chemical proteomics, sunitinib, mass spectrometry, affinity chromatography, acute myeloid leukemia, activity-based probe. IX.

(11) 縮寫 2-DGE. Two-Dimensional Gel Electrophoresis. ABC. Ammonium Bicarbonate. ABPP. Activity-Based Protein Profiling. ABPs. Activity-Based Probes. ACN. Acetonitrile. AML. Acute Myeloid Leukemia. APS. Ammonium Persulfate. BSA. Bovine Serum Albumin. CID. Collision-Induced Dissociation. DTT. D,L-Dithiothreitol. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid. ESI. Electrospray Ionization. FA. Formic Acid. FDA. Food and Drug Administration. FLT3. Fms-Like Tyrosine Kinase 3. IAA. Iodoacetamide. kDa. kiloDalton. Milli-Q H2O. Milli-Q Systems Dispense the Water. MS. Mass Spectrometry. MS/MS. Tandem Mass Spectrometry. Negative-beads. Negative Control Compound Immobilized Streptavidin Beads. OD595. Optical Density at 595 nm X.

(12) PAGE. Polyacrylamide Gel Electrophoresis. PB. Phosphate Buffer. PBS. Phosphate Buffer Saline. PI. Protease Inhibitor Cocktail. PMSF. Phenylmethylsulfonyl Fluoride. RIPA. Radioimmunoprecipitation Assay. RTK. Receptor Tyrosine Kinase. SDS. Sodium Dodecyl Sulfate. SOV. Sodium Orthovanadate. Sunitinib-beads. Sunitinib Immobilized Streptavidin Beads. TEMED. N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine. Tris. Tris(hydroxymethyl)aminomethane. XI.

(13) 第一章序論一、. Sunitinib malate. Sunitinib malate (SU11248; Sutent® ; Pfizer Inc, New York, NY, USA) 是一種口服的小分子藥物，ATP 競爭型的多重標靶受體酪胺酸激酶 (receptor tyrosine kinase, RTK)的抑制劑。在 2006 年經美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)核准用於治療腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的病患以及 imatinib 治療無效後的胃腸道基質瘤 (gastrointestinal stromal tumors, GIST)1,2。 Sunitinib malate 由 FDA 認可的藥物以來，第一個同時治療兩種不同類型疾病的抑制腫瘤藥物。Sunitinib 多重標靶的特性使其適用於治療許多疾病，不是只用於治療 RCC 與 GIST，因 sunitinib 治療其他疾病比其他治療藥物服用後的副作用太大而不建議使用。Sunitinib 經由對標靶 RTKs 的作用，來抑制掉細胞的訊號，進而抑制掉腫瘤的生長。其中 RTKs 包含了血小板衍生生長因子的受體 α 和 β、血管內皮細胞生長因子第一型與第二型受體、幹細胞因子受體 c-KIT、Fms-like 酪胺酸激酶 3(Fms-like tyrosine kinase 3, FLT3)和神經膠質細胞株衍生神經營養因子受體 3-5。由上述看來，sunitinib 擁有優越的治療效果以及成功地被 FDA 認可，但是服用之後也產生了許多很嚴重的副作用。經過 sunitinib 的治療過後最常見的副作用有疲憊、腹瀉、噁心、高血壓、口腔炎以及皮膚變黃 6。對於這些副作用的解決辦法，可以透過減少劑量與中斷服用藥物治療來達到 7. 。. 1.

(14) 二、. 急性骨髓性白血病. (1) Acute myeloid leukemia (AML). 急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血癌細胞中一個成長快速的癌症，它是由於不正常的白血球細胞快速增生，使得不正常的血細胞累積在血液與骨髓中干擾正常血細胞的生成。AML 在成人中是最為常見的白血病，而且隨著年齡的增長其發病率跟著提高。AML 是一種比較罕見的疾病，但在美國統計的癌症死亡人數比率約佔有 1.2%之多 8。AML 發病非常快速，如果在沒有接受治療的情況下，通常在幾個禮拜或幾個月之內就會死亡。一些造成 AML 發病的危險因素已經被確認出來，例如與化學藥品的接觸 9-11、受到輻射的汙染 12、基因的遺傳或其他血液疾病 13,14。在不到 60 歲的成年患者發病的初期，進行化學治療的痊癒方式已經逐漸進步 15-18。. (2) Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3). FLT3 是個接收器兼酪胺酸激酶，它的訊號表現對於造血幹細胞 (hematopoietic stem cells)以及源細胞(progenitor cells)的正常發育是非常重要的，因此在造血系統與細胞增殖的調控扮演著重要的角色 19。FLT3 是一個在 AML 中最常見的突變基因 20，有近 40%的 AML 患者被發現具有激活的 FLT3 突變型，因此被確認為影響 AML 最為重要的基因之一。FLT3 包含五個細胞外類免疫球蛋白的區域，也是一個跨膜區域(transmembrane domain, TMD)、近膜區域(juxtamembrane domain, JMD)和兩個透過酪胺酸激酶嵌入物連接的酪胺酸激酶區域(tyrosine-kinase domains, TKD)。在 2.

(15) 細胞質下 FLT3 會進行醣基化，使得受體可以定域化在細胞膜上。當受體與 FLT3 結合形成了自身的二聚體，使得結構改變促進 TKD 的磷酸化，激活了訊號傳導分子在細胞內傳遞訊號。. 三、. 化學蛋白質體學. 在 2001 年人類基因體計畫完成之後，對於研究複雜的生物系統提供了大量的新資訊，科學家們發現人類基因並無法解釋多數的生命現象，進而將研究重心轉向於基因產物的功能證實與探討。要藉由得到的這些資訊研究出新的或者是更好的方法來治療人類的疾病其實是一個很艱難的任務，因為只針對於 DNA 或 RNA 的分析還不足以瞭解細胞生物學及疾病的作用機制。眾多基因產物的功能就成為人們積極研究的目標，像是蛋白質。蛋白質調控著許多生物體內的反應，而基因序列並不能完整解釋其表現出來的蛋白質所具備的分子結構及功能，大部分蛋白質的功能密切受到許多 post-DNA/RNA 的調控，包括基因的表現、在細胞不同的位置和後轉譯修飾 21-24。科學家們普遍認為，蛋白質的產生方式與疾病的機制有所關聯，因此發展出了蛋白質體學(Proteomics)這門科學。蛋白質體學的主要目標是去鑑定從成千上萬的基因體轉譯出的每一個蛋白質的分子和細胞的作用 25。為了達到這個目標，高通量的技術常被運用在蛋白質的研究上，通過系統性、整體性和相互關聯的觀點來探討，例如基因表現、細胞功能和蛋白質相互作用 26-29。大部分的蛋白質的生理功能取決於特定的結合位置及蛋白質的構型，與標的蛋白質相互作用的特定結合位置會受到蛋白質的構型而改變，抑制或觸發蛋白質的後轉譯修飾，使蛋白質的活性機能受到影響。. 3.

(16) 蛋白質體學的資訊提供了一條路徑去瞭解生物系統與疾病的機制。目前，蛋白質體學的應用在臨床、生物醫藥和藥物治療的領域研究上是備受關注的。大部分的疾病治療藥物為一具有藥理性質的小分子化合物，經由發現不正常的生理結果，加以篩選出天然產物中純化過後的活性成分以及闡明其作用的機制。因此利用藥物小分子與標的蛋白質間的相互作用可以來檢測蛋白質體，進而找到感興趣的蛋白質。為了上述目標的達成，促進科學家們建立了一門新的研究領域，稱為化學蛋白質體學 (Chemical Proteomics)。化學蛋白質體學是一個新興的領域，基本的目標在於鑑定與驗證化學小分子的標的蛋白質。關於化學小分子的特定鍵結位置利用化學蛋白質體學的策略可以提供一個完整的資訊，它是快速且系統性以及全面性的方法有助於探討疾病的訊息傳遞路徑，藉著這些路徑來研發出新的治療方法或者是開發出新型治療藥物。一般而言，標的蛋白質要可以從複雜的蛋白質體中被純化出來，是需要一個完整性的方法來達成的。然而化學蛋白質體學大致上的步驟，為先將具有生物活性的化學小分子固定於固相載體上，形成化學探針。此探針和複雜樣品混合時會和標的蛋白質相互作用，經過足夠的洗滌和強力的洗脫條件來純化出特定的結合蛋白質。洗脫下來的部分由質譜進行分析得到圖譜資訊，透過蛋白質資料庫比對鑑定出蛋白質的身分。藉由一些生物資訊工具將感興趣的蛋白質做彙整得到疾病或生理現象的相關訊息傳導路徑。為了確認路徑內感興趣的蛋白質，傳統上有幾種驗證方法，例如西方墨點法、酵素鍵結免疫吸附分析法，這些方法是透過抗原與抗體間專一性鍵結來驗證有無感興趣蛋白質的存在 30-32，實驗流程如圖 1 所示。由上述的構想來看，生物活性小分子對其標的蛋白質具有特異性的相互作用。在藥物開發階段，會利用藥物小分子去尋找對藥物反應有所改變、 4.

