國立臺東大學生命科學系 碩士論文
Department of Life Science, National Taitung University Master Thesis
指導教授 : 李俊霖 博士 Advisor : Chun-Lin Lee, Ph.D.
探討紅藜全榖及殼萃取物對
酒精及四氯化碳誘導肝損傷之改善效果
Effect of Whole Grain and Chenopodium formosanum Koidz Extract of Seed Coats on the Prevention of Alcohol- and
Carbon Tetrachloride-Induced Liver Injury
研究生 : 林庭安 撰
Graduated student : Ting-An Lin
中華民國 106 年 7 月
July, 2017
國立臺東大學生命科學系 碩士論文
Department of Life Science, National Taitung University Master Thesis
探討紅藜全榖及殼萃取物對
酒精及四氯化碳誘導肝損傷之改善效果
Effect of Whole Grain and Chenopodium formosanum Koidz Extract of Seed Coats on the Prevention of Alcohol- and
Carbon Tetrachloride-Induced Liver Injury
研究生 : 林庭安 撰
Graduated student : Ting-An Lin
指導教授 : 李俊霖 博士 Advisor : Chun-Lin Lee, Ph.D.
中華民國 106 年 7 月
July, 2017
誌謝
在臺東大學碩士班兩年，說長不長，說短也不短，能順利完成論文與畢業，
首先最要感謝的是我的指導教授李俊霖博士，大學時期就在您的實驗室學習實驗 操作基礎，並且當初在考慮是否要走上碩士班研究這條路，是您的不斷鼓勵與支 持，讓我有信心往前邁進，在研究的過程中，信任我並給予極大自由發揮空間與 資源，且有耐心的糾正我粗心的錯誤及教導我不懂的地方，也時常與我討論實驗 該注意的事項，如同亦師亦友，讓我在研究的路上能有快樂的心情學習，再次的 謝謝老師讓我有機會在您的實驗室中學習，由衷感激。在此，感謝潘子明博士、
蔡宗佑博士、王志傑博士、林志輝博士擔任本論文的口試委員，在百忙之中抽空 參與口試，並提供許多寶貴的建議，使本論文更趨完善、豐富。另外，謝謝系辦 行政助理蘇怡菁學姊，常常有耐心地給予行政事務的幫助，讓我能順利跑完畢業 程序。
在研究所這兩年雖然碰到許多關卡困難，但我有一群從大學到研究所的好同 學亭采、柏均、順達、子芸、志暄、顥翰一起在課堂上切磋琢磨、一起在實驗上 解決問題、一起分享實驗經驗，讓我在研究這條路並不是孤軍奮戰，而是同心協 力一起走向畢業。此外，也要感謝實驗室中的學弟妹中佑、彥忠、文良、崇銘、
逸文、芷希等在實驗上的協助，讓我在實驗上能順利進行，謝謝你們在實驗室中 製造許多歡樂，讓實驗室中充滿愉悅的氣氛，希望你們在接下來的日子裡都能順 利並且有勇氣迎向挑戰。另外，要特別感謝為本實驗犧牲的老鼠們，希望你們在 天堂能快快樂樂的生活。
最後感謝我的父母無怨無悔地栽培我尊重我，讓我可以無後顧之憂來到遙遠 的台東讀書，總是一路支持我，帶給我極大的信心，我愛你們。
林庭安 臺東大學生命科學研究所 中華民國一百零六年七月
中文摘要
肝損傷是由多個因素如酒精、化學藥物和病毒所導致，若長期傷害肝臟則會 造成肝細胞損傷伴隨著脂肪浸潤、脂肪肝、肝發炎等病狀，最終可能惡化成肝纖 維化、肝硬化甚至肝癌，可見護肝的重要性。台灣藜 (Chenopodium formosanum Koidz)，俗稱紅藜，富含豐富蛋白質、膳食纖維、必需胺基酸營養，並含有機能 性成分甜菜色素、多酚類，其中多酚類又以芸香苷 (rutin) 為主，具有清除自由 基之能力、抗氧化、抗發炎和護肝等功效。本研究探討紅藜萃取物與其功效成分 rutin 對酒精性和化學性肝損傷之改善效果。利用酒精液態飼料誘導肝損傷與腹 腔注射四氯化碳誘導肝損傷之動物模式，分別餵食紅藜全穀粉末、紅藜殼酒萃物、
紅藜殼水萃物及 rutin 給予損傷小鼠，經六週詴驗，探討紅藜對肝損傷的改善效 果。結果顯示，紅藜萃取物和 rutin 均能降低酒精所提高血清中肝損傷指標 aspartate aminotransferase (AST)、alanine aminotransferase (ALT) 活性和血清中脂 質堆積 triglyceride (TG)、total cholesterol (TC)，並能降低血清中肝臟中的 TG 含 量，並降低脂質生合成 ACC 蛋白表現量，提高抗氧酵素 superoxide dismutase (SOD)、catalase (CAT) 活性和 glutathione (GSH) 含量，並顯著降低肝臟之 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)。在肝臟病理切片 H&E 染色中紅 藜萃取物組僅只出現少許脂肪空泡及中央靜脈的周圍巨噬細胞浸潤，顯示紅藜萃 取物達到預防酒精性脂肪肝之效果。在四氯化碳誘導肝損傷之結果中，紅藜萃取 物和 rutin 均能降低血清中因四氯化碳所提高之肝損傷指標一 AST 與 ALT 活 性降低血清中總蛋白和白蛋白/球蛋白比值降低血清中腎臟功能指標尿素氮和肌 酸酐並提高抗氧化酵素 SOD、CAT 活性和抗氧化物質 GSH 含量，顯著降低肝 臟之 TBARS 含量，並降低發炎因子 tumor necrosis factor-α (TNF-α)、Interleukin 6 (IL-6) 及降低纖維化因子 transforming growth factor-β1 (TGF-β1)、α-smooth muscle actin (α-SMA)，達到改善四氯化碳誘導肝纖維化之效果。根據以上兩種動
物模式誘導肝損傷結果，紅藜萃取物具有改善酒精誘導肝損傷和四氯化碳誘導肝 損傷小鼠之效果，且 rutin 可作為其功效成分指標。
關鍵字 : 紅藜、芸香苷、酒精肝損傷、化學肝損傷
Abstract
In 2015, Chronic liver disease and Cirrhosis are top ten causes of death in Taiwan. Liver injuty is caused by multiple factors, such as alcohol, chemicals and viruses. It may lead to hepatic failure, hepatic fibrosis, cirrhosis and eventually hepatic carcinoma. Thus, to protect liver is essential. Red Quinoa (Chenopodium
formosanum Koidz), which is called Djulis in aboriginal village, contains high
quantities of protein, dietary fiber, essential amino acid and other bioactive constitutions. Rutin is main polyphenols in Red Quinoa. It has effects on anti-radicals, anti-oxidation, anti-inflammatory and protecting liver. This study investigated the effect of red quinoa extract and rutin on the improvement of alcoholic and chemical liver injury. Liver injury were induced by liquid alcoholic diet and CCl4 i.p. injection for 6 week and treated with red quinoa powder, red quinoa water extract, red quinoa ethanol extract and rutin. In the results of alcoholic liver injury, red quinoa extract and rutin decreased the activities of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the levels of serum triglyceride (TG) and cholesterol (TC). Moreover, they decreased the levels of TG and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and increased the activities of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione (GSH) and Significantly in the liver.
Furthermore, small amount of fat vacuoles and macrophages infiltrated around the central veins were found in the red quinoa extract groups in the H&E liver slice. In the results of carbon tetrachloride-induced liver injury, red quinoa extract and rutin decreased the activities of AST and ALT and total protein, albumin/globulin ratio in serum. Besides, serum urea and creatinine were decreased by the treatment. The level of TBARS also was decreased in liver. According to the above two liver injury models, red quinoa extract has effects on improving alcohol-induced liver injury and
carbon tetrachloride-induced liver injury in mice, and rutin might be a main effective compound in red quinoa extract.
