第三章 材料與方法
第二節 實驗方法
一、紅藜萃取物製備與 rutin 分析 (一) 樣品前處理
本實驗使用之台灣藜 (Chenopodium formosanum Koidz) 的種籽由信豐農業 生技股份有限公司所提供，以新鮮且色彩鮮明的紅藜全穀作為樣品。首先挑除較
大的枝葉等雜質後，進行研磨，並收集外層殼粉。紅藜研磨至穀粒呈現部分白色
表 3-1 Rutin 之 HPLC 分析條件 Table 3-1 HPLC analysis of rutin
Column RP-18 GP 250-4.6 (5 μm) Mobile phase Solvent A: 0.1% Trifluoroacetic acid
Solvent B: Acetonitrile Flow rate 1 mL/min
UV wavelength 250 nm Sample inject volume 20 μL
(二) 動物分組與詴驗物質劑量
表 3-2 紅藜萃取物與其 rutin 對酒精誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗物 質劑量
Table 3-2 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Red Quinoa extract on the prevention of ethanol-induced liver injury in mice Groups Liquid
alcoholic diet
Sample Rutin Dosage (mg/kg mice )
NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice, HL-P: ethanol induced liver injury mice fed 5.13 g/kg (rutin 8.46 mg/kg) of red quinoa-powder, HL-E:
ethanol induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 16.4 mg/kg) of red quinoa- ethanol extracts, HL-W: ethanol induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 3.92 mg/kg) of red quinoa-water extracts, Rutin: ethanol induced liver injury mice fed 16.4 mg/kg of rutin.
表 3-3 紅藜萃取物其 rutin 對四氯化碳誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗 物質劑量
Table 3-3 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Red Quinoa extract on the prevention of CCl4-induced liver injury in mice
Groups CCl4 in corn oil (0.5mL/kg
bw)
Sample Rutin Dosage (mg/kg extract of seed coats
16.4 1.54
HL-W + red quinoa water extract of seed coats
3.92 1.54
Rutin + Rutin 16.4 -
NOR: normal group, CCL : CCl4 induced liver injury mice, HL-P: CCl4 induced liver injury mice fed 5.13 g/kg (rutin 8.46 mg/kg) of red quinoa-powder, HL-E: CCl4 induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 16.4 mg/kg) of red quinoa- ethanol extracts, HL-W: CCl4 induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 3.92 mg/kg) of red quinoa-water extracts, Rutin: CCl4 induced liver injury mice fed 16.4 mg/kg of rutin.
表 3-4 一般液態飼料配方
Table 3-4 The formulation of Lieber-DeCarli liquid diet
kcal/g g/L kcal/L
Casein(80 Mesh) 4.3 41.4 176.8
L-Cystine 4 0.5 2
DL-Methionine 4 0.3 1.2
Corrn Oil 8.8 8.5 75.1
Olive Oil 8.8 28.4 251.1
Safflower Oil 8.8 2.7 23.9
Maltose Dextrin 4. 115.2 456.2
Cellulose 0 10 0
Mineral Mix 0.47 8.8 4.1
Vitamin Mix 3.8 2.5 9.5
Choline Bitartrate 0 0.5 0
Xanthan Gum 0 3 0