(17) 產生正面影響的特定蛋白質，這些特定蛋白質的表現會與特定疾病有相關聯。這樣以生物活性小分子對蛋白質的研究稱為活性為基礎的蛋白質分析 (Activity-Based Protein Profiling, ABPP)33。而跟疾病有所相關的特定蛋白質含量通常比較低，為了將這些低含量的蛋白質從複雜的蛋白質體中純化出來，活性為基礎的探針(Activity-Based Probes, ABPs)與親和性層析 (Affinity Chromatography)這些高通量的方法常被使用於鑑定與小分子鍵結的標的蛋白質。. 四、. 活性為基礎的探針. 活性為基礎的蛋白質分析(ABPP)，是利用活性為基礎的探針(ABPs) 來分析複雜蛋白質體中標的蛋白質或標的酵素酶的功能。使用 ABPs 進行競爭試驗適合在完整的細胞、萃取物，甚至在整個生物體中評估化合物的效力以及選擇性 34。 ABPs 通常由三個部分所組成，(一) 功能基團(functional group)：一個能夠共價鍵結到酵素酶或標的蛋白質的反應基，此基團具有活性位置的親電性或親和性的官能基。(二) 標記基團(tag group)：一個可以作為後續純化或可顯現標記的酵素酶，例如生物素(biotin)和發光基團。需要可以快速且專一性高的標記出標的蛋白質或者是在鑑定之前利用親和性來豐富純化後的蛋白質。接上發光基團可以使相互作用的標的蛋白質和酵素酶在溶液中利用可見光光譜儀或螢光光譜儀偵測到訊號，在凝膠中也可見。生物素的標記使用可進行親和性的純化做為一個策略來降低複雜度使其標的蛋白質更準確地被鑑定出。(三) 連接基團(linker)：一個連接功能基團與標記基團的部分，通常為一長鏈的碳氫化合物，而具有一定長度的連接基團提供了足夠的空間來避免活性位置的立體障礙和非特異性的干擾 5. 35,36. 。.

(18) 因此改善了親和性純化標的蛋白質的效率。Tanaka 團隊經過系統性的研究，使用市售的基質以及不同類型的親水性連接基團來減少在親和性層析純化過程中非特異性蛋白質的鍵結 37,38。重要的一點是，具有生物活性的小分子在連接上連接基團與標記基團時可能會失去它本身的功能活性，在鍵結標的蛋白質上會造成錯誤鍵結的結果。所以在探針的設計上，需要深入研究結構活性關係(structure-activity relationship)來檢驗小分子與探針是否一樣擁有特定的功能活性 39。過去利用鍵結和反應性的原理設計 ABPP，而能從複雜蛋白質體內挑選出目標物，成功地發展出許多能抓取不同酵素酶的探針種類。例如絲胺酸水解酶. 33,40,41. 、半胱胺酸蛋白酶. 42,43. 、天門冬醯胺蛋白酶. 44. 、金屬相蛋. 白酶 45-47、醣苷酶 48、組蛋白去以醯化酶 49 和氧化還原酶 50,51。. 五、. 親和性層析. 在蛋白質體學中，二維膠體電泳(2-DGE)是最普遍使用的蛋白質分離技術。近期內，親和性層析亦是一種分離蛋白質的重要技術之一，可以應用在去除高含量的蛋白質，進而分離或純化出複雜蛋白質混合物中佔低含量的蛋白質。親和性層析是基於固定化的配位體與標的蛋白質特定的相互作用力. 52. 。. 例如抗體和抗原、酵素酶和受質、RNA 和互補 DNA 常被使用做為特定的配位體。親和性層析就是根據這種特定作用力而發展出來的純化方法。例如，將配位體固定於一固相載體上，利用接上配位體的固相載體填充管柱即形成親和性管柱，當含有與配位體有特定作用力的目標物的溶液經過此管柱時，其目標物便會吸附在管柱上，而非特異性的雜質會直接流過管柱. 6.

(19) 不被吸附住，再利用適當的緩衝溶液將欲分離的目標物從管柱中洗脫出來，經過這些步驟會得到純化的目標物。步驟如圖 2 所示。 ABPP 的技術是將小分子固定在固相載體上進行蛋白質的純化，經過沖洗的步驟，去除非特異性蛋白質，再經由將蛋白質變性或加入競爭性配位體來洗脫出蛋白質。在化學蛋白質體學的應用中，親和性管柱所使用的配位體和 ABPs 相似，需要一具有活性的化合物來做為配位體，能夠立即的固定化於固相載體，並要有一長鏈當作連接基團，來避免非特異性的干擾。但是在活性化合物合成上一些基團時，可能會改變化合物原本的活性，導致專一性或親和性不一樣，因此標的蛋白質便不會被捕獲。進行親和性層析，配位體的選擇也是相當重要。所需要具備的條件要能與欲分離的目標物進行專一性的結合，且親和力越大越好。與目標物結合後，在一定的洗脫條件下目標物能夠脫落，而不會因為經過洗脫過程改變了配位體的活性。配位體固定於固相載體後不影響其與目標物的鍵結專一性。另外非特異性的鍵結也可能發生在固相載體與合成的連接基團上，這些材質的選擇與洗脫的條件是需要進一步的去探討。親和性層析搭配質譜儀的鑑定能力在藥物治療應用上提供了巨大的潛力，來研究生物活性化合物特定鍵結的未辨認蛋白質的功能. 53,54. 。在先前. 的文獻當中，Schreiber 團隊使用親和性層析的技術，利用 FK506 做為配位體來分離及鑑定出 FK506 鍵結蛋白(FK506 binding protein, FKBP)55，以及利用 trapoxin 鑑定出哺乳動物組蛋白去乙醯化酶(mammalian histone deacetylase, HDAC)56。Bennett 與其同事利用多重激酶抑制劑 bosutinib 做為親和性配位體，並配合膠體電泳分離與質譜來鑑定病患樣品中極少量的目標物 57。. 7.

(20) 六、. 實驗原理. (1) 活性探針之固定化與親和性層析. 此研究當中，我們設計了一個以活性為基礎的探針結合親和性層析的方法來找出標的候選蛋白質。Sunitinib (圖 3A)此藥物為了能設計成活性為基礎的探針，合成上了標記基團生物素(biotin)，形成 biotinylated sunitinib 包含了生物素標記、連接長鏈和功能基團，如圖 3B 所示。在 ABPs 的設計裡面，生物素與卵白素(avidin)的作用力為最強的非共價鍵生物性相互作用力(Kd=10-15 M)，常被使用做為標記基團，用以純化探針進而得到與其鍵結的標的蛋白質或胜肽 58,59。鏈黴卵白素(streptavidin)與卵白素的性質非常接近，和生物素也有很強的非共價鍵作用力。且鏈黴卵白素上沒有醣基化的修飾，在親和性層析的應用上可以減少非特異性的鍵結。這實驗裡，利用生物素和鏈黴卵白素極強的相互作用力與專一性，快速的將具有活性的探針固定於固相載體上， biotinylated sunitinib 和鏈黴卵白素樹脂形成了 sunitinib-beads (圖 3C)與蛋白質複雜樣品做混合，其標的蛋白質就會被鍵結在 sunitinib-beads 管柱中。Negative control compound (圖 4A)也是利用一樣的原理，形成了 negative-beads，如圖 4B 所示，導入實驗設計當作背景值以去除非專一性鍵結之影響。當 sunitinib-beads 與 negative-beads 和蛋白質複雜樣品進行混合時，為了得到標的蛋白質，會進行一些純化的步驟。要使欲分離的標的蛋白質和配位體分離，通常會採用改變 pH 值、離子濃度或緩衝溶液的組成，來使其親和力降低，洗脫出標的蛋白質。若配位體與標的蛋白質的親和力不 8.