Keywords : red quinoa (Chenopodium formosanum Koidz), rutin, alcoholic liver injury, Chemical liver injury
縮寫表
α-SMA (α-smooth muscle actin) : 帄滑肌肌動蛋白 ACC (acetyl-CoA carboxylase)：乙醯輔酶 A 羧化酶 ALT (alanine aminotransferase) : 丙胺酸轉胺酶 AST (aspartate aminotransferase) : 天門冬胺酸轉胺酶 ALD (alcoholic liver disease) : 酒精脫氫酶
ALDH (aldehyde dehydrogenase) : 乙醛脫氫酶 ALP (alkaline phosphatase): 鹼性磷酸酶
AMPK (AMP-activating protein kinase)：腺苷酸活化蛋白激酶 BUN (blood urea nitrogen) : 尿素氮
CAT (catalase) : 過氧化氫酶
COX-2 (cyclooxygenase-2)：第二型環氧化酶 CRE (creatinine) : 肌酸酐
CYP2E1 (cytochrome P-450 2E1)：細胞色素 P450 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
ECM (extracellular matrix)：細胞外基質
GPx (glutathione peroxidase)：穀胱甘肽過氧化酶 GSH (glutathuone)：穀胱甘肽
HSCs (hepatic stellate cell)：肝星狀細胞 IL-6 (Interleukin 6) : 白介素-6
LOX (lipoxygenase) : 脂氧合酶 LPS (lipopolysaccaride) : 脂多醣
MAPK (mitogen-activated protein kinases) : 促分裂素原活化蛋白激酶 MDA (malondialdehyde) : 丙二醛
MEOS (microsomal ethanol-oxidizing system) : 微粒體乙醇氧化系統
MMP-1 (matrix metalloproteinase-1)：基質金屬蛋白酶-1
NF -κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) PKC (protein kinase C) : 蛋白激酶 C
PPAR-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α) : 過氧化體增殖活化受體-α ROS (reactive oxygen species)：活性氧
SDS-PAGE (sodiumdodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)：十二基硫酸 鈉電泳法
SOD (superoxide dismutase) : 超氧化物歧化酶 TBA (Thiobarbituric acid) : 硫代巴比妥酸
TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) : 硫代巴比妥酸反應 TBIL (total bilirubin) : 總膽紅素
TC (total cholesterol)：總膽固醇 TCA (trichloroacetic acid) : 三氯乙酸 TG (triglyceride)：三酸甘油酯
TGF-β1 (transforming growth factor- β1) : 轉化生長因子-β1 TLR 4 (toll-like receptor 4) :白細胞介素 4
TMP (1,1,3,3-tetramethoxypropane) : 四甲氧基丙烷 TNF-α (tumor necrosis factor alpha) : 腫瘤壞死因子-α
TNFR1(Tumor necrosis factor receptor 1) : 腫瘤壞死因子受體 1 WHO (World Health Organization)：世界衛生組織
目錄
中文摘要………...Ⅰ Abstract………Ⅲ 縮寫表……….ⅴ
前言………..1
第一章 文獻回顧………3
第一節 肝臟疾病………...3
一、肝損傷………3
二、酒精性肝損傷………4
(一) 酒精性肝損傷之作用機轉………...4
(二) 酒精性肝損傷誘發之動物模式………...9
三、化學性肝損傷………...11
(一) 四氯化碳誘導化學性肝損傷之作用機轉………..12
(二) 四氯化碳誘發肝損傷之動物模式………..12
四、酒精性與化學性誘發動物肝損傷模式之比較………15
第二節 台灣藜………...16
一、紅藜生長、分布特性介紹………16
二、紅藜營養成分與功效成分………16
三、紅藜保健之相關研究………20
第三節 紅藜預防肝損傷之潛力………...…………21
一、Rutin 預防肝損傷之過去研究……….21
二、Betanin 預防肝損傷之過去研究……….22
第二章 研究動機與架構………24
第一節 研究動機與目的………...24
第二節 研究架構………...25
第三章 材料與方法………27
第一節 實驗材料………...27
一、儀器與設備………27
二、藥品………28
第二節 實驗方法………...29
一、紅藜萃取物製備與 rutin 分析………..29
二、紅藜萃取物對酒精和四氯化碳誘發肝損傷動物詴驗模式……....…30
三、血清和肝臟之生化測定分析………34
四、統計分析………42
第四章 研究結果………43
第一節 紅藜萃取物製成其含量分析……….43
一、紅藜營養成分分析表………...43
二、紅藜萃取物與其活性成分 rutin 之 HPLC 層析圖譜……….43
三、紅藜萃取物內 rutin 含量和萃取率………...43
第二節 紅藜萃取物與其 rutin 對酒精誘導肝損傷之影響………..43
一、紅藜萃取物與對四氯化碳誘導肝損傷小鼠體重變化………..43
二、紅藜萃取物與對酒精性肝損傷小鼠體重與肝重/體重比值之影響.48 三、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清中肝功能指標 AST、ALT 及 ALP 活性之變化……….48
四、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中脂質濃度之影響..48
五、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內脂質過氧化程度之影響..52
六、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理之影響………..52
七、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 GSH 含量和抗氧化酵素活 性之影響………..52
八、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟中之脂質代謝與生合成相關蛋 白表現量之影響……….………..61
第三節 紅藜萃取物與其 rutin 對四氯化碳誘導肝損傷之影響………63
一、紅藜萃取物與對四氯化碳誘導肝損傷小鼠體重變化………..63
二、紅藜萃取物與對四氯化碳誘導肝損傷小鼠體重、肝重與肝重/體重比 值之影響………..63
三、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清中肝功能指標 AST、ALT 和 ALP 活性之變化……….63
四、紅藜萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清中肝功能指標總蛋白、白蛋白、 球蛋白、白蛋白/球蛋白比值和總膽紅素之影響………..67
五、紅藜萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠血清腎功能指標之影響..67
六、紅藜萃取物四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內脂質過氧化程度之影 響………...70
七、紅藜萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內抗氧化酵素活性和 GSH 含量之影響………70
八、紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟病理之影響…..74
九、紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟膠原堆積之影 響………..74 十、紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟中纖維化因子之影
響………..81 十一、紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟中細胞激素之影 響………..81 第五章 討論
第一節 紅藜萃取物與其成分 rutin 對酒精性肝損傷小鼠之護肝效果…...85 第二節 紅藜及其萃取物與其成分 rutin 對四氯化碳誘導肝損傷小鼠之護肝 效果………92 第六章 結論………....93 第七章 參考文獻………...95
圖目錄
圖 1-1 酒精性肝病之病程……….5
圖 1-2 酒精代謝之氧化途徑……….6
圖 1-3 抗氧化酵素之防禦系統……….8
圖 1-4 酒精代謝與肝細胞損傷形成機制……….10
圖 1-5 四氯化碳誘導肝損傷之機制……….13
圖 1-6 芸香苷化學結構……….19
圖 1-7 Rutin 預防肝損傷之路徑………...23
圖 2-1 本論文研究架構……….26
圖 4-1 紅藜萃取物與其標準品 rutin 之 HPLC 層析圖譜………...45
圖 4-2 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠脂質過氧化之影響……….53
圖 4-3 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理切片圖 (100X)………...54
圖 4-4 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理切片圖 (400X)………...55
圖 4-5 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 SOD 活性之影響……….57
圖 4-6 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 CAT 活性之影響.…...58