(Lieber and DeCarli 1982)
表 3-5 含酒精之液態飼料配方
Table 3-5 The formulation of Lieber-DeCarli ethanol liquid diet
kcal/g g/L kcal/L
Casein(80 Mesh) 4.3 41.4 176.8
L-Cystine 0 0.5 0
DL-Methionine 0 0.3 0
Corrn Oil 8.8 8.5 75.14
Olive Oil 8.8 28.4 251.1
Safflower Oil 8.8 2.7 23.9
Maltose Dextrin 4.0 25.6 101.4
Cellulose 0 10 0
Mineral Mix 0.5 8.8 4.1
Vitamin Mix 3.8 2.5 9.5
Choline Bitartrate 0 0.5 0
Xanthan Gum 0 3 0
(Lieber and DeCarli 1982)
三、血清和肝臟之生化測定分析 (一) 血清肝功能分析
血清中肝功能之檢測項目分別為肝損傷指標 AST、ALT 和 ALP，脂質堆積 TC 和 TG，肝功能指標 Total protein、Albumin、Globulin 和 TBIL，腎功能指標 BUN 和 CRE，以上皆委託尚捷醫事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman-700, Fullerton, CA,USA) 進行檢測。
(二) 肝臟脂質含量、氧化和抗氧化酵素測定分析 1. 肝組織均質液樣本製備
首先取 0.1 g 肝臟組織放入 1 mL 之 DMSO 或 lysis buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris、40 mM NaF、0.2% SDS、0.5% deoxy-cholate、1 mM EDTA、
1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、100 mM NaCl，pH 7.5) 或 PBS buffer (0.026 M NaCl、 GOP-PAP, Fortress Diagnostics, Antrim, UK) 主要是利用 triglycerides 經過 lipase 分解後形成 glycerol，而 glycerol 再透過 glycerolkinase 與 glycerol-3-phosphate oxidase 氧化產生 H2O2，最後 H2O2 經由 peroxidase 作用與 4-amino-antipyrine 結合並呈色，於 546 nm 波長下偵測含量，將吸光值代入標準曲線回推 TG 含 量。
(2) 肝臟內 TC 含量測定
肝臟內 TC 含量測定使用分析套組 (CHOLESEROL CHOD-PAP, Fortress Diagnostics, Antrim, UK)，主要是 cholesterol ester 被 cholesterol esterase 分解產 生 cholesterol，並透過 cholesterol oxidase 氧化產生 H2O2，而 H2O2 經 由 peroxidase 作用與 4-amino-antipyrine 結合並呈色，於 546 nm 波長下偵測含量，
將吸光值代入標準曲線回推 TC 含量。
3. 肝臟脂質過氧化測定-TBARS assay
SOD 酵素測定採用市售套組 (Ransod, SD125, Randox, Crumlin, Antrim, UK)，
利用 SOD 會將超氧自由基 (O2-) 轉換成 H2O2，以及 2-(4-iodophenyl)-3-(4
CAT 測定使用市售套組 (EnzyChrom EnzyChromTM Catalase Assay Kit, ECAT-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)，由於 CAT 會將 H2O2 分解為 H2O 與 O2，此外 H2O2 與 Kit 內所含 HRP Enzyme 及 Dye Reagent 反應後呈 色，於波長 570 nm 下測定經過 CAT 作用後剩餘之 H O 吸光值，另外測定未
與 CAT 反應之 H2O2 吸光值，將未反應之 H2O2 吸光值扣除剩餘 H2O2 之吸 光值， 以得到消耗之 H2O2 吸光值，計算 H2O2 消耗速率並藉此回推 CAT 酵 素活性。
(3) 穀胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-PX) 測定
GPx 酵 素 測 定 使 用 檢 測 分 析 套 組 (RANSEL,RS 505, Randox, Crumlin, Dithio (2 -nitrobenzoic acid) (DTNB) 進行反應生成黃色產物，此黃色產物於 412 nm 波長照射下，可偵測到吸光值，因此可用於檢測 GSH 的含量。
(三) 肝臟生化分析
1. 肝臟組織均質液之製備
切取 0.1 g 肝臟組織放入 1 mL 之 lysis buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris、