(21) 大時，連續通過大量的平衡緩衝溶液就會使標的蛋白質在非特異性的雜質洗出後接續洗出；若親和力比較強的配位體與標的蛋白質，則需要在洗出雜質後，利用較強的酸、鹼或界面活性劑來使標的蛋白質變性或配位體失去活性，來洗脫出目標物。另外，加入較高濃度的相同或相異的配位體，可以進行競爭的試驗，因此也可以將標的蛋白質從管柱中洗出。第一階段使用平衡緩衝溶液來洗出大部分非特異性鍵結的蛋白質，接著在第二階段些微提高了緩衝溶液的 pH 值使蛋白質自身電荷受到改變來洗出作用力較弱的蛋白質，第三階段提高了離子濃度增加蛋白質的溶解度，來洗出作用力更強的非特異性蛋白質。最後以低濃度的界面活性劑做為強力的條件使蛋白質變性來洗脫出標的蛋白質，經過這些洗滌洗脫步驟，最後所得到的蛋白質即為被純化豐富後的標的蛋白質。. (2) 去除鹽類及濃縮. 由於洗滌和洗脫所使用的緩衝溶液其鹽類濃度較高且體積較大，對於後續的分離實驗與質譜分析會造成很大的影響，所以得到的蛋白質溶液會先去除掉鹽類及減少體積而順利進行實驗。去除鹽類有很多種方式，利用 C18 管柱來捕獲住胜肽，以水相將鹽類沖洗掉，之後藉著提高有機相的組成來沖提出胜肽，或是使用透析及半透膜以區隔分子量大小的方式來將蛋白質溶液去除掉鹽類。因為此實驗之後要進行蛋白質的分離，選用具有 MWCO (molecular weight cut off)特性的半透膜離心管，將樣品離心管內以高速離心的方式將小分子鹽類和雜質去除掉，而分子量大的蛋白質會被留在離心管內，離心管內的蛋白質溶液就可以達到去除鹽類及濃縮的效果。. 9.

(22) (3) 一維膠體電泳. 在 1959 年，Davis 和 Raymond 等科學家利用丙烯醯胺凝膠做為電泳的支持物，使得膠體電泳技術以此為基礎蓬勃發展 60。然而以凝膠為基礎的蛋白質體學是個強而有力的策略來分離及鑑定蛋白質。在蛋白質體學的應用上，膠體電泳在分離蛋白質來講是很有效的技術。膠體電泳的分離原理可分為兩大部分，(一) 以蛋白質的等電點來分離，等電點是蛋白質在一定的 pH 值下其淨電荷為零。藉著在不同 pH 值環境下，蛋白質本身所帶的電荷不同而在電場的驅使下，帶電荷的蛋白質會自行移動到淨電荷為零的 pH 值下，達到分離的效果；(二) 以蛋白質的分子量來分離。利用膠體凝結所形成的三維網狀結構，會使蛋白質依照大小來分離。凝膠中的孔徑較大讓蛋白質較小的快速通過，蛋白質大者則受到阻礙而移動較慢，反之亦然。膠體電泳可分為二維與一維，二維膠體電泳是利用等電點與分子量大小來分離，有著高解析度深受很多研究者的喜愛。一維膠體電泳單靠著分子量大小來分離，雖然解析度不比二維來的好，但其高通量的特點可以同時比較或分離多種複雜樣品。本實驗所使用的方法是一維的 SDS-PAGE，由單體分子丙烯醯胺 (acrylamide)經 TEMED 催化以及 APS 活化後，產生連鎖反應形成高分子聚合物，再和交聯劑(methylene-bisacrylamide)連接成了三維網狀結構的凝膠。網狀的孔徑可以藉由改變單體分子和交聯劑的濃度來決定，濃度高者孔徑的形成就會比較小。所以根據想要分離蛋白質的分子量範圍來配置膠體的濃度，5% acrylamide 適用於分離 60-200 kDa，7.5% acrylamide 為 50-120 kDa，10% acrylamide 為 16-70 kDa，12.5% acrylamide 為 15-60 kDa，15% acrylamide 為 12-45 kDa。分子的電泳遷移率取決於它的電荷質量比(Q/m)，而 SDS 為一種界面活性劑，易和蛋白質鍵結，會在兩個胺 10.

(23) 基酸之間鍵結一個 SDS，蛋白質經 SDS 的負電荷相斥之下變性成一級結構且分子量越大所帶負電荷越多，造成每個不同大小的蛋白質其電泳遷移率都一樣。在電場的驅使下，因為有鍵結 SDS，蛋白質均會帶負電荷往正極移動，而凝膠孔徑形成一分子篩的作用，不同分子量大小者其遷移率不一樣，蛋白質只會因分子量大小來分離，並利用一系列已知分子量不同化合物的遷移率比對，做為分子量標記。膠片分為兩個部分焦集膠體 (stacking gel, pH 6.8)與分離膠體(resolving gel, pH 8.8)，其所配製的 pH 值不同。在電場驅使下，蛋白質樣品會先往正極移動，因緩衝溶液 pH 值約為 6.8 在焦集膠體不易移動，使樣品與緩衝溶液之間形成一空乏區而在焦集膠體處聚集等待緩衝溶液下來，待緩衝溶液到達時會帶動樣品往正極移動使蛋白質進行分離，如圖 5 所示。經過電泳分離完蛋白質後，利用庫瑪西染劑(coomassie brilliant blue R-250)染色可直接觀察蛋白質分離的狀況。庫瑪西染劑上的苯環與蛋白質的疏水端做結合，同時亞硫酸基團和蛋白質的正電荷結合，使得蛋白質染出藍色的色帶，其偵測極限約為 0.1 μg。將有染色的蛋白質色帶挖起進行膠體內胰蛋白酶水解，先以 DTT 還原雙硫鍵，加入 IAA 進行烷基化避免-SH 再氧化成雙硫鍵。胰蛋白酶在 pH 值 8 的環境下水解效率最好，所以加入 ABC 溶液調整 pH 值並在 37℃下進行水解。由於每個色帶挖下後蛋白質的量不一定均等，所以水解時間設定為 16 個小時，讓全部蛋白質樣品能夠水解完全。. (4) 液相層析與質譜分析. 質譜儀的構造大致上分為離子源 (ion source)、質量分析器(mass analyzer)和偵測器(detector)。而早期常用的電子撞擊游離法(electron 11.

(24) impact ionization, EI)和化學游離法(chemical ionization, CI)等游離法受到樣品需具揮發性及熱穩定性的限制，且分子量不大於 500 Da 的小分子化合物，不適合應用在蛋白質的分析。在 1984 年 Fenn, J.B.提出了電噴灑游離法(electrospray, ESI)後，如圖 6 所示，成為了目前最常使用在蛋白質的分析方法之一，在蛋白質體學的研究中是不可或缺的工具. 61. 。ESI 是一. 種質譜儀離子源，藉由施加高電壓的正電場於毛細管，樣品溶液中流過毛細管時帶負電荷的離子會往正極方向移動，正電荷離子會聚集在毛細管尖端，形成類似圓錐形的帶電液滴，稱為泰勒錐(Taylor cone)，如圖 7 所示。此時當施加的電壓夠高，則液面尖端的靜電斥力會克服液體的表面張力，帶電液滴會從泰勒錐前端噴灑出去形成電噴灑現象。而在相對電場後接上質譜儀，帶電液滴則因電位差及真空差被引導進入質譜儀。進入質譜儀之前，帶電液滴在電場引導下於飛行過程中不斷與大量空氣接觸，溶劑不斷揮發造成液滴體積縮小，但是液滴所帶電荷數不變，因此液滴表面電荷密度升高產生庫倫斥力，當斥力大於表面張力時，帶電液滴會分裂成更小的液滴。當液滴內只含一個分析物分子以及溶劑被揮發光時，而原本液滴上的質子會留在分析物分子上，形成多價電荷的氣相離子進入質譜儀的質量分析器內進行質荷比分析。在 1984 年 Alksandrov, M.L.等人成功地將液相層析儀與電噴灑游離質譜法結接。電噴灑所用的溶劑需是具有極性，所以液相層析的移動相選擇相當受到限制，否則無法得到相當好的離子訊號。由於 ESI 具備了 concentration-dependent 的特性，微量的進樣系統可以有效的提升質譜偵測的靈敏度，進而可以減少樣品進樣量，分析微量樣品 62。此研究實驗使用奈米級液相層析質譜，參考 Goodlett, D.R.等人提出的 nano-LC 分流進樣裝置 63，裝置由 analytical column、trapping column 和連接兩根管柱的 microtee 組成。Microtee 以一小段毛細管接上提供高電壓的 metal union， 12.