圖 4-7 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 GPx 活性之影響……….59
圖 4-8 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 GSH 活性之影響………60
圖 4-9 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟內 ACC、PPAR-α 之影響.62 圖 4-10 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠脂質過氧化之影響……...71
圖 4-11 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 SOD 活性之影 響………..72
圖 4-12 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 CAT 活性之影 響………..73
圖 4-13 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 GPx 活性之影 響………..75
圖 4-14 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 GSH 含量之影 響………..76 圖 4-15 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟病理切片圖 (H&E stain, 100X)………..77 圖 4-16 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟病理切片圖 (H&E stain, 400X) ………..…..78 圖 4-17 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟膠原染色圖 (Sirius red stain, 40X)………79 圖 4-18 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟膠原染色圖 (Sirius red stain, 100X)………..80 圖 4-19 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 TNF-α、IL-6 之影 響………..82 圖 4-20 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內 TGF-β1 之影 響………..83 圖 4-21 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠肝臟內α-SMA 表現量之 影響………..84 圖 5-1 紅藜、紅藜萃取物與 rutin 預防酒精性肝損傷之相關可能調控機制.…….88 圖 5-2 紅藜、紅藜萃取物與 rutin 預防四氯化碳誘導肝損傷之相關調控機制….92
表目錄
表 1-1 酒精性與化學性誘發動物肝損傷模式之比較………...15
表 3-1 Rutin 之 HPLC 分析條件………….……….……..31
表 3-2 紅藜萃取物與其 rutin 對酒精誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗物 質劑量………..………33
表 3-3 紅藜萃取物其 rutin 對四氯化碳誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗 物質劑量………..34
表 3-4 一般液態飼料配方……….35
表 3-5 含酒精之液態飼料配方………....36
表 4-1 紅藜營養成分分析表………....44
表 4-2 紅藜萃取物內 rutin 含量和萃取率………....46
表 4-3 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠體重之影響………47
表 4-4 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠體重、肝重及肝重/體重比值之影 響………..49
表 4-5 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清肝損傷指標 AST、ALT 與 ALP 含量之影響………...50
表 4-6 紅藜及其萃取物對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中膽固醇及三酸甘油酯 之影響………..51
表 4-7 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠體重之影響………....64
表 4-8 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠體重、肝重及肝重/體重比值 之影響………..65
表 4-9 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠血清肝損傷指標 AST、ALT 與 ALP 含量之影響………...66
表 4-10 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠血清肝臟合成指標總蛋白、 白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白比值和總膽紅素之影響………...68
表 4-11 紅藜及其萃取物對四氯化碳誘導肝損傷小鼠血清腎功能指標尿素和肌 酸酐之影響……….69 表 6-1 紅藜萃取物與其 rutin 預防酒精性肝損傷和四氯化碳誘導肝損傷之效果 比較……….94
前言
世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 及其下屬的癌症研究機構 (International Agency for Research on Cancer , IARC) 於 2014 年 「全球癌症報告」
指出，肝癌為全世界所有癌症中致死率位居第二位 (世界衛生組織，2014)。根 據行政院衛福部公告 105 年國人十大死因，慢性肝病及肝硬化佔居第十，而位 居首位的癌症裡，肝癌為第二位 (行政院衛生福利部，2017)。由此可見護肝對 於國人的重要性，是不容忽視的重要課題。然而肝臟是人體重要的代謝解毒器官，
若長期傷害肝臟則會造成肝細胞損傷伴隨著脂肪浸潤、脂肪肝、肝發炎等病狀，
最終有可能惡化成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌 (Addolorato et al. 2009)。然而傷 肝原因眾多，因此衛福部食藥署在 2016 年 4 月也公告增訂 4 項誘發肝損傷詴 驗模式的護肝功能評估方法。造成肝臟疾病之主要誘因有病毒性、酒精性與化學 性三大類，不同的誘因會使肝臟發生不同程度的病變或損傷，影響的性質與程度 也可能有所不同。
隨著經濟的起飛，生活品質的提升，我國對酒精飲料的消費增加，罹患酒精 性肝病的人口也逐年增加，然而長期攝取酒精，會造成體內抗氧化酵素活性與抗 氧化能力降低，使得脂質過氧化物大量增加，進而引發酒精性肝病 (Alcoholic liver disease, ALD) (Rouach et al. 1997)。脂肪肝是 ALD 最早的病徵，研究顯示，
罹患酒精性脂肪肝的病人形成肝纖維化與肝硬化的機率大為增加 (Gao and Bataller 2011)。經健康食品之護肝保健功效評估方法中誘導化學性肝損傷的物質 有乙醯胺基苯酚、硫代乙醯胺和四氯化碳 (Carbon tetrachloride, CCl4) 之動物模 式，然而以四氯化碳腹腔或皮下注射的方式最常被利用於模擬人類肝損傷模式，
當四氯化碳進入體內後，是經由活化細胞色素 P450 形成三氯甲基自由基 (CCl3‧) 和三氯甲基過氧自由基 (CCl3OO‧)，該自由基可通過細胞膜結合核酸，蛋白質和 脂質，產生脂質過氧化反應造成肝細胞壞死，進一步發展為肝纖維化 (liver fibrosis)，然而肝纖維化為慢性肝病形成肝硬化前之最終可逆階段，是肝病治療 的重要環節。因此，酒精性和化學性雖然都是肝損傷的誘導方式，但其作用機轉 和損傷程度而言，還是有其差異性。
近年來，健康意識抬頭，利用天然食品和其活性成分進行營養保健、預防疾 病愈受重視，食用保健食品成為現代人保健方法之一，而當中護肝、調節血脂和
免疫調節為大宗。台灣藜 (Chenopodium formosanum) 為藜科藜屬之台灣原生種 植物，傳統稱為紅藜，於 2008 年 12 月正名為台灣藜，是台灣原住民耕作百年 以上的傳統作物。經學者研究發現紅藜富含澱粉、蛋白質、膳食纖維，以及多量 的鈣、磷、鐵、鈉、鉀等礦物元素，為具全面的營養價值之食物，可代替稻米、
麵粉、豆類，故紅藜有「穀類的紅寶石」的美名 (行政院農業委員會林務局，2008)。
除了豐富的營養成份外，紅藜也含有高量優質的機能性成分，紅藜機能性成分乃 以酚類及甜菜色素為主。紅藜的甜菜色素正是其絢麗色彩的來源，其含量極為豐 富，具有強大的抗氧化力，故有抗癌消炎等功效，尤其黑色腫瘤之抑制，效果更 是卓著。酚類化合物包括酚酸、類黃酮等，在自然界之中，為植物二次代謝的產 物，可以提供氫原子，防止自由基生成，有抗氧化的作用。紅藜的酚類以芸香苷 (rutin) 為主，已有許多研究證實，rutin 具有抗氧化 (Nafees et al,. 2015)、抗發炎 (Sikder et al., 2014)、改善肝毒性 (Hafez et al,. 2015)、抗過敏 (Kim et al,. 2015) 等 功能，因此紅藜為良好的植物性多酚來源，食用紅藜可得到豐富的機能性多酚成 分。
因此本研究以酒精液態飼料誘導小鼠肝損傷和四氯化碳誘導小鼠肝損傷之 兩種動物模式，探討紅藜粉末、紅藜酒萃物、紅藜水萃物與其活性成分 rutin 改 善肝損傷之效果。
第一章 文獻回顧
第一節 肝臟疾病
肝臟位於人體的右上腹部，外圍有肋骨保護，不易受外力之直接撞擊，為人 體最大、機能最複雜的重要代謝器官。肝臟的功能在醣、脂質、蛋白質、維生素、
激素、膽汁等物質代謝中，均有重要作用；同時肝臟還有分泌、排泄、生物轉化 等功能。當肝功能損傷時則生成代謝障礙，並影響其他臟器功能，嚴重則危及生 命。根據行政院衛福部公告 105 年國人十大死因，慢性肝病及肝硬化佔居第十，
而位居首位的癌症裡，肝癌為第二位 (行政院衛生福利部，2017)。由此可見護 肝對於國人的重要性，是不容忽視的重要課題。
一、肝損傷
肝損傷主要分成急性肝損傷 (acute hepatic injury) 與慢性肝損傷 (chronic hepatic injury)，其中慢性肝損傷的發生與肝功能衰竭、纖維化和肝癌有極大的相 關性 (Malhi and Gores 2008)。天門冬胺酸轉胺酶 (aspartate aminotransferase, AST) 和丙胺酸轉胺酶 (alanine aminotransferase, ALT) 為診斷肝損傷的主要指標之一。