40 mM NaF、0.2% SDS、0.5% deoxy -cholate、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、100 mM NaCl，pH 7.5) 進行均質，之後再以 4oC 下 15000 x g 離心 15 min，抽取上清液保存於 -20 oC 供後續分析使用。
2. 蛋白質含量測定
以市售 BCA protein assay kit (23225, Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford,
IL, USA) 進行分析。BCA 法是利用蛋白質對二價銅離子 (Cu2+) 進行還原，所 生成的 Cu+ 可以使 BCA 專一性地呈色而定量。 BCA protein assay kit 含 Reagent A (BCA)、Reagent B (CuSO4) 以及 bovine serum albumin (BSA)，先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻混合，取 10 μL 組織均質液與 200 sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，其原理利用分子量不同分 離出目標蛋白。當電泳膠片 (gel) 密度較大時，蛋白通過孔徑較少，使分子量大 的蛋白質位於上方，主要分離分子量較小之蛋白質，而電泳膠片 (gel) 密度較小，
蛋白通過孔徑較大，可以分離出分子量較大之蛋白。將樣品與 loading buffer 等 體積混和後，以 95oC 水浴槽 10 min 使蛋白變性，而後在電泳膠片注入 3 μL marker 及 15 μL/well 之樣品，並在電泳槽外加入 electrophoresis running buffer (18 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA·2Na、16 mM Boric acid、0.7 mM SDS，pH 8.4)，
以 80 V 跑完 stacking gel，再以 120 V 分離蛋白質。
(2) 蛋白質轉漬
電泳結束後將已分離之蛋白質膠體取出，以 Pierce G2 半乾式快速轉漬器進 行轉漬。對照 marker 後截出欲分析蛋白位置之膠體，浸泡於超純水中並清洗 5 min，重複兩次，並同時以甲醇活化 polyvinylidene fluoride (PVDF) 轉漬膜，再 浸泡於 transfer buffer 搖晃 10 min，最後將 14 張濾紙以 transfer buffer 潤濕後，
依序以 7 張濾紙、PVDF 轉漬膜、電泳膠片 和 7 張濾紙放於轉漬器上，轉漬 10 min。轉漬完成後，取出轉漬膜後於右上方截去一角以作標示，將轉漬膜浸置於 Urea-TBST (6 M Urea、0.0308 M NaCl、0.002 M Tris 及 0.15% Tween 20，pH 7.4) 清洗 5 min，再以 TBST 震盪 10 min，重覆 3 次後更換為含 3% 脫脂奶粉之 TBST blocking buffer 中 blocking 1 hr，以 TBST 清洗 10 min 重覆 3 次，加入 以 blocking buffer 稀釋之一級抗體於室溫搖晃反應 1.5 hr (或 4oC overnight)，反
應結束後倒出抗體，以 TBST 震盪 10 min 重覆 3 次，加入以 blocking buffer 稀釋之二級抗體搖晃反應 1 hr，以 TBST 清洗 10 min 重覆 3 次，最後於暗房 中加入 chemiluminescent horseradish peroxidase (HRP) 冷光呈色劑 (P90720, Millipore, MA, USA) 反應，將轉漬膜固定於壓片夾中，以底片進行壓片反應後，
(五) 肝臟組織之蘇木紫-伊紅染色 (hematoxyline-eosin, H&E)
將 5 μm 石蠟組織切片置入二甲苯 (xylene) 中 30 min 脫蠟，再依序置於
(六) 天狼星紅膠原染色 (Sirius Red)
將 5 μm 石蠟組織切片置入二甲苯 (xylene) 中 脫蠟 2 次，每次 10 min，
脫蠟後組織玻片再依序放入 100% 酒精、95% 酒精、80% 酒精、70% 酒精及 50% 酒精中，每次浸泡 5 min，再以去離子水 (ddH2O) 沖洗一次，完成復水。
將復水完成的組織玻片置入以濾紙過濾之 hematoxylin 中 10 min 染細胞核，染 色後於超純水中靜置 10 min，再置於水龍頭慢慢流洗 10 min，接著以酸性酒精 (250 μL 10N HCl + 100 mL 70% EtOH) 做適度脫色，並以超純水洗淨。之後在室 溫以 0.1% Direct red 80 和 1.3% 飽和 picric acid 混和的溶液中染色 1 hr，再以 0.5% 的冰醋酸溶液清洗 2 次，每次 5 min，將染色完畢的玻片依序浸泡於 50%
酒精、70% 酒精、80% 酒精、95% 酒精和 100% 酒精，每次浸泡 5 min，使 組織脫水。最後用 xylene 浸泡使之透明化 5 min，並以封片膠封片，待乾後即 可於顯微鏡下觀察玻片。
四、統計分析
實驗結果均以帄均值 ± 標準偏差 (mean ± SD) 表示。利用 SPSS 12.0 系 統之單因子變異數分析 (One-way ANOVA) 進行統計處理，再以 Duncan’s multiple range test 作組間的差異性比較，p <0.05 表示具有顯著性差異。