(25) 透過 liquid junction 使 analytical column 進行電噴灑。分流裝置在 load mode 樣品會進入 trapping column 進行線上去鹽，而不會通過 analytical column，如圖 8 所示；在 inject mode，trapping column 和 analytical column 之間的 microtee 一端封住，使得樣品會往 analytical column 流去，而進入質譜儀分析，如圖 9 所示。經過此分流裝置，其電噴灑的流速約為 200 nL/min，以此分析生化大分子。經過 ESI 游離化的生化樣品離子進入到質譜儀後，經由質量分析器進行質荷比分析。本篇所使用的儀器為 LTQ XL (Thermo Scientific)其質量分析器為線性離子阱，如圖 10 所示，由環形離子阱所改良而成，其形狀如同四極桿(quadrupole)，內部儲存離子的容量較為傳統環形離子阱大，可提高訊號與離子累積數目，使得靈敏度更高。阱內空間變大進而減少空間電荷效應。這研究裡使用串聯式質譜法(MS/MS)來鑑定蛋白質，即當離子被捕捉在離子阱進行碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)得到更多資訊，如圖 11 所示。經由電壓的調控，僅留下特定質荷比的前驅離子(precursor ion)在離子阱內，並施加交流電壓使前驅離子獲得更大的動能，與阱內氣體氦氣碰撞使動能轉變為內能，當內能大於鍵能便會使前驅離子碎裂成產物離子碎片，透過串聯式質譜儀的分析，可從產物離子片段推測前驅離子的組成。胜肽離子與碰撞氣體進行碰撞誘導解離時，容易斷裂在胜肽鍵處，其離子片段的命名如圖 12 所示。經由所得到的同一系列離子片段的質量差距，可推算出前驅離子的序列組合，依此序列資訊去比對蛋白質資料庫中理論胜肽資訊的分法，稱為胜肽碎片指紋(peptide fragment fingerprinting, PFF)比對 64,65。. 13.

(26) (5) Label-free 蛋白質定量方法. 本論文實驗所使用的質譜分析方法為 shotgun proteomics，是以 bottom-up proteomics 的技術結合液相層析與質譜儀來鑑定蛋白質。將蛋白質混合物進行蛋白酶水解，經由液相層析分離之後，進入質譜進行串聯式質譜獲得具序列資訊之碎片分子進而鑑定出胜肽，比對蛋白質資料庫後而得到蛋白質的資訊，如圖 13 所示。由這些資訊來得知，每一個蛋白質的比對都有其胜肽圖譜數目。理論上，含量較多的蛋白質，水解成胜肽後被質譜所偵測到的機會比較大，所以胜肽圖譜數目也會比較多，利用這種觀點來做蛋白質間的相對定量。在定量方法上分有同位素標定與非同位素標定，同位素標定像是 SILAC、ICAT、TMT 和 iTRAQ 是用同位素標記的試劑來與胜肽反應，其因同位素的關係在相同胜肽離子分子量上有些許差異，在質譜儀上可以清楚的分析出其 m/z 值。而非同位素標定定量是本論文所使用的相對定量方法 label-free quantification，不用同位素的標記，由質譜分析完的圖譜資訊來做相對定量，其判斷有兩種方式為胜肽離子的訊號強度與胜肽離子經 MS/MS 分析的圖譜數目。依訊號強度來做相對定量，利用質譜在第一階段 MS 分析胜肽離子所得到的訊號強度來判斷，通常使用高解析的質譜來進行，以利於第一階段 MS 對複雜胜肽離子的分析。理論上含量高的蛋白質，其胜肽離子訊號強度會較強，因此不同樣品裡的相同胜肽離子依其訊號強度的不同來比較相對含量。而在這裡使用圖譜數目來判定(spectral counting)，含量高的蛋白質其胜肽離子經 MS/MS 分析的圖譜數會較多，因此兩個不同樣品的同個蛋白質可以藉著圖譜數目的比值來做相對定量。此定量方法的優點是不受限於定量的樣品數目，分析的動態範圍(dynamic range)也很廣；但其缺點為定量上準確度的問題，因含量低的蛋白質在分析上可能會受含量高的蛋白質遮蔽而影響其訊號。 14.

(27) 七、. 實驗動機與目標. Sunitinib 經研究顯示出對 AML 細胞株中表現出的 FLT3-ITD (FLT3-internal tandem duplication)的磷酸化有抑制的作用(IC50=21 nM)66，有效地抑制 MV4-11 的增殖組成。在 sunitinib 抑制 AML 的細胞株(MV4-11) 研究中，其作用機制除了抑制 FLT3 的磷酸化之外，想經由研究探討來發現或許還有其他相關訊號路徑會導致 MV4-11 細胞株減少增生或衰亡。化學蛋白質體學是門新的研究領域，其多數應用在生物醫學與藥物研發等方面。利用化學小分子做為一個工具在蛋白質樣品中找到其標的蛋白質經由質譜儀來鑑定出身分，基於這些標的蛋白質的功能，來探討蛋白質體以及蛋白質經過後轉譯修飾的研究。本論文主要的目的是利用化學蛋白質體學的策略在 MV4-11 中找到 sunitinib 的標的蛋白質，進一步探討 sunitinib 是否有其他的功能療效或是副作用。設計 sunitinib 成為活性為基礎的探針搭配親和性層析，利用 sunitinib 與特定蛋白質的親和力來捕獲候選的標的蛋白質，為了使捕獲到的蛋白質更具有可信度，實驗設計導入 negative 控制組當作背景值以去除非專一性鍵結之影響。使用一維膠體電泳可以直接觀察到差異並分離複雜樣品，接著以高靈敏度的奈米級液相層析電噴灑質譜儀系統分析，期望能檢測到更低含量的標的蛋白質。希望藉著這些標的蛋白質，透過生物資訊分析工具來彙整，可以找出一些與 sunitinib 相關的訊號路徑，進而研究發展出 sunitinib 的其他藥效或副作用，實驗總流程如圖 14 所示。. 15.

(28) 第二章實驗材料一、. 樣品. Biotinylated sunitinib (from ITRI) Bovine serum albumin (Sigma-Aldrich) MV4-11 cell pellet (from ITRI) Negative control compound (from ITRI). 二、. 藥品. 100-3 C18 (Macherey-Nagel) Ammonium bicarbonate (J.T. Baker) Ammonium persulfate (Bio-Rad) Bromophenol blue (Bio-Rad) Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad) D,L-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich) Ethylenediaminetetraacetic acid Glycine (Bio-Rad) Iodoacetamide (Sigma-Aldrich) Magic C18-AQ (Michrom Bioresources) Phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich) Porcine trypsin (Promega) Potassium chloride (J.T. Baker) 16.

(29) Potassium phosphate monobasic (Sigma-Aldrich) Protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) Sodium chloride (J.T. Baker) Sodium deoxycholate (Sigma-Aldrich) Sodium dodecyl sulfate (J.T. Baker) Sodium fluoride (Sigma-Aldrich) Sodium orthovanadate (Sigma-Aldrich) Sodium hydroxide (J.T. Baker) Sodium phosphate dibasic (J.T. Baker) Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Bio-Rad). 三、. 試劑. 40% acrylamide/bis solution 37.5:1 (2.6% C) (Bio-Rad) Acetic acid (Sigma-Aldrich) Acetonitrile (Merck) Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad) Ethanol (J.T. Baker) Formic acid (J.T. Baker) Glycerol (Sigma-Aldrich) Hydrochloric acid (J.T. Baker) Isopropyl alcohol (J.T. Baker) Methanol (Merck) NP40-IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) 17.

(30) N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (Bio-Rad) Prestained Protein Ladder (PageRulerTM). 四、. 儀器設備. 試管震盪器 (Scientific Industries, G-560) 超純水系統 (Millipore Direct-Q3) 酸鹼度計 (METTLER TOLEDO, EL20) 微量分析天平 (METTLER TOLEDO, AL104) 可見光譜盤式分析儀 (Thermo Scientific, Multiskan FC) 搖擺震盪器 (Tks, RS01) 桌上型吸引器 (DOCTOR’S FRIEND, DF-506) 桌上型離心機 (WHALE, pc-200) 超高速低溫離心機 (Hitachi, CT15RE) 真空離心式濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00) 迷你電泳槽系統 (Bio-Rad Mini-PROTEIN System) 電磁加熱攪拌機 (IKA WERKE, C-MAG HS7) 數字型恆溫乾浴槽 (Major Science, MD-02N-110) 超音波震盪洗淨器 (DELTA, DC150H) Agilent 1200 series HPLC (Agilent) ACUQITY Ultra Performance LC (Waters) UV-Vis-NIR spectrometer Agilent 8453 (Agilent) LTQ XL mass spectrometer (Thermo Scientific). 18.

(31) 五、. 耗材. Amicon® Ultra-0.5, 3 kDa (Millipore) Poly-Prep® Chromatography Column (Bio-Rad). 19.