AST 和 ALT 為胺基酸代謝有關的細胞內酵素，大量存在於肝細胞中，當肝細 胞受損時，會大量釋出於血液中，故常用血清中 AST 和 ALT 數值當作肝損傷 指標。鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 則常用以檢測肝功能。ALP 主要 由肝臟和骨骼製造，故存在於肝臟及骨骼當中。ALP 在鹼性 pH 值 (9.0-10.5) 範 圍才具活性，當膽汁排出受阻礙時，膽汁會鬱積回流至血液中造成血中 ALP 濃 度上升，故 ALP 常檢測為肝功能指標 (王，2005)。
造成肝臟疾病之主要誘因有病毒性、酒精性與化學性三大類，不同的誘因會 使肝臟發生不同程度的病變或損傷，影響的性質與程度也可能有所不同。然而肝 炎病毒不易培養與分離，難以建立病毒性肝損傷之完整的動物模式，故常用酒精 和各種化學物質誘導實驗動物肝臟損傷來模擬人類肝臟發炎受損之情形。經健康 食品之護肝保健功效評估方法中誘導化學性肝損傷的物質有乙醯胺基苯酚、硫代 乙醯胺和四氯化碳之動物模式，然而以四氯化碳腹腔或皮下注射的方式最常被利 用於模擬人類肝損傷模式。
二、酒精性肝損傷
隨著生活品質的提升，飲酒是人類常見的行為，根據我國經濟部統計，2004 年酒類總供給量約 5.7 億公升，2014 年已高達 7 億公升，表示酒精類飲料消 費大幅提升，然而長期大量飲酒約 30 % 罹患酒精性肝病 (Alcoholic liver disease, ALD) 的風險增加 (Lucey et al. 2009)。ALD 病程最早病徵是脂肪肝 (即肝脂肪 變性)，若持續大量飲酒，脂肪肝轉變為肝炎，最終可能惡化成肝纖維化、肝硬 化甚至肝癌 (Schwartz and Reinus 2012)，如圖 1-1。因此，ALD 依其病程可分 成三階段 : 第一階段為酒精性脂肪肝 (alcoholic fatty liver)，第二階段為酒精性 肝炎及肝纖維化，最後第三階段形成肝硬化及肝癌 (Teli et al. 1995)。
酒精性脂肪肝是屬可逆性疾病，是 ALD 的最早病徵，早期診斷並及時治療 常可恢復正常。研究顯示，罹患酒精性脂肪肝的病人會增加罹患肝纖維化或肝硬 化的機率 (Lieber 1981)。另有研究證實，脂肪肝與肝癌具有相關性 (Day and Yeaman 1994)。因此，改善酒精性脂肪肝能降低發生肝纖維化和肝硬化的機會。
(一) 酒精性肝損傷之作用機轉
酒精性肝病的病程從脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝硬化至最後肝癌，其發病 機制可以在概念上分為 (1) 酒精代謝之肝損傷 (2) 發炎反應之肝損傷 (3) 腸道 通透性和微生物的變化之肝損傷 (Dunn and Shah 2016)。
1. 酒精代謝之氧化壓力
肝臟是酒精代謝的主要場所，如圖 1-2 所示，酒精代謝主要透過酒精脫氫 酶 (alcohol dehydrogenase, ADH) 、 微 粒 體 乙 醇 氧 化 系 統 (microsomal ethanol-oxidizing system, MEOS) 之 cytochrome P-450 2E1 (CYP2E1) 和過氧化 氫酶 (catalase, CAT) 三種酵素系統進行酒精的代謝 (Zakhari 2006)。當體內酒 精濃度低時，是經由 ADH 進行代謝成高毒性化合物乙醛 (acetaldehyde)，乙醛 會 產 生 臉 紅 、 心 悸 、 嘔 吐 的 症 狀 ， 促 使 體 內 藉 由 乙 醛 脫 氫 酶 (aldehyde dehydrogenase, ALDH) 氧化成乙酸 (acetate)，進入檸檬酸循環進行氧化代謝 (Seitz and Stickel 2007)。ADH 和 ALDH 為細胞質內酵素，當反應時導致 NADH 的增加使 NAD+ / NADH 比值降低，其對的生物化學途徑例如醣解代謝，檸檬 酸循環，脂肪酸氧化和醣質新生有重要影響。然而 NADH 主要藉由粒線體電子
圖 1-1. 酒精性肝病之病程
Fig 1-1 Development of alcoholic liver disease (Gao and Bataller 2011)
圖 1-2. 酒精代謝之氧化途徑。
Figure 1-2 Oxidative pathways of alcohol metabolism (Zakhari 2006)
傳遞鏈再氧化成 NAD+，形成循環 (Bailey and Cunningham 2002; Bondy 1992)。
電子傳遞鏈的過程中會形成不同活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 物質，如 超氧陰離子 (O2-
)、過氧化氫 (H2O2) 和羥基 (OH-)，使氧化還原失衡，造成肝細 胞損傷 (Edwards et al. 2011)。當體內酒精濃度高時，則是 MEOS 主要藉由誘導 CYP2E1 代謝酒精轉化為乙醛進行代謝作用，乙醛易與大分子結合，例如核酸、
脂質和蛋白質，形成代謝產物導致肝細胞損傷 (Klassen et al. 1995)。不同的是此 代謝路徑會產生大量的 ROS 和代謝產物，造成 DNA 損傷、蛋白質和脂質氧化 的發生 (Seitz and Stickel 2007)。CAT 為抗氧化酵素，其代謝酒精之方式主要為 透過催化過氧化氫代謝成水，因此 CAT 代謝速率與過氧化氫含量有密切關係，
雖然當血液中酒精濃度超過 0.02 % 時 CAT 活性增加，不過體內自然產生過氧 化氫的效率相當低， 此途徑代謝酒精的能力非常有限 (Lands 1998; Lieber 1982)。
除了酒精及其有毒代謝產物乙醛，對肝臟所造成的直接毒性外，有研究證實，
酒精主要由 CYP2E1 誘導大量的 ROS，導致粒線體受損，並在肝臟產生氧化壓 力 (oxidative stress) (Lu and Cederbaum 2008)。氧化壓力為 ROS 與抗氧化系統 之間帄衡失調，干擾細胞正常的氧化還原狀態，製造出過氧化物與自由基，損害 細胞的蛋白質、脂類、DNA。然而氧化壓力為誘發酒精性肝損傷之主要原因之 一 (Hoek and Pastorino 2002)。生物體為了抑制或清除這些 ROS，於正常情況下，
生物體中具有抗氧化之防禦系統，此系統主要由超氧化物岐化酶 (superoxide, SOD)、過氧化氫酶 (Catalase, CAT)、麩胱甘肽過氧化酶 (Glutathione peroxidase, GPx) 和抗氧化物質麩胱甘肽 (Glutathione, GSH) 等組成 (Venukumar and Latha 2002)。SOD 會促使超氧陰離子轉化成過氧化氫，以消除超氧陰離子，而過氧化 氫再經由 CAT 和 GPx 還原成水和氧，另外 GPx 亦會還原脂質過氧化物成為 無毒害產物。GSH 為細胞內主要抗氧化物質，不僅可經由 GPx 之酵素性反應 以還原脂質過氧化物或過氧化氫而間接抑制自由基之連鎖反應，使細胞免受 ROS 之傷害 (Curello et al. 1985)，如圖 1-3 (Pandey and Rizvi 2010)。
2. 酒精促使巨噬細胞引起發炎反應
飲酒引起腸道菌相失衡和細菌過度生長 (Bode and Bode 2003)，導致腸道細 胞的膜通透率增加，使腸道內細菌分泌之脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 顯著
圖 1-3 抗氧化酵素之防禦系統
Figure 1-3 Antioxidant enzyme defense system (Pandey and Rizvi 2010)
增加 (Purohit et al. 2008)， LPS 與 toll-like receptor 4 (TLR 4) 相互結合，並誘導 巨噬細胞活化調控發炎相關路徑如 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF –κB)，大量釋放一系列促炎細胞因子，包括 tumour necrosis factor-α (TNF-α)、interleukin-1β ( IL-1β) 和 interleukin-6 (IL-6)，造成肝臟 產生發炎反應與細胞凋亡 (Gustot et al. 2006; Louvet and Mathurin 2015)(圖 1-4)。
3. 腸道通透性和微生物的變化之肝損傷
慢性飲酒會導致腸道細菌過度生長和腸道菌群失衡，而未知的微生物代謝物 或產物引起腸道發炎，儘管腸道乳桿菌有抗炎性質，但慢性飲酒會導致好的細菌 數量減少，例如 Lactobacillus，使不能夠維持腸內菌群的穩定。並激活腸道粘膜 上的發炎細胞 TNF-α，而 TNF-α 結合腸上皮細胞其受體 tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)，導致腸細胞損傷，使微生物代謝產物可以從腸腔轉移到門靜 脈，促使肝星狀細胞和巨噬細胞活化，並造成肝細胞損傷 (Hartmann et al. 2015)。
(二) 酒精性肝損傷誘發之動物模式
酒精性肝損傷之動物模式已經有一系列不同施用酒精的方法，模擬人類酒精 性肝損傷模式，從管餵酒精或酒精混合飲水中自由攝取到改良至飲食 (例如，
Lieber deCarli 液體飲食) 或使用胃插管將酒精液體飼料酒精直接灌注到胃中 (Wilkin et al. 2016)
1. 管餵酒精之誘發酒精性肝損傷動物模式
這種模式採用管餵方式給予動物酒精，常用來研究急性酒精性肝損傷發病機 制(Brandon-Warner et al. 2012; Shukla et al. 2013)。研究顯示，急性酒精管餵能明 顯影響肝粒線體功能，誘導氧化壓力和發炎反應，儘管管餵能夠導致明顯的發炎 反應，但只能引起血清 ALT 和 AST 的輕度升高，且管餵造成改變動物的食物 攝入量，可能導致營養素攝入改變，從而誤認為是酒精效應 (Bertola et al. 2013)。
2. 飲水中加入酒精之誘發酒精性肝損傷動物模式
圖 1-4 酒精代謝與肝細胞損傷形成機制
Fig 1-4 Metabolism of ethanol and related cell injury (Louvet and Mathurin 2015)
此模式是由酒精研究領域的著名專家 Charles S. Lieber 創立，是應用最為悠 久與廣泛之動物模式。早期的動物慢性酒精餵養模型是經由在飲用水中直接添加 酒精，然而由於動物厭惡酒精的天性，造成動物脫水、血中酒精濃度過低和營養 不良，且老鼠可依照嗜好選擇飲用含有酒精飲水的量，使酒精的攝取量不足以誘 發肝損傷 (Best et al. 1949)。因此，直接飲用含酒精水的動物模式很少應用於 ALD 發病機制的研究。
