實驗方法

(一) 大白鼠初代肝細胞之分離與培養

1、 肝細胞之分離 (Hepatocyte isolation)

大白鼠肝細胞分離係依據Berry 與 Friend (1969)和 Bonney (1974)等人所發 表，再經Lii 與 Hendrich (1993)加以適度修正之方法，採用兩階段膠原蛋白酶灌 流法(two-step collagenase perfusion)分離肝細胞。

方法如下：大白鼠以腹腔注射(i.p.) sodium pentobarbital (80 mg/kg body weight)，麻醉後，剪開腹腔，使用頭皮針經由肝門靜脈灌流。第一階段灌流，先 以 150 ml 灌流液Ⅰ (含 EBSS、0.75 mM EGTA、100,000 unit/L penicillin、100,000 μg/L streptomycin, pH 7.38)，在 25 ml/min 流速下，將肝臟中的血液灌洗出；接 著，進入第二階段灌流，使用 200 ml 灌流液Ⅱ (含 EBSS、10 mM HEPES、1.8 mM CaCl2．2H2O、0.8 mM MgCl2．6H2O、100,000 unit/L penicillin、100,000 μg/L streptomycin 與 50 mg 膠原蛋白酶(Collagenase typeⅠ，pH 7.38)，並將灌流的速 度降至20 ml/min，約 10 分鐘灌流消化後，肝臟變軟且失去彈性，細胞間隔也會 放大，外觀顏色上則逐漸變淡，此時小心將肝臟剪下，移出體外並置放於過濾尼 龍網上(200 μm, Tetko)，以 suspension solution (含 10 mM HEPES、2.6 mM sodium bicarbonate、1μM dexamethasone、1% ITS⁺、100,000 unit/L penicillin、100,000 μg/L streptomycin 之 RPMI-1640, pH 7.37)輕柔攪拌，將肝細胞洗下。

收集之肝細胞懸浮液先以低速離心(150 xg，3 分鐘)分離出細胞後，再將細 胞懸浮於washing solution (不含 ITS⁺之RPMI-1640 suspension solution)中，低速 離心(150 xg，3 分鐘/次)清洗細胞二次。接著，細胞懸浮液中加入等量 percoll 溶 液(10X Hank’s buffer：Percoll=1：9)，進行等密度梯度離心(250 xg，10 分鐘），

進一步區分肝實質細胞(parenchymal cells)與受傷、死亡細胞或非肝實質細胞 (non-parenchymal cells)。最後，所得肝實質細胞再於 washing solution 中以低速 離心(150 xg，3 分鐘/次)清洗細胞二次，洗去殘餘的 Percoll 溶液。完成清洗程序

後，將所得肝細胞懸浮於細胞培養液(含 10 mM HEPES、2.6 mM sodium bicarbonate、1 μM dexamethasone、100,000 unit/L penicillin、100,000 μg/L streptomycin、2.5% FBS、5 mg/L insulin、5 mg/L transferrin、5 μg/L Na2SeO3之 RPMI-1640, pH7.37)中。分殖到細胞培養皿前，先取 0.1ml 細胞懸浮液加入 1.5ml 細胞培養液及0.4ml trypan blue，混勻後，以血球計數板估計存活總細胞數(total viable cells)，最後將細胞密度分別調整為 0.6 百萬/ml。

10X Hank’s buffer（pH 7.4）

Glucose

2、 細胞之培養(Hepatocyte culture)

將2 ml 及 5 ml 細胞懸浮液分別注入到直徑 3.5 公分及 6 公分以預先經膠原 蛋白(collagen)處理過的培養皿(Falcon, Frankin Lakes, NJ, USA)中，置於 37℃、5%

CO2培養箱中培養，4 小時後，先以 37℃磷酸鹽緩衝液(PBS，含 9 mM Na2HPO4、 140 mM NaCl、1 mM NaH2PO4、pH 7.4)清洗一次，並進行第一次培養液(含 10 mM HEPES、2.6 mM sodium bicarbonate、1 μM dexamethasone、100,000 unit/L penicillin、100,000 μg/L streptomycin、2.5% FBS、5 mg/L insulin、5 mg/L transferrin、5 μg/L Na2SeO3之RPMI-1640, pH 7.37)更換。