(32) 第三章實驗方法一、. 1.. 溶液配製. RIPA buffer: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 75 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM NaF, 0.125% Sodium deoxycholate, 1% NP40, 1 mM PMSF, 1 mM SOV, 1X PI. 2.. 10X PBS: pH 7.4, 27 mM KCl, 1.4 M NaCl, 18 mM KH2PO4, 100 mM Na2HPO4. 3.. 10 mM PB: 10 mM KH2PO4 (pH 7.43). 4.. 2X sample buffer: 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue, 4% SDS, 200 mM DTT. 5.. 10X running buffer: 0.25 M Tris, 1.92 M glycine, 1% SDS. 6.. Coomassie stain buffer: 0.1% coomassie R-250, 40% ethanol, 10% acetic acid. 7.. Destain buffer: 7% acetic acid, 25% methanol. 二、. MV4-11 的蛋白質萃取. 樣品是來自於工業技術研究院柯景懷博士所提供的 MV4-11 沉澱細胞 (cell pellet)，收到的沉澱細胞每管細胞數約為 5 х 107。MV4-11 為人類急性骨髓性白血病(AML)的細胞株。. 1.. 配置細胞裂解用的 RIPA buffer 10 mL。配方如表 1 所示。 20.

(33) 2.. 在細胞數約 5 х 107 的沉澱細胞中加入 1 mL 的 RIPA buffer，將其混合均勻之後，架於試管震盪器上在 4℃下搖晃 1 小時。. 3.. 搖晃完，放進超高速低溫離心機用 12000 x g 離心 30 分鐘。. 4.. 取出上清液於新的 tube 中，冰於-20℃下備用。. 三、. 1.. 蛋白質濃度測定. 配製濃度 80 μg/mL 的 BSA，以序列稀釋的方法得到不同濃度 BSA 的標準品 80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、 15 μg/mL、10 μg/mL 與 0 μg/mL。. 2.. 粗略估計蛋白質量並取 MV4-11 細胞裂解液稀釋為待測樣品 1/300X。. 3.. 取各 BSA 標準品 80 μL 與待測樣品 80 μL 分別吸進新的 tube 中。. 4.. 於 BSA 標準品與待測樣品中加入 20 μL protein assay dye reagent，震盪搖晃均勻後，靜置 10 分鐘。. 5.. 取 100 μL 的標準品與待測樣品至 96-well 孔盤。. 6.. 放進可見光譜盤式分析儀，量測 595 nm 波長吸收值。. 7.. 以 OD595 吸收值和 BSA 標準品濃度為座標作圖，得到蛋白質濃度標準曲線。. 8.. 將待測樣品的吸收值帶入標準曲線中推算，可得 MV4-11 細胞裂解液之蛋白質濃度。. 21.

(34) 四、. 製備親和性管柱. (1) 固定 sunitinib 於 streptavidin beads. 1.. 配製 10X PBS，在使用前稀釋為 1X PBS。. 2.. 取 streptavidin beads 100 μL 於 Poly-Prep® Column 中，以桌上型吸引器的低壓幫浦抽氣過濾，並以 1X PBS 200 μL 沖洗五次置換掉保存溶液。. 3.. 加入 10 mM biotinylated sunitinib 5 μL 與 1X PBS 400 μL 在 4℃下攪拌混合 2 小時，形成 sunitinib-beads。. 4.. 以 10 mM PB 200 μL 沖洗五次洗掉未鍵結上的 biotinylated sunitinib 及置換溶液，放置於 4℃下保存備用。. (2) 固定 negative control compound 於 streptavidin beads. 1.. 取 streptavidin beads 100 μL 於 Poly-Prep® Column 中，以桌上型吸引器的低壓幫浦抽氣過濾，並以 1X PBS 200 μL 沖洗五次置換掉保存溶液。. 2.. 加入 10 mM negative control compound 5 μL 與 1X PBS 400 μL 在 4 ℃下攪拌混合 2 小時，形成 negative-beads。. 3.. 以 10 mM PB 200 μL 沖洗五次洗掉多餘的 negative control compound 及置換溶液，放置於 4℃下保存備用。. 22.

(35) 五、. 1.. 活性探針固定於管柱中含量的測定. 配置標準品，取 6.68 mL milli-Q H2O 於 15 mL tube 裡，加入 10 mM biotinylated sunitinib 10 μL 標籤上 10 ppm。. 2.. 以配置好的 10 ppm biotinylated sunitinib 標準品，序列稀釋成 5 ppm、 2.5 ppm、1.25 ppm、0.625 ppm 和 0 ppm。. 3.. 取 streptavidin beads 200 μL 於 Poly-Prep® Column 中，以桌上型吸引器的低壓幫浦抽氣過濾，並以 1X PBS 200 μL 沖洗五次置換掉保存溶液。. 4.. 置換完後加入 1X PBS 1 mL 以及 10 mM biotinylated sunitinib 8 μL 在 4℃下攪拌混合 2 小時。. 5.. 混合完後用 1 mL milli-Q H2O 沖洗三次，共收集 4 mL 洗滌液。. 6.. 將六個濃度的標準品以及洗滌液樣品依序吸取進石英管，使用 UV-Vis spectrometer Agilent 8453 選擇波長 200-500 nm 進行測量。. 六、. MV4-11 細胞裂解液測試. (1) MV4-11 細胞裂解液與親和性管柱作用. 1.. 將 MV4-11 細胞裂解液經過蛋白質濃度測定後，推算所得到的濃度及蛋白質的總量。. 2.. 分別取 3 mg 的 MV4-11 細胞裂解液至 Poly-Prep® Column 中與 sunitinib-beads 和 negative-beads 作用。. 3.. 再加入 10 mM PB 使最後體積為 400 μL，在 4℃下攪拌混合 2 小時。 23.

(36) (2) 親和性洗滌與洗脫. 1.. 將混合完的 MV4-11 細胞裂解液和 sunitinib-beads 以低壓幫浦抽氣並以 10 mM PB (pH 7.43) 100 μL 沖洗收集 500 μL 洗滌液。. 2.. 重複步驟 1.兩次，共收集得到三管 500 μL 的洗滌液，標籤上 wash 1-1、 wash 1-2 和 wash 1-3。. 3.. 以提高 pH 值後的 10 mM PB (pH 8.73) 100 μL 抽氣沖洗五次，收集 500 μL 洗滌液。. 4.. 重複步驟 3.兩次，共收集得到三管 500 μL 的洗滌液，標籤上 wash 2-1、 wash 2-2 和 wash 2-3。. 5.. 以 500 mM NaCl + 10 mM PB (pH 8.74) 100 μL 抽氣沖洗五次，收集 500 μL 洗滌液。. 6.. 重複步驟 5.兩次，共收集得到三管 500 μL 的洗滌液，標籤上 wash 3-1、 wash 3-2 和 wash 3-3。. 7.. 加入 1% SDS 100 μL，在室溫下震盪 30 分鐘。. 8.. 以 milli-Q H2O 200 μL 抽氣沖洗六次，收集 1300 μL 的洗脫液，標籤上 elution。. 9.. 混合完的 MV4-11 細胞裂解液和 negative-beads 洗滌洗脫方法皆同上。. (3) 各洗滌液和洗脫液之去鹽濃縮. 1.. 使用 Amicon® Ultra-0.5, 3 kDa，加入 400 μL 的各洗滌液與洗脫液於內管中利用超高速低溫離心機 14000 x g 離心 20 分鐘，將收集管內得到的過濾液體丟棄。 24.

(37) 2.. 重複步驟 1.直到洗滌液與洗脫液全部加完。. 3.. 加入 milli-Q H2O 至體積 400 μL，以 14000 x g 離心 20 分鐘進行去鹽三次。. 4.. 將 Amicon® Ultra-0.5 內管倒置於新的收集管中，以 1000 x g 離心 2 分鐘。. 5.. 將收集管內的液體吸出至新的 tube，以真空離心式濃縮機抽乾樣品，並冰於-20℃備用。. 七、. 一維膠體電泳. (1) 製備膠片與樣品準備. 1.. 取 0.75 mm 電泳用玻璃片以水和甲醇洗乾淨並靜置風乾。. 2.. 將風乾後的玻璃片裝置於專用的架臺上。. 3.. 於 15 mL 離心管中配製分離膠體，製備 10%的凝膠，試劑配方如表 2A 所示。APS 為自由基生成試劑是凝膠的起始劑，所以需最後加入。. 4.. APS 加入後，將其震盪搖晃均勻，以 pipette 吸取注入玻璃片內，使膠體溶液液面到玻璃片的 3/4 高度後，在液面上加入異丙醇來壓平膠體。. 5.. 等待半小時膠體凝固後，將剩餘異丙醇倒出並以拭淨紙吸乾。. 6.. 配製焦集膠體，其試劑配方如表 2B 所示。. 7.. 同上，混合均勻後，以 pipette 吸取注入玻璃片內，使膠體溶液填滿玻璃片。. 8.. 在液面上方裝入樣品槽齒模，等待半小時膠體凝固後即完成膠片製作。 25.