為了克服此模式的不足，Lieber 博士的團隊最早建立了一種動物液體飼料餵 養模式，在液體飲食的基礎上添加高濃度的酒精，克服了動物營養不良的缺點並 且增加了酒精導致的肝損傷程度 (Lieber et al. 1989)。這種建立此模式方法簡單，
使用商業化的粉末狀飼料，並按說明書方法加水配置成液態食物，使用前加所需 濃度的酒精，每天更換 1 次以保持酒精濃度的穩定。該種液體飼料餵養模式已 經被廣泛用作研究 ALD 的動物模型。通過這種餵養方式 4~12 週，可模仿人類 慢性飲酒模式，最終可導致小鼠肝臟輕度肝損傷、肝脂肪變性和輕微的肝臟炎症。
相對於在飲用水中添加酒精的模式而言，餵食酒精液體飼料誘導肝損傷之動物模 式，被認為最適合應用於 ALD 早期階段病變研究的最佳模式 (Brandon-Warner et al. 2012)。因此衛生福利部在 2016 年 4 月公告，增訂酒精液態飼料誘導酒精 性脂肪肝評估辦法，也建立起完整酒精誘導肝損傷的動物模式。
3. 胃插管之誘發酒精性肝損傷動物模式 (Tsukamoto-French 模式)
為了克服動物厭惡酒精導致進食減少，學者 Tsukamoto 建立了一種經由手 術胃插管於實驗老鼠體內給予酒精液態飼料，此模式稱為 Tsukamoto-French 模 式。能連續給予固定含量酒精和營養素， 僅需四週即可誘導酒精性肝損傷 (Tsukamoto et al. 1985; Ueno et al. 2012)。此模式雖然能使血清中轉胺酶顯著增加、
肝臟脂肪變性和肝細胞發炎損傷。然而此模式因為有侵襲性的手術，需對動物進 行密切照顧防止併發症，需要有昂貴的配套設備，技術難度大，且動物飼養條件 高，長期胃插管的餵食方式也不符合經口攝食的正常途徑等缺點 (Tsukamoto et al. 1985)。
三、化學性肝損傷
化學性肝損傷是指由化學性肝毒性物質所造成的肝損傷，包括藥物、來自食
物的化學毒物、生產性工作中接觸的有機、無機毒物等。這些化學物質通過各種 途徑進入肝臟進行轉化，其毒性令肝臟受到不同程度的損害。由於在動物詴驗模 式中較容易，且許多毒物可同時誘發數種傷害，所以大多採用化學毒物誘導肝損 傷為主要研究模式，其中以 CCl4 為化學毒物中研究最為透徹的一種 (Rechnagel and Glende 1973)，可引起脂肪肝、肝細胞壞死和肝硬化，故大部分化學性肝損 傷會使用 CCl4作為誘導的傷害劑 (Luster et al. 2001)，且化學性肝損傷之動物模 式以四氯化碳腹腔或皮下注射的方式最常被利用於模擬人類肝損傷模式 (Luster et al. 2000)。
(一) 四氯化碳誘導化學性肝損傷之作用機轉
四氯化碳 (carbon tetrachloride, CCl4) 是透明無色液體，不具可燃性也不容 易溶於水，帶有一種即使少量也能嗅到的甜味，也被稱為四氯甲烷、四氯乙烷。
在工業上作為脫脂劑、製造冷卻劑、清潔劑、滅火器或去汙劑，在環境中四氯化 碳是普遍存在的。四氯化碳能由吸入、食入和皮膚吸收進入人體中，能穿透細胞 膜，抑制中樞神經系統活性並引起肝和腎損傷 (Basu 2003)。
四氯化碳造成肝損傷之機制是由四氯化碳進入體內後，經由肝細胞內質網上 的 cytochrome P-450 酵素系統 (含 CYP2E1、CYP2B1 和 CYP2B2) 作用，此解 毒系統主要由 CYP2E1 負責四氯化碳的代謝，其次則是 CYP2B1 和 CYP2B2 (Gruebele et al. 1996)。代謝後產生三氯甲烷自由基 (trichloromethyl radical, CCl3•
)，
當 CCl3•產生過多時，會與蛋白結合導致蛋白質合成受阻，並引起脂質分解代謝 失調，使肝細胞內三酸甘油酯蓄積；CCl3‧ 會和氧分子一同作用產生活性更大半 衰期更短的三氯甲烷自由基 (trichloromethyl peroxyl radical, CCl3OO‧)，CCl3OO‧ 經鹵烷化作用，如 : 鹵化物氯仿 (CHCl3)，使得核酸突變、蛋白質減少甲基化、
脂質堆積，造成肝損傷 (Weber et al. 2003)。然而 CCl4 也會使細胞內鈣離子濃度 增加，消耗體內抗氧化物質，並伴隨醛類生成，產生脂質代謝產物丙二醛 (malondialdehyde, MDA)，進而引發脂質過氧化，使得體內氧化壓力增加，造成 肝細胞的損傷，如圖 1-5 (Halliwell and Gutteridge 1986; Weber et al. 2003)。
(二) 四氯化碳誘發肝損傷之動物模式
圖 1-5 四氯化碳誘導肝損傷之機制
Fig 1-5 The mechanism of liver injury induced by carbon tetrachloride (Weber et al.
2003)
四氯化碳誘導肝損傷之動物模式給予方式主要有口服、皮下注射、腹腔注射 和氣體吸入等方式誘導。不同的給予方式，會使動物對四氯化碳的感受性差異非 常大，常常會造成有些動物只有肝臟組織中產生輕微的間隔，但有些動物卻因肝 硬化而死。四氯化碳可成功誘導急性或慢性的肝損傷 (Cheung et al. 2006;
Rusinski and Kolacinski 2003) 。給予一次或是極少次數之四氯化碳就能產生急性 的肝損傷而有脂肪肝及細胞壞死的現象，若增加四氯化碳給予次數，且給予之間 隔時間較短，在兩個月或是更久之後就會誘導出慢性肝損傷為出現肝硬化之症狀，
此種模式適用於許多動物，包括狗、豬、兔子、天竺鼠、大白鼠及小白鼠，小白 鼠對於四氯化碳敏感性較大白鼠高，但是投予的方式、劑量不同，所誘導的肝臟 疾病也會有所差異性 (Luster et al. 2000)，然而大多都將四氯化碳溶於 olive 和 corn oil 中以腹腔或皮下注射的方式誘導肝損傷，此模式也是最常被利用於模擬 人類肝損傷模式 (Luster et al. 2000)。
四、酒精性與化學性誘發動物肝損傷模式之比較
由下表 1-1 文獻整理結果得知，酒精性與化學性兩種誘導肝損傷之動物模 式，均能造成肝臟的損傷，但其作用機制以及肝損傷程度，還是有差異性的。
表 1-1 酒精性與四氯化碳誘發動物肝損傷模式之比較
Table 1-1 Comparison of alcohol and carbon tetrachloride-induceed liver injury
酒精性肝損傷 四氯化碳誘導肝損傷 文獻
給予方式 口服 (管餵、攝取液態 飼料)
口服、皮下注射、腹腔 注射和氣體吸入
(Luster et al.
2000; Shukla et al. 2013)
週數 4~12 週 4~8 週
(Brandon-Warn er et al. 2012;
Luster et al.
2000)
機制
酒精代謝產生氧化還 原狀態不帄衡和大量 的自由基，造成氧化壓
力使肝臟損傷
四氯化碳代謝產生大量 三氯甲烷自由基，造成 體內過氧化物堆積，導 致肝臟壞死、肝纖維化
(Erdogan et al.
2015; Weber et al. 2003) 肝損傷程
度
輕度肝損傷、肝脂肪變 性和輕微的肝臟炎症
重度脂肪變性、重度發 炎、肝纖維化
(Brandon-Warn er et al. 2012)
與人類肝 臟疾病的 相似度
酒精性脂肪肝會出現 小油滴，與人類相似
膠原蛋白含量相似，屬 於 typeⅠ 和Ⅲ 膠原蛋 白之混合型肝硬化 (人 類是 typeⅠ 膠原蛋白
含量較多)
(Lieber 1994;
Lieber et al.
1988; Weber et al. 2003)
優點 方法簡單可模仿人類
慢性飲酒模式
CCl4研究透徹，能成功 快速引起肝臟損傷
(Rechnagel and Glende 1973)
缺點
動物天性厭惡酒精，可 能使酒精的攝取量不
足
動物個體差異大，死亡 率高
(Luster et al.
2000)
第二節 台灣藜
全球藜科植物共約 110 屬，包含 1,500 種左右。廣泛分布於歐亞大陸、南 北美洲、非洲和大洋洲的半乾旱及鹽鹼地區。台灣藜過去僅依賴各地之原住民依 其農時播種，因此始終被誤會為外來引進植物，欠缺分類之研究比較，因此鮮有 人注意到台灣藜的特殊價值。林務局於 2006 年起委託專業團隊研究，比對美國、
英國及印度等國家標本館之模式標本後，於 2008 年正名為台灣藜
(Chenopodium formosana Koidz)，俗名為紅藜，為台灣特有種 (行政院農業委員 會, 2010)。
一、紅藜分布、生長特性介紹
台灣藜 (Chenopodium formosanum Koidz) 為台灣原住民族使用百年以上的 傳統糧食作物，大多分布在屏東、台東與花蓮低海拔地區，排灣族語稱台灣黎為 djulis，俗稱紅藜。紅藜生長期約只有四個月，雖屬草本植物，但植株莖部表面 木質化，內有髓心，可直立生長，高度可達 2 公尺以上。台灣藜的生長可分為 營養生長期與生殖生長期兩階段，由種子發芽到孕穗前稱為營養生長期；由孕穗、
開花、結實、果穗轉色、籽實 (帶有外殼的種子) 成熟掉落，這段期間稱為生殖 生長期。紅藜籽實成熟後，在陽光下曝晒 3 天乾燥後，可用傳統之杵臼或棍棒 敲打方式，分離藜籽與藜梗，並以風選去除渣葉等，再行乾燥後即可儲存或利用。
栽植季節以 10 月上旬至 3 月上旬較佳，應避開豪雨不斷的雨季 (6~9 月)。春 秋兩季栽植紅藜約 100 天即可採收，冬季栽植需時約 120 日 (行政院農業委員 會，2010)。
除榖粒外，臺灣藜植株部分亦可供作綠肥、盆栽及蔬菜等多種用途。而藜籽 實可作為炊飯及釀酒原料之用，而枝條及花穗可供觀賞花材等用。此外，其具有 栽培容易、生長旺盛、株型優美、穗色艷麗等特性，為兼具有美化農地、規劃造 景或花海材料等用途。臺灣藜適應性強、栽植容易、用途廣泛，全株富含多樣豐 富色素，有艷紅、桔紅、金黃、菊黃、橙黃等不同的艷麗色彩，是天然色素極好 的來源 (行政院農業委員會，2010)。
二、紅藜營養成分與機能性成分
紅藜具有特別豐富的蛋白質、礦物質、膳食纖維和必需胺基酸之基本營養成 分。研究指出，紅藜含有 23 種化合物，其中 16 種已被測定，其中又以 rutin、
betanin 和 kaempferol 等多酚為主要成分 (Chyau et al. 2015)，其中 rutin 為主佔 76%，皆具有抗氧化能力 (Slimestad and Verheul 2011; Tsai et al. 2010)。
(一) 一般營養成分
經過研究結果顯示，紅藜與目前市面上一些機能性食品相較，具有
特別豐富的之基本營養成分，例如含有約 50% 的澱粉，優質蛋白質大約 14%。
該蛋白質含量與小麥的蛋白質含量相近，故紅藜可以取代麵食，亦可以當素食者 基本糧食來源。同時，紅藜具有豐富的必需胺基酸，例如離胺酸 (lysine)、纈胺 酸 (valine) 和組胺酸 (histidine) 等，這些胺基酸是大多數穀類所欠缺的，且為 人體所無法自行合成 (行政院農業委員會林務局，2008)。紅藜也含有極高量 (14%) 的膳食纖維，目前似乎還找不到與其可以相比的食物。故食用紅藜不僅可 改善便秘，而且具有降低膽固醇 (Han et al. 2015)、抑制大腸癌發生 (Yao et al.