3、 肝細胞之處理 (Hepatocyte treatment)

大白鼠初代肝細胞分離且經24 小時培養後，分別加入含有不同濃度類黃酮

化合物(apigenin、butein、chrysin、luteolin、phlortin)之培養液，並以 0.1% DMSO 處理組作為控制組，經不同時間培養後，收取、製備樣本供下列分析。

(二) 生化分析

1、 細胞存活率分析(MTT assay)

【原理】

本分析參考Denizot 和 Lang 於 1986 年所發表的方法，MTT

(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)為一種淡黃色水溶 性的tetrazolium salt，在活細胞內，可因粒腺體中的 succinate dehydrogenase 之作 用，將MTT 還原成藍紫色非水溶性 formazan，因此藉由藍紫色產物多寡即可作 為細胞毒性及細胞存活率的指標(Denizot and Lang, 1986)。

【步驟】

大鼠初代肝細胞(0.4 x 10⁶ cell/well)種植於 12 孔細胞培養皿(Falcon, Frankin Lakes, NJ, USA)中，4 小時後，第一次更換培養液，再培養 20 小時，移除培養液，

分別加入含10 μM、25 μM 或 50 μM apigenin、butein、chrysin、luteolin 或 phloretin 的新鮮細胞培養液，繼續培養24 小時，移除培養液，以 37℃ phosphate buffered saline (PBS)清洗兩次，加入 1 ml 含 0.5 mg/ml MTT 的 RPMI-1640 培養液，放入 37℃、5% CO2之培養箱，3 小時後，移除培養液，加入 1 ml isopropanol，置於 迴轉式振盪器(waver shaker)，以 25 rpm 速度均勻搖晃 10 分鐘，即可將藍紫色 formazan 溶出，吸取 isopropanol 溶液，移入 1.5 ml 離心管中，以 10,000 xg 離心 5 分鐘，取 200 μl 上層液，置於 96 孔盤中，利用酵素免疫分析儀(ELISA , Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Model 680)以波長 595 nm 測量吸光值，所 得吸光值與控制組相比，即可求得細胞相對存活率。

2、 蛋白質表現分析－西方墨點法(Western blotting assay) (1) 細胞質液萃取

肝細胞經不同類黃酮化合物處理24 小時後，移除培養液，以 4℃ (冰的) PBS 清洗兩次，加入 300 μl 細胞均質液(含 7.4 mM K2HPO4、2.6 mM KH2PO4及 154.2 mM KCl, pH 7.4)，刮取細胞至 1.5 ml 離心管中，以超音波震盪器(Micro Ultrasonic Cell Disrupter, KONTES, Vineland, NJ)震碎細胞，功率設定：750 瓦－

70%，時間設定：震 5 分鐘(間隔 2 秒/次)，離心 30 分鐘(11,000 xg、4℃)， 所得 上清液即為細胞質液(cytosolic fraction)，冰存於 -80℃。

(2) 蛋白質定量

參照Coomassie Plus Protein Assay Kit 方法操作，簡述如下：各取 5 μl BSA 標準品與細胞質液樣本，分別置於96 孔盤內，加入 150 μl dye reagent (細胞原液：

dye reagent＝1：30，v/v)，置於迴轉式震盪器上，室溫中均勻搖晃 10 分鐘，試 劑將與樣本中蛋白質結合成藍色反應物質，以酵素免疫分析儀(ELISA ,

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Model 680, BD Biosciences)偵測波長 595 nm 吸光值，再與利用 BSA 所求得之蛋白質標準品濃度曲線比照後，即可計算 樣品蛋白質的濃度。