(38) 9.. 抽乾後的樣品以 milli-Q H2O 回溶。wash 1 的部分以 600 μL 回溶取 10 μL 至新 tube 備用，wash 2 和 wash 3 的部分以 20 μL 回溶取 10 μL 至新 tube 備用，elution 的部分以 10 μL 回溶備用。. 10. 各樣品加入 10 μL 的 2X sample buffer 在 95℃下加熱 5 分鐘。 11. 放置室溫下回溫後加入膠片樣品槽內進行膠體電泳分析。. (2) 膠體電泳分析. 1.. 進行分析前先取 10X running buffer 50 mL 稀釋成 1X running buffer 500 mL。. 2.. 將製備好的膠片同玻璃片裝置於電泳主槽心，倒入 1X running buffer 填滿整個主槽心。. 3.. 在主槽心外加入重複使用的 1X running buffer 使液面到電泳槽外標記的標線。. 4.. 吸取樣品至膠片之樣品槽內，添加完後接上電極，黑色為負極、紅色為正極，連接電源供應器。. 5.. 開啟電源，設定參數為時間 90 分鐘，固定電壓 100 V。. 6.. 等時間到後，樣品中之藍色染劑到達膠片底端即停止電泳，關掉電源，拆下電極連線。. (3) 膠片染色與褪染. 1.. 完成電泳後的膠片從玻璃片上取下，放入 coomassie stain buffer 中，染色 1 小時。. 2.. 將 coomassie stain buffer 倒掉，使用 milli-Q H2O 沖洗膠片三次。 26.

(39) 3.. 加入 destain buffer，放置於搖擺震盪器上褪染 10 小時至膠片背景呈透明，而有蛋白質處則呈現藍色帶狀。. 八、. 膠體內水解. (1) 膠片切下褪染. 1.. 將各 elution 的泳道平均切十等分的膠體，其對照 Prestained Protein Ladder 分子量範圍約略為 170 kDa 以上、170-100 kDa、100-70 kDa、 70-55 kDa、55-40 kDa、40-37 kDa、37-30 kDa、30-25 kDa、25-20 kDa、20 kDa 以下，如圖 20 所示。. 2.. 切下的膠片部分分別細切成 1 mm x 1mm 裝入 tube 中，並加入 100 mM ABC 200 μL 在室溫下震盪 20 分鐘，然後吸出液體丟棄。. 3.. 加入 25 mM ABC + 50% ACN 200 μL 震盪 20 分鐘進行褪染，吸出液體丟棄，重複此步驟直到膠體碎片成透明狀。. 4.. 以 ACN 100 μL 震盪 10 分鐘吸乾膠體，吸出液體丟棄，並以真空離心式濃縮機抽乾膠體。. (2) 還原與烷基化. 1.. 於膠體中加入 25 mM ABC + 10 mM DTT 100 μL，於 60℃下還原 1 小時。. 2.. 吸出液體丟棄，加入 ACN 100 μL 震盪 10 分鐘吸乾膠體。. 3.. 吸出液體丟棄，以真空離心式濃縮機抽乾膠體。. 4.. 加入 25 mM ABC + 50 mM IAA 100 μL，在黑暗中震盪 45 分鐘。 27.

(40) 5.. 吸出液體丟棄，加入 ACN 100 μL 震盪 10 分鐘吸乾膠體。. 6.. 吸出液體丟棄，以真空離心式濃縮機抽乾膠體。. (3) 胰蛋白酶水解. 1.. 每管樣品先加入 0.1 μg/μL trypsin 1 μL 讓收乾的膠體吸入。. 2.. 再加入 10 mM ABC 80 μL，在 37℃下水解 16 小時。. (4) 膠體內萃取胜肽. 1.. 取出水解後的溶液至新的 tube 中。. 2.. 加入萃取溶液 50% ACN + 5% FA 50 μL 在室溫下震盪 20 分鐘，然後吸取至 tube 內。. 3.. 重複步驟 2.兩次來回收胜肽。. 4.. 將萃取液以真空離心式濃縮機抽乾。. 5.. 以 mobile phase A (1% ACN + 0.1% FA)回溶進行質譜分析。. 九、. 液相層析串聯質譜分析. (1) 樣品進樣前處理. 經過胰蛋白酶水解後的樣品以液相層析的移動相 mobile phase A (1% ACN + 0.1% FA) 50 μL 回溶 30 分鐘，再取 5 μL 至專用的樣品瓶，經由電腦控制進行自動化分析。. 28.

(41) (2) HPLC 之逆相層析管柱. Trapping column: Magic C18-AQ, particle size 5 μm, pore size 200 Å , 100 μm I.D. × 20 mm L 1.. 取一段內徑 100 μm 約 13 公分的毛細管，其毛細管前端預先填入約 0.2 cm 之 Si60 以高溫火焰鍛燒使之燒結。. 2.. 取 1 mg 5 μm, pore size 為 200 Å 的 Magic C18-AQ 於小玻璃瓶中加入攪拌子以及甲醇，放置在 pressure bomb 中於電磁加熱器上攪拌。. 3.. 將未燒結的毛細管端，穿過 pressure bomb 浸入含有甲醇及 C18 粒子的小玻璃瓶中而不碰到底部，並把毛細管鎖緊。. 4.. 打開氣體鋼瓶壓力閥，提供一個背壓進行管柱的填充。. 5.. 當填充的長度至 2 公分後，關掉氣體鋼瓶的壓力，並把毛細管微微拉起，使剩餘氣體將毛細管內的甲醇吹乾。. 6.. 當沒有液珠從毛細管冒出時，拔出毛細管即製備完成。. Analytical column: 100-3 C18, particle size 3 μm, pore size 100 Å , 75 μm I.D. × 100 mm L 1.. 取一段內徑 75 μm 約 16 公分的毛細管，其毛細管一端接上重物以高溫火焰定點鍛燒，因毛細管末端受到高溫及重物的拉力而拉尖成細針狀。. 2.. 取 1 mg 3 μm, pore size 為 100 Å 的 100-3 C18 於小玻璃瓶中加入攪拌子以及甲醇，放置在 pressure bomb 中於電磁加熱器上攪拌。. 3.. 將未拉尖的毛細管端，穿過 pressure bomb 浸入含有甲醇及 C18 粒子的小玻璃瓶中而不碰到底部，並把毛細管鎖緊。. 4.. 打開氣體鋼瓶壓力閥，提供一個背壓進行管柱的填充。 29.

(42) 5.. 當填充的長度至 10 公分後，關掉氣體鋼瓶的壓力，並把毛細管微微拉起，使剩餘氣體將毛細管內的甲醇吹乾。. 6.. 當沒有液珠從毛細管冒出時，拔出毛細管即製備完成。. (3) HPLC 之移動相梯度設定. Mobile phase A: 1% ACN + 0.1% FA Mobile phase B: 99% ACN + 0.1% FA 經由自動進樣系統吸取樣品 5 μL 注入，六向閥調至 load mode，如圖 8 所示，樣品會進入 trapping column，流速為 10 μL/min，2% mobile phase B 持續 5 分鐘進行線上去鹽濃縮。接著六向閥調為 inject mode，如圖 9 所示，因為分流進樣裝置，流速改變約為 200 nL/min，在 38 分鐘內梯度為 2-40% mobile phase B，樣品進入 analytical column 進行分離。梯度為 40-80% mobile phase B 進行 5 分鐘，維持在 80% mobile phase B 5 分鐘。梯度 80-2% mobile phase B 進行 5 分鐘，持續 2% mobile phase B 平衡 20 分鐘。最後六向閥調至 loading mode，流速變回 10 μL/min，以 2% mobile phase B 平衡 5 分鐘，HPLC 移動相梯度表如表 3 所示。. (4) UPLC 之逆相層析管柱. Trapping column: Symmetry® C18, particle size 5 μm, pore size 300 Å , 180 μm I.D. x 20 mm L (Waters) Analytical column: BEH130, particle size 1.7 μm, pore size 130 Å , 100 μm I.D. x 100 mm L (Waters). 30.