2017) 等文明病的功能。
無機礦物元素是人體許多生理活性的必要因子，研究顯示，紅藜含有豐富的 鈣、磷、鐵、鈉、鋅、鎂及鉀等礦物元素，其含量皆比其他常見的穀類來的高。
尤其鉀、鈣與鎂的含量別高，例如鉀為燕麥的 100 倍，香蕉的 12 倍；鈣各是 米與燕麥的 50 倍與 7 倍，均較黃豆還多，故可以充當植物性鈣質之一重要來 源，而鐵與鋅之含量則與黃豆類似，各為燕麥的 17 倍與 10 倍。至於可以強化 免疫力的稀有元素如硒 (Se) 或鍺 (Ge)，在紅藜中也可測得，前者為一般亞洲人 所缺乏，後者則為靈芝的重要機能性成分，故食用紅藜得以補充人體重要的微量 元素。故紅藜可以說是全方位營養之良好來源 (行政院農業委員會林務局，
2008)。
(二) 機能性成分
除了豐富的營養成份外，紅藜也含有高量優質的機能性成分，紅藜機能性成 分主要以酚類和甜菜色素為主。酚類化合物在自然界之中為植物二次代謝的產物，
可 以 提 供 氫 原 子 ， 防 止 自 由 基 生 成 ， 比 維 生 素 更 具 有 抗 氧 化 的 作 用 (Gonzalez-Vallinas et al. 2013; Hendrich 2006)。紅藜酚類以芸香苷 (rutin) 為主，
佔 76 %左右 (行政院農業委員會林務局，2008)。且經研究指出紅藜含芸香苷和 甜菜色素，可預防氧化壓力提高抗氧化酵素，減少細胞凋亡 (Chyau et al. 2015)。
芸香苷和甜菜色素許多相關研究如下:
1. 芸香苷 (rutin)
Rutin (3´,4´,5,7-tetrahydroxyflavone-3-rutinoside)，分子式為 C27H30O16 (圖 1-4)，
又稱為維生素 P，是一種黃酮類化合物，常存在於植物。芸香苷藉由葡萄醣苷酶 催化能水解產生槲皮素 (quercetin) 和芸香糖 (rutinose)(Shen et al. 2002)。
天然的芸香苷因為其藥理活性，常被作為提供血管保護的藥物，且是多種多 維生素製劑與草藥的成分，因此在製藥工業中為重要的類黃酮 (Buszewski et al.
1993)，目前全世界已有超過 130 個註冊含有芸香苷的治療藥物 (Erlund et al.
2000)。相關研究如下:
(1) 抗氧化
研究顯示，以大鼠為動物模式，觀察到芸香苷對環磷醯胺 (cyclophosphamide) 誘導氧化壓力之大鼠肝毒性具有改善作用，可能經由 NFκB 和 MAPK 路徑，
使抗氧化活性提高降低發炎因子表現量，因此芸香苷對氧化壓力和可能具有保護 作用 (Nafees et al. 2015)。另外有研究在體外詴驗中，芸香苷對不同的抗氧化能 力詴驗，例如總抗氧化活性，羥自由基清除詴驗，超氧自由基清除詴驗 ， 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 自由基清除測定和脂質過氧化測定，都有清 除自由基，依劑量效應具有抗氧化能力 (Yang et al. 2008)。
(2) 抗發炎
芸香苷的抗炎作用可以通過抑制參與發炎相關因子如 cyclooxygenase (COX) 和 lipoxygenase (LOX)，protein kinase C (PKC) 和 phosphoinositide 3-kinase 等，
進而達到抗發炎之作用 (You et al. 1999)。另有研究顯示，芸香苷對高膽固醇飲 食誘導發炎反應和肝毒性改善作用，能藉由抑制 NFκB 降低促發炎因子 IL-6 和 TNF-α 表現量，進而達到抗發炎之能力 (Sikder et al. 2014)。
(3) 抗癌
圖 1-6 芸香苷化學結構
Fig 1-6 Chemical structure of rutin (Chua 2013)
癌症的成因複雜繁瑣，但有許多研究證實已芸香苷之抗癌能力，能抑制白血 病 HL-60 細胞腫瘤生長在癌症動物模式中 (Lin et al. 2012)、抑制大腸癌細胞的 生長 (Deschner et al. 1991)等。
(4) 抗糖尿病
過去已有研究證實，芸香苷能經由提高胰島素釋放，使胰島素與其受體的結 合，達到抗糖尿病之作用 (Hii and Howell 1985; Jung et al. 2006)。
(5) 抗過敏
芸香苷經由調節血管內皮生長因子對過敏性鼻炎之保護作 (Kim et al.
2015)。
2. 甜菜色素 (betalains)
紅藜的莖、葉及花穗主要為紅、橙、黃、紫，其絢麗色彩的來源為甜菜色素，
因此有穀類紅寶石之美名。紅藜中的甜菜色素，主要是紅和黃，紅色品種主要以 紅色素為主，而黃色品種主要以黃色素為主。甜菜色素 (betalains) 是由甜菜紅 素 (betacyanins) 和組成甜菜黃素 (betaxanthins) 組成，然而有研究發現，甜菜紅 素當中甜菜苷 (betanin) 是主要抗氧化能力的來源 (Gliszczynska-Swiglo et al.
2006; Strack et al. 2003)。甜菜色素相關研究如下:
(1) 抗氧化
有研究顯示，甜菜色素經由 Trolox 當量抗氧化能力測定，甜菜色素具有清 除自由之能力，以達到抗氧化 (Gliszczynska-Swiglo et al. 2006)。另外有研究顯示，
以鯉魚為動物詴驗，甜菜色素對四氯化碳誘導肝損傷之動物模式，甜菜色素能提 高肝臟之抗氧化酵素活性，進而抑制氧化壓力改善氧化損傷 (Han et al. 2014)。
三、紅藜保健之相關研究
(一) 抗氧化之體內與體外相關研究
有研究發現經由 HPLC-DAD 和 HPLC / ESI-MS / MS 測定紅藜水萃取物含 有 rutin、betanin 和 kaempferol 等抗氧化物質，並經由體外細胞存活率詴驗，在
1.0 至 100μM 範圍 rutin、betanin 和 kaempferol 均對細胞無毒性作用。紅藜水 萃取物藉由提高抗氧化物質 GSH 含量、降低 ROS 生成和降低 caspase-3 活性 且提高細胞凋亡指標 Bcl-2/Bax 比值，進而改善對 tert-butyl hydroperoxide (t -BHP) 誘導人類 HepG2 細胞產生氧化損傷，由此證實紅藜含有抗氧化物質可能 由抑制氧化壓力藉以達到改善細胞氧化損傷 (Chyau et al. 2015)。
而在體內詴驗也有相關研究，探討利用紅藜水萃取物其活性物質 rutin、
betanin 和 kaempferol 對四氯化碳誘導大鼠肝損傷動物模式的改善作用，發現紅 藜水萃物能提高 GSH 含量、增強 SOD 活性、降低 DNA 損傷和抑制脂質過氧 化，因此認為提高 GSH 和增強 SOD 活性，能使細胞內 TBARS 和 ROS 減少 是因 rutin、betanin 和 kaempferol 的抗氧化活性改善抗肝損傷 (Chu et al.