(3) 西方墨點法

蛋白質濃度定量後，以5X 濃度的 sample buffer (含 0.5 M Tris、20%

glycerol、10% SDS、0.1% bromophenol blue 及 5% β-mercaptoethanol)及 potassium phosphate buffer (PPB)將樣品蛋白質濃度調整為 0.4 μg/ul，95℃下加熱乾浴 5 分 鐘使蛋白質變性，取適量體積之樣品注入SDS-PAGE 樣品槽中，以 130 伏特電 壓進行電泳。

5X sample buffer (保存於 4℃) 0.5M Tris 10.0 ml

20% SDS 17.5 ml

β-Mercaptoethanol 2.5 ml Bromopherol blue （w/v） 0.05 ml

Glycerol 10.0 ml

H2O 8.0 ml

Polyacrylamide gel 配方

Separating gel 10% Stacking gel 4%

30% Acrylamide 3.74 ml 0.67 ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml

0.5M Tris-HCL（pH8.8） 1.25 ml

電泳完成後，取下膠體，切除stacking gel，將 separating gel 浸泡於 transfer buffer (含 80% 25 mM Tris、192 mM glycine 及 20% methanol)中，同時截取一片 與separating gel 大小相同之 PVDF (polyvinylidene fluoride)轉漬膜，先將此膜浸 泡於99.5% ethanol 中 5 分鐘，再與膠片、濾紙及海綿一起浸泡於 transfer buffer

約5 分鐘，依序將海綿、濾紙、膠片、PVDF 膜、濾紙、海綿放置於三明治式塑

膠板中，固定後，放入轉漬槽中，以100 伏特於冰浴中進行轉漬 90 分鐘。

轉漬完成後，取出PVDF 膜，先以冰冷的 buffer A (25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.3% Tween 20，pH 7.4)清洗一次，加入 Ponceau S solution 染色並在確定 蛋白質分離之位置後，剪裁PVDF 膜，以冰冷的 buffer A 清洗三次，每次 5 分鐘，

隨後將PVDF 膜浸泡於含 5%脫脂奶粉(skim milk)的 buffer B (含 25 mM

Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 7.4)中，置於 4℃下隔夜或於室溫下 2 小時，進行 blocking 反應。

取出PVDF 轉漬膜，以冰冷的 buffer A 清洗三次，每次 5 分鐘，接著依一級 抗體種類不同，於室溫反應60 分鐘或 4℃下反應 overnight，取出後，PVDF 膜 再次以冰冷的buffer A 清洗三次，每次 5 分鐘，隨後加入二級抗體，室溫下反應 40 分鐘後，以冰冷的 buffer A 清洗三次，每次 5 分鐘，最後加入 Enhanced Chemiluminescence Reagent (ECL kit)呈色，並以冷光數位分析儀(LAS-4000, FUJIFILM, Japan)顯像、存檔，待後續蛋白質表現定量分析。

3、 還原態及氧化態麩胱甘肽【GSH and oxidized GSH (GSSG)】含量之分析 本分析參考Yao 等人於 2003 年所發表的方法(Yao et al., 2003)，肝細胞經不 同類黃酮化合物處理24 小時後，取 100 μl 細胞質液(cytosolic fraction)與 200 μl 10 mM Ellman’s reagen 震盪均勻後，加入 60 μl 20% 5-sulfosalicylic acid，混合均勻 使蛋白質酸沉澱，離心10 分鐘(10,000 xg、4℃)，取 100 μl 上清液，注入高效液 相層析儀／質譜儀(HPLC/MS, High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrophotometer, Hewlett Packard)中，分析樣本內 GSH 及 GSSG 含量。