(43) (5) UPLC 之移動相梯度設定. Mobile phase A: 100% milli-Q H2O + 0.1% FA Mobile phase B: 100% ACN + 0.1%FA 經由自動進樣系統吸取樣品 5 μL 注入，流速為 450 nL/min，樣品進入 analytical column，以 2% mobile phase B 持續 15 分鐘進行線上去鹽，之後在 38 分鐘內梯度為 2-40% mobile phase B。梯度為 40-80% mobile phase B 進行 2 分鐘，維持在 80% mobile phase B 10 分鐘。梯度 80-2% mobile phase B 進行 1 分鐘，持續 2% mobile phase B 平衡 24 分鐘。UPLC 移動相梯度表如表 4 所示。. (6) LTQ XL 質譜參數設定. 使用 LTQ 質譜控制軟體 Xcalibur version 2.1 以數據相關擷取模式(data dependent acquisition)搭配動態排除功能(dynamic exclusion)，根據我們想要得到的資訊，設定條件給質譜進行分析。於 survey scan 掃描質荷比 350-2000 m/z 中選取訊號強度高的前驅離子進行 zoom scan 確認價數後，再進行質譜/質譜分析(MS/MS analysis)。. 31.

(44) HPLC 搭配質譜參數設定 (Scan Event 1) MS1: survey scan Scan range: 350-2000 m/z (Scan Event 2) zoom scan: 從 MS1 中選取第一強的離子進行 zoom scan Reject charge state: 1 Repeat count: 2 Repeat duration (s): 30 Exclusion duration (s): 180 (Scan Event 3) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 Scan Range: 350-2000 m/z Collision energy: 35% Activation time (ms): 30 (Scan Event 4) zoom scan: 從 MS1 中選取第二強的離子進行 zoom scan (Scan Event 5) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 (Scan Event 6) zoom scan: 從 MS1 中選取第三強的離子進行 zoom scan (Scan Event 7) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描. 32.

(45) UPLC 搭配質譜參數設定 (Scan Event 1) MS1: survey scan Scan range: 350-2000 m/z (Scan Event 2) zoom scan: 從 MS1 中選取第一強的離子進行 zoom scan Reject charge state: 1 Repeat count: 2 Repeat duration (s): 30 Exclusion duration (s): 120, and 20 (Scan Event 3) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 Scan range: 350-2000 m/z Collision energy: 35% Activation time (ms): 30 (Scan Event 4) zoom scan: 從 MS1 中選取第二強的離子進行 zoom scan (Scan Event 5) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 (Scan Event 6) zoom scan: 從 MS1 中選取第三強的離子進行 zoom scan (Scan Event 7) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 (Scan Event 8) zoom scan: 從 MS1 中選取第四強的離子進行 zoom scan (Scan Event 9) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描 (Scan Event 10) zoom scan: 從 MS1 中選取第五強的離子進行 zoom scan (Scan Event 11) MS2: 離子擊碎進行二次質譜掃描. 33.

(46) 十、. 蛋白質資料庫搜尋. 利用質譜分析所得到的圖譜使用 Proteome Discoverer version 1.1.0.263 (Thermo Fisher Scientific Inc.)軟體來進行蛋白質身分鑑定。資料庫搜尋的引擎為 Mascot。. 資料庫搜尋參數設定: Database: SwissProt_v2012_07 (536,789 sequences; 190,518,892 residues) Taxonomy: Homo sapiens Enzyme: Trypsin Mass scan: 350-2000 m/z Peptide charge: 2+, 3+, and 4+ Fixed modification: Carbamidomethylation (C) Variable modification: Oxidation (M) Peptide mass tolerance:. 1.5 Da. Fragment mass tolerance:. 0.6 Da. Max missed cleavages: 1 Instrument type: ESI-TRAP. 十一、 Spectral counting. 使用 Microsoft Excel 挑選出兩組共同鑑定到的蛋白質。將 sunitinib 組的圖譜數除以 negative control 組的圖譜數所得到的比值為(spectral counts)。 34.

(47) 第四章實驗結果與討論一、. MV4-11 的蛋白質萃取. 人類急性骨髓性白血病細胞株 MV4-11 經過細胞培養收集得到一定量的細胞，將細胞刮下來清洗並經過高速離心後，去除上清液，收集剩下的沉澱細胞(cell pellet)。為了不讓蛋白質在運送過程中有再次回溶的現象導致活性降低，所以自行配製 RIPA buffer 來進行蛋白質的萃取。從工業技術研究院收到的 MV4-11 沉澱細胞每管細胞數約 5 х 107，因此需加入足夠量的 RIPA buffer 使細胞內的蛋白質能盡量萃取出來，這裡選用加入 1 mL RIPA buffer。想要有效破除細胞膜萃取出蛋白質，通常 RIPA buffer 成份裡會有一些低濃度的界面活性劑(NP40 & Sodium deoxycholate)，加入蛋白酶抑制劑與磷酸化抑制劑來防止在細胞裂解的過程中蛋白質被酵素水解掉。在不同樣品中，RIPA buffer 會有不同的配方，怕影響後續蛋白質濃度測定故沒選用 SDS 等強力的界面活性劑。化學蛋白質體學研究中，與藥物或活性小分子有相互作用的標的蛋白質大部分為膜蛋白，而界面活性劑的加入有助於膜蛋白的萃取。加入 RIPA buffer 1 mL 與沉澱細胞混合震盪均勻，經 12000 x g 高速離心後，可發現有白色沉澱物於 tube 底下，是細胞裂解後的胞器，而被提取出的蛋白質應溶於緩衝溶液中，於是取上清液測定蛋白質濃度。. 35.

(48) 二、. 蛋白質濃度測定. 進行親和性層析之前，sunitinib 組與 negative 控制組只改變一個參數來進行實驗，一開始需取同樣的蛋白質起始量。MV4-11 細胞裂解液經過 Bradford Protein Assay 來定量蛋白質，其定量的原理是利用 Coomassie Brilliant Blue G-250 會與四級結構的蛋白質結合特性，與蛋白質結合後 G-250 會從茶色轉變為藍色，在 595 nm 的波長下會有較高的吸收。藍色越深者其吸收值越高，表示蛋白質含量越多。牛血清蛋白(BSA)各濃度的標準品與稀釋 300 倍的 MV4-11 細胞裂解液同時進行定量，將所偵測到的 BSA 標準品吸收值，如表 5A 所示，以 Microsoft Excel 繪出濃度與吸收值的檢量線圖，X 軸為 BSA 標準品濃度， Y 軸為 OD595 吸收值，如圖 15 所示，當 R2 值達到 0.99 以上，表示有良好的線性關係，再把稀釋的樣品吸收值帶進檢量線的公式中，可以推算出 MV4-11 細胞裂解液的濃度及蛋白質含量。如表 5B 所示。蛋白質萃取後所得到的 MV4-11 細胞裂解液經過 Bio-Rad Protein Assay 定量，蛋白質含量約有 3912 μg，確認了使用自行配製的 RIPA buffer 進行萃取的方法是可行的。然而實驗上所用的蛋白質量較多，在這邊僅以一管 MV4-11 細胞裂解液樣品的定量做為代表，其餘的樣品定量方式皆相同，而所得到的蛋白質量約有 1-3 mg 不等。. 三、. 親和性管柱. 近期研究中，親和性層析的應用於很多方面都有發展，其在於想要研究的方向為何，使管柱內填充的材質在選擇上會有所變化。本篇論文所選 36.

(49) 用的固相載體是鏈黴卵白素樹脂(streptavidin beads)與生物素(biotin)具有很強的非共價鍵結力，可以快速地將活性為基礎的探針固定於載體上。在其他相關研究當中 streptavidin 與 biotin 也是很常被使用做為純化的材料，因為其具有專一性以及很強的鍵結力。 Streptavidin beads 是向 GE Healthcare 所購買，其中所附上的說明書裡頭有提到 streptavidin beads 能鍵結的 biotin 含量，biotin binding capacity > 300 nmol/mL，這表示說每 1 mL 的 streptavidin beads 可以鍵結大於 300 nmol 的 biotin。所以為了確認本文中所設計的活性為基礎的探針可以順利固定於 streptavidin beads 以及固定上的含量，做了個實驗測試。實驗方法及步驟於第三章之五有詳細介紹，因 biotinylated sunitinib 為黃色溶液，由互補色的觀點來推測其吸收波長會在紫外光區，所以先取 10 ppm biotinylated sunitinib 標準品利用 UV-Vis spectrometer. Agilent. 8453 進行一段波長範圍(200-500 nm)的掃描，測得在 368 nm 的地方有一明顯吸收峰，如圖 16 所示。將所偵測到的各濃度標準品的 UV-Vis 吸收值，如表 6A 所示，由 Microsoft Excel 繪製濃度與吸收值的檢量線圖，X 軸為 biotinylated sunitinib 標準品濃度，Y 軸為 UV-Vis 368 nm 吸收值，如圖 17 所示。同樣地，當 R2 值達到 0.99 以上，表示有良好的線性關係，再把樣品吸收值帶進檢量線的公式中，可以推算出在洗滌液中 biotinylated sunitinib 的含量約有 25.52 nmol。如表 6B 所示。因此由所取的 biotinylated sunitinib 總量再回推至管柱中的含量為 54.48 nmol，鍵結量在 200 μL streptavidin beads 中為 272.4 nmol/mL，說明了 biotinylated sunitinib 不但可以順利鍵結上 streptavidin beads，且鍵結量也與說明書上寫的接近。 Negative control compound 本身也有合成上 biotin，推測在管柱的固定化上，應也有類似的結果。. 37.