2016)。
(二) 抗發炎之體內相關研究
紅藜水萃取物也能改善皮膚損傷。UVB 照射會形成氧化壓力進而引起發炎、
細胞結構改變甚至細胞凋亡造成皮膚真皮損傷，而紅藜水萃取物能降低 ROS 生 成，進而抑制促炎因子 IL-6 和 MMP-1 含量，在體外詴驗中證實具有保護皮膚 損傷之能力。另外，在紅藜水萃取物對 UVB 照射誘導小鼠皮膚損傷之動物模式 中 UVB 能誘導大量 ROS 生成，進而觸發 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 並活化促炎因子 IL-6 和 MMP-1，而研究證明紅藜水萃取物其活性成分 rutin 能增強細胞活性，抑制 ROS 的生成進而降低促炎因子 IL-6 和 MMP-1 含量，
減緩發炎反應，達到保護皮膚損傷之功效 (Hong et al. 2016)。
第三節 紅藜預防肝損傷之潛力
一、Rutin 預防肝損傷之過去研究
已知 rutin 已有清除自由基之潛力，有研究證實 rutin 能經由 IL-6/STAT3 路 徑逆轉基因表現改善 CCl4 引起的肝毒性，進而保護 CCl4 誘導的肝毒性 (Hafez et al. 2015)。有研究顯示 rutin 能改善經由腹腔注射環磷醯胺 (cyclophosphamide) 誘導大鼠肝毒性，rutin 能經由提高抗氧化酵素並抑制 p38-MAPK、NFκB、COX-2、
TNF-α和 IL-6 可以降低 ROS 誘導的氧化壓力及發炎反應，因此 rutin 可能藉由
NFκB 和 MAPK 途徑降低環磷醯胺誘導的氧化壓力 (圖 1-7)，已達到護肝之潛 力 (Nafees et al. 2015)。
二、Betanin 預防肝損傷之過去研究
有研究顯示以鯉魚為實驗動物，betanin 對腹腔注射 CCl4 誘導鯉魚肝損傷 改善作用，betanin 能提高肝臟抗氧化酵素活性 SOD、CAT 和 GSH 含量，並 降低 CYP2E1 活性和脂質過氧化物的生成，進而抑制氧化壓力達到保護肝臟之 作用 (Han et al. 2014)，因此 Betanin 具有預防肝損傷之潛力。
圖 1-7 Rutin 預防肝損傷之路徑
Fig 1-7 Prevention pathway of liver damage of by rutin (Nafees et al. 2015)
第二章 研究動機與架構
第一節 研究動機與目的
造成肝臟疾病之主要誘因有病毒性、酒精性與化學性，不同的誘因會使肝臟 發生不同程度的病變或損傷，影響的程度也可能有所不同。然而肝炎病毒不易培 養與分離，難以建立病毒性肝損傷之完整的動物模式，故常用酒精和各種化學物 質誘導實驗動物肝臟損傷來模擬人類肝臟發炎受損之情形。長期飲用酒精使肝臟 產生氧化發炎，並抑制 AMPK 活性，使 PPAR-α、CPT-1 和 ACC 活性降低，
造成脂肪酸氧化，此外 SREBP 活性增加使脂肪分解速度降低及脂質生合成速度 增加，因此脂質無法有效清除並堆積於肝臟形成脂肪肝，而脂肪肝是屬可逆性疾 病，是 ALD 的最早病徵，早期診斷並及時治療常可恢復正常。化學性肝損傷之 動物模式最常以四氯化碳腹腔或皮下注射的方式最常被利用於模擬人類肝損傷 模式，當四氯化碳進入體內後，是經由活化 CYP2E1 形成 CCl3
‧ 和三氯甲基過 氧自由基 CCl3OO‧，該自由基可通過細胞膜結合核酸，蛋白質和脂質，產生脂 質過氧化反應造成肝細胞壞死，進一步發展為肝纖維化，然而肝纖維化為慢性肝 病形成肝硬化前之最終可逆階段，是肝病治療的重要環節。因此，酒精性和化學 性雖然都是肝損傷的誘導方式，但其作用機轉和損傷程度而言，還是有其差異 性。
紅藜為台灣特有種，除了富含豐富的蛋白質、礦物質、膳食纖維和必需胺基 酸之基本一般營養成分，另有研究指出紅藜也含有高量優質的機能性成分，主要 以酚類和甜菜色素為主。紅藜酚類以 rutin 為主，且具有清除自由基，有抗氧化、
抗發炎與抗癌之效果。已知 rutin 已有清除自由基之潛力，能經由提高抗氧化酵 素並抑制發炎因子降低活性氧誘導的氧化壓力及發炎反應，以達到護肝之改善效 果。
本實驗以酒精誘導小鼠肝損傷和四氯化碳誘導肝損傷之動物模式，探討紅藜 全榖粉末、殼萃取物和 rutin 對肝損傷的改善效果，共同探討兩個模式中血清中 肝損傷指標 AST、ALT 與 ALP 以及肝臟中抗氧化酵素活性、抗氧化物質含量、
脂質過氧化能力。並探討脂質生合成相關因子對酒精誘導脂肪肝之改善效果以及 了解發炎與纖維化因子對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化之改善效果。
第二節 研究架構
本論文的研究架構如圖 2-1 所示，以台灣藜 (Chenopodium formosanum Koidz) 作為實驗的詴驗物質，首先以新鮮且色彩鮮明的紅藜全穀作為樣品，並 將紅藜殼與去殼紅藜穀分離。紅藜殼用於酒精和水萃取製備成紅藜酒萃物、紅藜 水萃物，而去殼紅藜穀磨成粉末，製備成紅藜粉末。經由 high performance liquid chromatography (HPLC) 分析紅藜酒萃物、水萃物和粉末中 rutin 含量。再分別 以酒精液態飼料誘導小鼠肝損傷和四氯化碳誘導小鼠肝損傷之動物模式，經餵食 詴驗物質後，共同分析血清中肝損傷指標 AST、ALT 和肝臟病理切片 H&E 染 色觀察肝組織損傷程度，及肝臟中抗氧化酵素活性、脂質過氧化物。並探討在酒 精誘導脂肪肝中脂質代謝合成相關因子，分析血清中三酸甘油酯、總膽固醇提高 以及肝臟中產生脂質堆積，造成脂肪肝，探討紅藜、紅藜萃取物與 rutin 是否能 改善脂肪肝之效果。在四氯化碳誘導的動物模式中，四氯化碳代謝會產生大量的 自由基，可通過細胞膜結合核酸，蛋白質和脂質，產生脂質過氧化反應造成肝細 胞壞死，促使肝臟中膠原堆積的產生，進一步發展為肝纖維化，利用膠原染色觀 膠原堆積的現象、分析發炎及纖維化因子，探討紅藜、紅藜萃取物與 rutin 能否 藉由抑制氧化和發炎達到改善肝纖維化。
圖 2-1 本論文研究架構
Fig. 2-1 The outline of this study
第三章 材料與方法
第一節 實驗材料
一、儀器設備
1. 熱風烘箱 (Forced convection oven) (XIN-XONG, Inc., Kaohsiung, Taiwan) 2. 電子天帄 (Electronic Balance) (AY-220, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)
3. 電磁加熱攪拌器 (Hotplate & Stirrer) (SH-301, Suntex Instruments Co., Ltd, New Taipei, Taiwan)
4. 高 速 冷 凍 離 心 機 (Universal Centrifuge) (Z326K, Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany)
5. 生物樣本均質機 (Homogenizer) (Prep-CB24, Medclub Scientific Co., Ltd, Taoyuan, Taiwan)
6. 小型離心機 (Compact Centrifuge) (Z206A, Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany)
7. 恆溫水浴槽 (Water bath) (OSB-2000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Tokyo, Japan) 8. 全光譜 微量盤 分析 儀 (Microplate Spectrophotometer) (Multiskan ™ GO,
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)
9. 振盪混合器 (Vortex mixer) (VM-2000, Digisystem Laboratory Instruments Inc., New Taipei, Taiwan)
10. 超純水機 (Ultrapure water system) (PURELAB Classic UV MK2, ELGA Lab Water Co., Marlow, UK)
11. 酸鹼度計 (pH meter) (UltraBasic pH Meter, Denver Instrument Co., Goettingen, Germany)
12. 粉碎機 (Turbo mill) (RT-01A, Shin Kwang Metal Heat-Treatment Industry Co., New Taipei, Taiwan)
13. 半乾式快速轉漬器 (Semi-dry fast blotter) (Pierce G2 Fast Blotter, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)
14. 高效能液相層析儀 (High performance liquid chromatography, HPLC) (Model L-2130, Hitachi Co., Tokyo, Japan)
15. HPLC 二極光偵測器 (Photodiode array) (Model L-2455 DAD, Hitachi Co., Tokyo, Japan)
16. HPLC 螢光偵測器 (Fluorescence Detector) (Model L-2485 FL Detector,
Hitachi Co., Tokyo, Japan)
17. HPLC 樣品自動注射器 (Autosampler) (Model L-2200 Autosampler, Hitachi Co., Tokyo, Japan)
18. HPLC 管柱恆溫器 (Column heater) (CH-500, Chrom Tech, Inc., Minnesota, MN, USA)
19. HPLC C18 層析管柱 (C18 column) (Ascentis® C18 HPLC Column, 5 μm, 25 cm × 4.6 mm, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)
20. HPLC 保護管柱支架 (Guard column holder) (MIGHTYSIL guard column holder, for 4.6/6 mm, KANTO CHEMICAL Co., INC., Tokyo, Japan)
21. HPLC C18 保護管柱 (C18 guard column) (MIGHTYSIL RP-18 GP Aqua, 5 μm,5 × 4.6 mm, KANTO CHEMICAL Co., INC., Tokyo, Japan)
22. HPLC C18 層析管柱 (C18 column) (MIGHTYSIL RP-18 GP Aqua, 5 μm, 250
× 4.6 mm, KANTO CHEMICAL Co., INC., Tokyo, Japan)
二、藥品
(一) 動物實驗相關藥品
1. Rutin 購自 Sigma 公司, CAS Number 207671-50-9 (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO, USA)
2. 95% Ethanol 購自景明化工股份有限公司
3. Carbon tetrachloride 購自皓峯企業股份有限公司 (ALPS.CHEM.CO.LTD) 4. Corn oil 購自主惠實業股份有限公司
(二) 抗體