4、 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (1) Total RNA 的抽取

肝細胞經不同類黃酮化合物處理不同時間後，移除培養液，以冰冷的PBS

清洗二次，加入0.5 ml Trizol reagent，靜置 5 分鐘後，刮取細胞，移入 1.5 ml 離 心管中，加入100 μl chloroform，均勻震盪 15 秒，室溫靜置 4 分鐘，離心 15 分 鐘(11,000 xg、4℃)，吸取最上層含有 RNA 的上清液至另一乾淨的 1.5 ml 離心管 中，加入250 μl isopropanol，混合均勻，室溫靜置 10 分鐘使 RNA 沈澱，離心 20 分鐘(11,000 xg、4℃)，移除上清液，加入 500 μl 冰的 70% ethanol 清洗殘餘 鹽類，離心5 分鐘(5,000 xg、4℃)，最後加入 250 μl 冰的 70% ethanol，並貯存 於-20℃供後續 RNA 表現分析。

取出保存於70 % ethanol 的 RNA 樣品，離心 15 分鐘(11,000 xg、4℃)， RNase inhibitor、50 units reverse transcriptase)於 1.5 ml 離心管中，再分別與 0.2 μg/μl RNA 樣品混合，並加入去離子水至總體積為 20 μl，混合均勻後進行逆轉錄 反應(MJ Mino Thermo Cycler, BD Biosciences)，設定條件：42℃ 15 分鐘、99℃ 5 分鐘、4℃ 10 分鐘，製造 cDNA 產物。接著，製備 PCR mixture (含 PCR buffer、

Gene Primer Parameters mRNA

product

Cycle number HO-1¹ 5'-AGCATGTCCCAGGATTTGTC-3' 94℃, 30sec 454 bp 25 5'-AAGGCGGTCTTAGCCTCTTC-3' 55℃, 45sec

72℃, 45sec

GCLC² 5'-CCTTCTGGCACAGCACGTTG-3' 94℃, 60sec 346 bp 25 5' -TAAGACGGCATCTCGCTCCT-3' 60℃, 60sec

72℃, 90sec

GAPDH 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG 94℃, 30sec 576 bp 25 3’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG 55℃, 45sec

72℃，45sec

(4) DNA 電泳

由每管PCR 產物中取出 10 μl，加入 2 μl 6X loading dye，混合均勻後，注 入含有Ethidium bromide (EtBr)之 1% agarose (SeaKem^® LE Agarose)膠中，於電泳 槽中以100 伏特進行電泳，再利用膠片影像分析系統(AlphaImager^® EC, Alpha Innotech)照相分析 mRNA 表現。

5、 Transient transfection / Luciferase activity assay

將大鼠初代肝細胞(1.2 x 10⁶)種植於 3 公分細胞培養皿(Falcon, Frankin Lakes, NJ, USA)中，4 小時後，更換培養液，再培養 24 小時，以 37℃ PBS 清洗 細胞一次，加入1ml OPTI-MEM (無血清培養基)，1 小時後即可進行轉殖

(transfection)。步驟簡述如下：取 0.4 μg 3x ARE-Luc reporter plasmid (5-TGACTCAGCA-3’)、0.1 μg pCMV-β-galactosidase (β-Gal)plasmid、1 μl

Nanofectin^TM agent 及 100 μl OPTI-MEM，混合均勻，室溫下靜置 50 分鐘，再與 900 μl OPTI-MEM 混勻。將細胞培養皿中原先的 OPTI-MEM 移除後，加入含報 導基因的新鮮製備反應溶液，即可進行轉殖作用。8 小時後，先置換新鮮

RPMI-1640 培養液 2 小時，再開始給與不同類黃酮化合物處理， 24 小時後，移 除培養液，以冰冷的PBS 清洗二次，加入 100 μl lysis buffer，靜置 5 分鐘後，刮 取細胞，離心3 分鐘(11,000 xg、4℃)，吸取上清液進行 luciferase 活性分析。

Luciferase 活性則利用 Luciferase reporter assay kit (BD Bioscience)分析，並以冷光 光譜儀測定冷光值，同時也取部分上清液測量β-galaxtosidase 活性，

β-galaxtosidase 活性係以 Ο-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)為反應受 質，並以酵素免疫分析儀(ELISA Model 680, BD Biosciences)於 415 nm 波長下測 定ONPG 產物濃度。將僅以 0.1% DMSO 處理的控制組細胞的 luciferase 活性及 β-galaxtosidase 活性比值視為 1，類黃酮處理組的活性再與之比較以求得相對比 值。