(50) 四、. 親和性層析. 本篇論文中使用以活性為基礎的探針搭配親和性層析，經過一系列緩衝溶液的洗滌與洗脫，來捕獲候選標的蛋白質。此方法可以去除掉大量非特異性的蛋白質，以純化標的蛋白質，然而經由探針所抓取的蛋白質是否真的與 sunitinib 有相關聯的蛋白質，需要進一步進行分析探討。考慮到探針會因為結構上使得非特異性蛋白質被鑑定到，因此在實驗設計上分成了 sunitinib 組與 negative 控制組進行同步實驗。Sunitinib 組是以 sunitinib 為探針，而 negative 控制組是以與 biotinylated sunitinib 結構相似的 negative control compound 為探針，其他實驗條件與步驟皆相同，想依此設計以 negative 控制組當作對照組來扣除掉非專一性鍵結的影響。經由親和性層析純化過後的洗滌液與洗脫液，利用一維膠體電泳蛋白質分離方式分離，在膠片上直接觀察其差異的部分，可以看出經過與沒經過親和性層析純化的蛋白質差異性在哪，並可降低其複雜度以利於質譜分析。. (1) Sunitinib 與 negative control compound 之討論. 在實驗設計中，希望設計出大部分標靶藥物皆適用的探針模式，因此將 sunitinib 合成上 biotin，藉著 biotin 與 streptavidin 強力的非共價鍵結，以利於進行後續的純化以及標的蛋白質的搜尋。考慮到 sunitinib 與生化分子之鍵結位置和角度是位於 indole 與 pyrrol 之部位，為了不影響活性位置與蛋白質的作用，故 biotin 合成位置選擇於 N-(2-diethylaminoethyl)。 Negative control compound 結構上與 biotinylated sunitinib 相似亦有合成上 biotin 利於純化，然而與蛋白質作用的一端為苯環，推測其分子結構小 38.

(51) 所能鍵結上標的蛋白質的能力較弱。因此標靶藥物探針的設計搭配 negative control compound 作為實驗控制組，希望可以有效地減少非特異性蛋白質鍵結之影響。. (2) MV4-11 細胞裂解液與 sunitinib-beads 之洗滌部分. 由第三章之六的實驗方法來看，sunitinib 組的洗滌液 wash 1、wash 2 和 wash 3 個別收集三管，加起來總共有九管以 SDS-PAGE 進行蛋白質分離，如圖 18 所示。想要使蛋白質的的色帶清楚呈現，需先經由蛋白質定量方法定量 MV4-11 的濃度，取出蛋白質量 50 μg，由 SDS-PAGE 分析可使解析度達到最佳。膠片上第一個泳道是取 50 μg 未經過親和性層析的 MV4-11 細胞裂解液，想要來與洗滌下來的蛋白質比較差異。蛋白質在與 sunitinib-beads 混合時使用 10 mM PB (pH 7.43)，我們實驗設計第一階段洗滌 10 mM PB (pH 7.43)，第二階段 10 mM PB (pH 8.73)提高些微 pH 值使蛋白質自身電荷受到改變，降低與活性探針的親和力來洗出作用力較弱的蛋白質，第三階段 500 mM NaCl + 10 mM PB (pH 8.74)提高了離子濃度破壞蛋白質間鹽橋的作用力，增加蛋白質的溶解度達到有效的洗滌。由 SDS-PAGE 結果得知，大部分的蛋白質在第一階段就被洗下來，為了讓蛋白質有好的解析度，50 μg 為實驗起始量 3 mg 的 1/60，所以 wash 1-1~3 會取 1/60 進行電泳，wash 2-1~3 和 wash 3-1~3 則是取 1/2 的量。在 wash 1 的部分依照洗滌的次數越多，其洗滌下來的蛋白質量越少， wash 2 也是一樣的結果。Wash 3 的部分，蛋白質量可能低於庫瑪西染劑的偵測極限，所以沒有顯色於膠片上。經過這些洗滌的步驟，說明了非特異性的蛋白質大致上都被沖洗下來，而在 wash 3 洗下的蛋白質量已經很. 39.

(52) 少，甚至沒有。親和性管柱會再進行洗脫的步驟，將與 sunitinib 鍵結的蛋白質洗脫下來。. (3) MV4-11 細胞裂解液與 negative-beads 之洗滌部分. Negative 控制組同 sunitinib 組一樣分為 wash 1、wash 2 和 wash 3 個別收集三管，總共九管進行 SDS-PAGE 蛋白質分離，如圖 19 所示，其洗滌的步驟與 sunitinib 組相同。在 SDS-PAGE 結果來看，大部分的蛋白質亦是在第一階段被洗下來，所以 wash 1-1~3 會取 1/60 進行電泳，wash 2-1~3 和 wash 3-1~3 則是取 1/2 的量。膠片上第一個泳道是取 50 μg 未經過親和性層析的 MV4-11 細胞裂解液做為比對。在 wash 1 和 wash 2 的部分，依照洗滌的次數越多，洗滌下的蛋白質量越少。在 wash 3 的部分，已經沒有被庫瑪西染劑偵測到，說明經過這些洗滌後，非特異性的蛋白質幾乎都被洗下來。接著將親和性管柱進行洗脫，將還有鍵結在上的蛋白質洗脫下來。. (4) MV4-11 細胞裂解液與 sunitinib-beads 和 negative-beads 之洗脫部分. 經過洗滌過程後的兩管親和性管柱，sunitinib 組和 negative 控制組，以 1% SDS 界面活性劑做為洗脫溶液，使蛋白質變性、結構破壞從 sunitinib 及 negative control compound 上脫落，接著以 milli-Q H2O 把蛋白質給沖洗下來，利用 SDS-PAGE 進行蛋白質分離，如圖 20 所示。由 SDS-PAGE 結果得知，在 wash 3 的部分幾乎沒有蛋白質被洗滌下來，而在 sunitinib 組和 negative 控制組的洗脫部分有明顯的色帶呈現，可見被抓取的蛋白質被洗脫下來。由膠片結果來看只能粗略地觀察，所以將 sunitinib 組與 40.

(53) negative 控制組洗脫部分的膠片泳道各自平均分成 10 等分以減少複雜度，進行膠體內水解，以奈米級液相層析質譜儀分析，經由蛋白質資料庫搜尋會得到 sunitinib 組與 negative 控制組的蛋白質詳細清單。. 五、. 蛋白質數據處理. 由奈米級液相層析質譜儀分析完的 sunitinib 組與 negative 控制組的洗脫部分，將所得到的質譜譜圖資訊(圖 21，以 CD44 胜肽序列 ALSIGFETCR 之 MS/MS 譜圖作為代表)，以 Proteome Discoverer 軟體進行搜尋。在膠體內水解的時候，將膠片泳道分為 10 等分，而為了得到全部蛋白質的資訊，個別把 10 個經質譜分析的檔案彙整在一起搜尋，所得到 sunitinib 組與 negative 控制組的兩份蛋白質清單。在想要驗證 sunitinib 的標的蛋白質，將 sunitinib 組與 negative 控制組以 spectral counting 的方法來進行相對定量，把 sunitinib 組的蛋白質其所鑑定到的 MS/MS 圖譜數當作分子，和 negative 控制組的同個蛋白質所鑑定到的 MS/MS 圖譜數當作分母，相除得到一個比值(spectral counts)，而這比值大於 1 或是不可相除者，即表示為在 sunitinib 組中所抓取到含量較多或特有的蛋白質。可由此得到一份新的蛋白質清單，選出比值大於 1.5 與不可相除的蛋白質，其為可信度較高的標的蛋白質，共挑選出 167 個只有 biotinylated sunitinib 探針抓取到的蛋白質如表 7 所示(第一次重複結果)， 81 個比值大於 1.5 的蛋白質如表 8 所示(第一次重複結果)。這些被選出來的蛋白質，還不能確定與 sunitinib 有相關聯，需要透過生物資訊分析的工具進行探討以及後續的確認實驗(validation)。本實驗使用 spectral counting 的方法是基於 MS/MS 分析的圖譜數目來進行相對定量，因此在質譜參數設定的改變下，也會影響到 MS/MS 所 41.