1. 購自 EMD Millipore Corporation (Temecula, CA, USA) (1) Anti-β-actin antibody, polyclonal (ABT264)
(2) Anit-alpha-Actin (Smooth Muscle), monoclonal (04-1094)
2. 購自 Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA) (1) Anti-β-actin antibody, monoclonal (MA5-15739)
3. 購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA)
(1) Anti-IL-1β antibody, polyclonal (sc-32284) (2) Anti-IL-6 antibody, polyclonal (sc-57315) (3) Anti-PPARαantibody, polyclonal (sc-398394)
4. 購自 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) (1) Anti-Acetyl-CoA Carboxylase antibody, monoclonal (3676)
5. 購自 Merck KGaA. (Millipore) (Darmstadt, Germany) (1) Anti-TNF-α antibody, polyclonal (AB2148P)
(三) 測定套組
1. 購自 Randox Laboratories Ltd. (Crumlin, Antrim,UK) (1) Superoxide Dismutase (Ransod,SD125)
(2) Glutathione Peroxidase (Ransel,RS505)
2. 購自 BioAssay Systems LLC.(Hayward, CA,USA) (1) EnzyChormTM Catalase Assay Kit (ECAT-100) (2) EnzyChromTM GSH/GSSG Assay Kit (EGTT-100)
3. 購自 Fortress Diagnostics Ltd. (Antrim, UK)
(1) TG 分析套組 (TRIGLYCERIDES Monoliquid GOP-PAP) (2) TC 分析套組 (CHOLESEROL CHOD-PAP)
4. 購自 Elabscience Biotechnology Co.,Ltd (MD, USA)
(1) Mouse TGF-β1 (Ttansforming Growth Factorβ1) ELISA Kit (E-EL-M0051)
第二節 實驗方法
一、紅藜萃取物製備與 rutin 分析 (一) 樣品前處理
本實驗使用之台灣藜 (Chenopodium formosanum Koidz) 的種籽由信豐農業 生技股份有限公司所提供，以新鮮且色彩鮮明的紅藜全穀作為樣品。首先挑除較
大的枝葉等雜質後，進行研磨，並收集外層殼粉。紅藜研磨至穀粒呈現部分白色 為止，外層殼粉以及紅藜全穀均儲藏於 4℃。
1. 紅藜酒精萃取物
秤取 120 g 紅藜殼粉加入 600 mL 50% 乙醇，置於血清瓶中，以水浴加熱 至 50 ℃ 進行萃取並以磁石攪拌器攪拌，當樣品溫度達到帄衡後持續萃取 2 hr。
樣品在 4℃ 下以 6,000 x g 離心 5 min，取上清液以抽氣過濾 2 次。過濾後的 萃取液先以減壓濃縮機除去大部分酒精，再經由冷凍乾燥除去水分後即為酒精萃 取物。
2. 紅藜水萃取物
秤取 120 g 紅藜殼粉加入 1200 mL RO 水，置於血清瓶中，以水浴加熱至 50 ℃ 進行萃取並以磁石攪拌器攪拌，當樣品溫度達到帄衡後持續萃取 2 hr。樣 品在 4℃ 下以 6,000 x g 離心 5 min，取上清液以抽氣過濾 2 次。過濾後的萃 取液經由冷凍乾燥除去水分後即為水萃取物。
(二) 萃取物之 HPLC 分析功效成分 rutin
將萃取物以水回溶，稀釋調整至適合的濃度，以 0.45 μm 孔徑濾膜進行過 濾後依照表 3-1 的條件進行 HPLC 分析，分析過後的數據經計算回推原本每克 紅藜內所含 rutin 的量。
二、紅藜萃取物對酒精和四氯化碳誘發肝損傷動物詴驗模式 (一) 動物飼養
本研究實驗動物購自財團法人國家實驗動物研究院實驗動物中心之 7 週齡 C57BL/6J 品系雄性小鼠與 BALB/C 品系雄性小鼠各 48 隻，每組 8 隻，分別 為酒精與四氯化碳誘導肝損傷之動物實驗。飼養於溫度 23 ± 1oC，相對濕度 60 ± 5% 光照時間為 8:00 - 20:00 之 12 小時循環光照環境下，食物與水皆不予限制。
本動物實驗計畫經臺東大學實驗動物使用及動物實驗管理小組 (IACUC) 審核 通過。
表 3-1 Rutin 之 HPLC 分析條件 Table 3-1 HPLC analysis of rutin
Column RP-18 GP 250-4.6 (5 μm) Mobile phase Solvent A: 0.1% Trifluoroacetic acid
Solvent B: Acetonitrile Flow rate 1 mL/min
UV wavelength 250 nm Sample inject volume 20 μL
(二) 動物分組與詴驗物質劑量
預養一週後隨機分為六組，動物實驗進行 6 週，詴驗物質以管餵方式每日 給予固定量，其詴驗物質餵食劑量則依據美國 FDA 公告，以 60 公斤之成人為 基準，人體每日每公斤體重之建議攝取量的 12.3 倍為小鼠之劑量，分組與詴驗 劑量如表 3-2 和 3-3。
(三) 動物詴驗模式
1. 酒精誘導肝損傷之動物模式
C57BL/6J 品系小鼠被選為誘導酒精肝損傷模式之動物，因為比其它品系老 鼠易受酒精誘導形成肝損傷 (Anji and Kumari 2008)。本研究以餵食酒精液態飼 料 (Lieber-DeCarli ethanol liquid diet) 誘發肝損傷，實驗進行 6 週，每日以管餵 方式餵食固定劑量的詴驗物質。正常組依照 221.78 g 飼料與水混合配置成 1 L 液態飼料，其他組別依照所需總能量所提供之 36% 碳水化合物以酒精取代，將 132.18 g 飼料粉末與 67 mL 濃度 95％ 乙醇混合配置成 1 L 液態飼料，每日提 供 18 mL 液態飼料，詳細飼料配方如表 3-4 和 3-5。
2. 四氯化碳誘導肝損傷之動物模式
BALB/C 品系雄性小鼠用於四氯化碳誘導肝損傷模式之動物，實驗進行 6 週，每日以管餵方式餵食固定劑量的詴驗物質。正常組每週腹腔注射 2 次 (星 期四和日) corn oil，注射量為 100 µL，其他組別注射四氯化碳，其劑量依體重調 整 (0.5 mL CCl4 in corn oil/kg BW)。
(四) 動物犧牲
使用二氧化碳窒息法將小鼠犧牲後，快速取下肝臟，並以生理食鹽水清洗肝 臟表面，再以擦手紙將水吸乾，秤取肝重，切取肝臟第二大葉部分組織，置入組 織包埋盒並浸泡於 10％ 福馬林，進行石蠟包埋與切片，供後續組織染色分析使 用，剩餘之所有肝臟組織以 0.9％ 生理食鹽水清洗內部血液，分割肝臟為第一 大葉、第二大葉與剩餘肝臟組織，裝入夾鏈袋浸泡於液態氮後，保存於-80℃ 箱 中，供日後分析使用。
表 3-2 紅藜萃取物與其 rutin 對酒精誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗物 質劑量
Table 3-2 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Red Quinoa extract on the prevention of ethanol-induced liver injury in mice Groups Liquid
alcoholic diet
Sample Rutin Dosage (mg/kg mice )
Feeding Dosage (g/kg mice)
NOR - RO water - -
EtOH + RO water - -
HL-P + red quinoa whole grain 8.46 5.13 HL-E + red quinoa ethanol extract
of Seed Coats
16.4 1.54
HL-W + red quinoa water extract of Seed Coats
3.92 1.54
Rutin + Rutin 16.4 -
NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice, HL-P: ethanol induced liver injury mice fed 5.13 g/kg (rutin 8.46 mg/kg) of red quinoa-powder, HL-E:
ethanol induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 16.4 mg/kg) of red quinoa- ethanol extracts, HL-W: ethanol induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 3.92 mg/kg) of red quinoa-water extracts, Rutin: ethanol induced liver injury mice fed 16.4 mg/kg of rutin.
表 3-3 紅藜萃取物其 rutin 對四氯化碳誘發小鼠肝損傷詴驗之動物分組與詴驗 物質劑量
Table 3-3 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Red Quinoa extract on the prevention of CCl4-induced liver injury in mice
Groups CCl4 in corn oil (0.5mL/kg
bw)
Sample Rutin Dosage (mg/kg
mice )
Feeding Dosage (g/kg mice)
NOR -(corn oil) RO water - -
CCl4 (CCL) + RO water - -
HL-P + red quinoa whole grain
8.46 5.13
HL-E + red quinoa ethanol extract of seed coats
16.4 1.54
HL-W + red quinoa water extract of seed coats
3.92 1.54
Rutin + Rutin 16.4 -
NOR: normal group, CCL : CCl4 induced liver injury mice, HL-P: CCl4 induced liver injury mice fed 5.13 g/kg (rutin 8.46 mg/kg) of red quinoa-powder, HL-E: CCl4 induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 16.4 mg/kg) of red quinoa- ethanol extracts, HL-W: CCl4 induced liver injury mice fed 1.54 g/kg (rutin 3.92 mg/kg) of red quinoa-water extracts, Rutin: CCl4 induced liver injury mice fed 16.4 mg/kg of rutin.