6、 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) (1) 核蛋白萃取

肝細胞經不同類黃酮化合物處理6 小時後，移除細胞培養液，以冰冷的 PBS

清洗兩次，加入1 ml PBS，刮下細胞，裝入 1.5 ml 離心管中，離心 5 分鐘(20,000 xg、4℃)，去除上清液，加入 200 μl 低張溶液(含 10 mM HEPES、10 mM KCl、

1.0 mM EDTA、1.0 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSF、4 μg/ml leupeptin、

20 μg/ml aprotinin、0.5% NP-40，pH 7.4)，溫和地混合均勻，使細胞懸浮於低張 溶液中，冰浴15 分鐘後，離心 15 分鐘(6000 xg、4℃)，去除上清液。加入 500 μl buffer B (含 10 mM HEPES、10 mM KCl、1.0 mM EDTA、1.0 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSF、4 μg/ml leupeptin、20 μg/ml aprotinin)到離心後的細胞核沉 澱物，使細胞懸浮在buffer B 中，離心 15 分鐘(6000 xg、4℃)，吸取上清液，離 心後的細胞沉澱物再加入50 μl 高張溶液(含 10 mM HEPES、1.0 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSF、4 μg/ml leupeptin、20 μg/ml aprotinin、10% glycerol、

400 mM KCl、0.2 mM EDTA)，室溫下溫和震盪 30 分鐘，離心 15 分鐘(10,000 xg、

4℃)，所得上清液即為細胞核蛋白萃取液(nuclear protein extract)。細胞核蛋白萃 取液以Coomassie Plus Protein Assay Kit Coomassie Plus 定量，樣品保存於-80℃

超低溫冷凍櫃，供後續EMSA 分析使用。

(2) EMSA

製備反應溶液每管含［50 ng/μl poly (dIdC)、1X binding buffer、2.5% glycerol、

5 mM MgCl2、0.05% NP-40 以及 2 ng biotin 標定之 HO1-ARE 序列【forward:

5'-AACCATGACACAGCATAAAA-3' ; reverse: 5'-TTTTATGCTGTGTCATGGTT -3 '】］，再分別與 4 μg 細胞核蛋白樣品混合，並加入去離子水至總體積 20 μl。混 合均勻後，室溫下反應30 分鐘，隨後每管加入 5 μl 5X loading dye，並使每管總 體積為25 μl，注入到 6% polyacrylamide gels (6% acrylamide solution、1X TBE buffer、1% APS 及 15 μl TEMED)樣品槽中，以 0.5X TBE buffer 為電泳液，在 32

mA 的冰水浴中進行電泳 90 分鐘，隨後以 100 伏特電壓於冰水浴中繼續轉漬 45 分鐘，將protein-DNA 結合物轉漬至 nylon membrane (HyBond N⁺)上。轉漬完成 後，取出膜置於紙巾上晾乾10 分鐘，再於紫外光燈下 cross-link 10 分鐘，以 1X wash buffer 清洗 5 分鐘，將膜放入含 10 ml blocking buffer 的容器內均勻搖晃 20 分鐘，隨後加入10 μl Streptavidin- Horseradish Peroxidase (HRP)，均勻搖晃 20 分

mA 的冰水浴中進行電泳 90 分鐘，隨後以 100 伏特電壓於冰水浴中繼續轉漬 45 分鐘，將protein-DNA 結合物轉漬至 nylon membrane (HyBond N⁺)上。轉漬完成 後，取出膜置於紙巾上晾乾10 分鐘，再於紫外光燈下 cross-link 10 分鐘，以 1X wash buffer 清洗 5 分鐘，將膜放入含 10 ml blocking buffer 的容器內均勻搖晃 20 分鐘，隨後加入10 μl Streptavidin- Horseradish Peroxidase (HRP)，均勻搖晃 20 分