第三章 材料與方法
第三節 實驗方法
(一) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物 (PLF & PLM) 由輔英科技大學保健營養系王志傑老師提供
24 medium (含 5% fetal bovine serum、10% horse serum)，培養於 37℃、
5% CO2 之環境下，每星期繼代培養兩次。
2. 桑黃乙醇萃取物抑制 Aβ40 毒性之試驗 - MTT assay
MTT 是一種 tetrazolium salt，全名是 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]
2,5-diphenyl -tetrazolium bromide，為一黃色的染劑，可被活細胞吸收 並被粒線體 (mitochondria) 中的 succinate tetrazolium reductase (一種 succinate dehydrogenase) 還原成藍色的 formazan，常用來檢測細胞的 增殖。將5 × 104 個 PC12 細胞置於 96-well 中培養 24 hr 後，培養
Cell viability (%) = (Sample-Blank) / (Control-Blank) ×100％。
3. 脂 蛋 白 脂 質 過 氧 化 測 定 分 析 法 (thiobarbituric acid reactive substances；TBARS)
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脂質過氧化分析法是參考 Tarladgis et al. 之方法 (Tarladgis et al.
1964)，以 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) 為標準品，先以二次蒸 餾水將 TMP 稀釋為 1 mM，再以 1 N H2SO4 溶液將其濃度分別稀釋
利用樣品若含丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 與 thiobarbituric acid (TBA) 溶液在酸性環境下，加熱一段時間後會生成粉紅色物質，並在
26 Corporation, Palo Alto, CA, USA.)，輸注速率 0.25 μL/hr，內容量 234 μL，與腻部輸注套組 (brain Infusion Kit II，3-5 mm，Alzet©) 組 35% acetonitrile、0.1% trifluoroacetic acid 之溶液。配製完成的 Aβ40 溶 液 或 未 加 入 Aβ40 之 溶 液 ( 做 為 Vehicle 組 ) 注 入 mini-osmotic pump，接上 brain infusion kit II 並使溶液充滿整個 輸注管與輸注頭。將軟管結成單結狀，使 pump 與輸注頭間有一 2005)。待完成鑽孔後，將 brain infusion kit II 之輸注頭置入，輸
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表 3-1、桑黃子實體 (PLF) 與固態發酵 (PLM) 乙醇萃取物改善 Aβ40 腻部輸 注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試驗之動物分組
Table 3-1 Animal grouping for the study on the effect of the ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) and mycelium (PLM) on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ40-infused rat
Groups Brain infusion sample Samples (dosage) Hispidin concentration (μg/ml)
Vehicle vehicle solution water 0
Aβ Aβ40 water 0
PLF-L Aβ40 PLF (25 mg/kg/day) 44.52 PLF-H Aβ40 PLF (75 mg/kg/day) 133.56 PLM-L Aβ40 PLM (25 mg/kg/day) 11.54 PLM-H Aβ40 PLM (75 mg/kg/day) 34.63
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圖 3-1、ALZET 腻部輸注幫浦
Fig. 3-1 Mini-osmotic pump and brain infusion kit II (Alzet©, http://www.alzet.com/)
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圖 3-2、腻部輸注 Aβ40 之手術流程 (林 2012)
Fig. 3-2 The surgery process of intracerebroventricular infusion of Aβ40
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圖 3-3、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試 驗日程表
Fig. 3-3 The experiment schedule of learning and memory task of ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) and mycelium (PLM) for Alzheimer's disease rats
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圖 3-4、水迷宮裝置與分區域示意圖 Fig. 3-4 Instrument of water maze task
34 (Yamaguchi et al., 2006) 分成 cortex、hippocampus 區域。分別加 入 lysis buffer 均質。Cortex 分成左右腻，各加入 1 mL buffer 後，
35 3 M paper、已用 methanol 溼潤的 polyvinylidene fluoride (PVDF) 轉 漬膜、電泳膠片、5 張 3 M paper，將其組合完成後將以轉漬槽上蓋
(6) 組織免疫染色 (immunohistochemistry stain)
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大鼠犧牲後取腻組織並快速浸泡於 10% 的福馬林中，進行
石蠟包埋與切片 (3-5 μm/片)。將完成的組織切片置於 superfrost coating slide 上，以 45oC 烘片隔夜。之後將切片置於 xylene 中 脫臘 3 次，每次 10 min。隨後依序置入 100%、95%、85%、75%、
65%、55% 之乙醇溶液中去除 xylene。再以 TBS 溶液清洗 3 次，
每次 5 min 進行回水作用。切片浸泡於 10 mM 之檸檬酸鈉中，
並以 100oC 加熱 30 min 以進行抗原復性作用，待其冷卻。完成 後立即將切片浸泡於室溫的 TBS 溶液中 10 min。以邊界筆 (DakoCytomation Pen, Glostrup, Denmark) 在切片之組織外圍進 行圈畫。加入適量 3% H2O2 反應 10 min。再以 TBS 溶液清洗 1 次。加入 10% goat serum-PBS 溶液進行 blocking 作用 1 hr。甩 掉 blocking 溶液並滴上已稀釋之抗體溶液 (Monoclonal sAPPα antibody, Monoclonal Aβ40 antibody)，於 4oC 下反應隔夜或 37℃
反應4 小時。完成後以 TBS 溶液清洗 1 次。加入 superenhancer 溶液於室溫下避光反應 30 min。再以 TBS 溶液清洗 1 次後以 DAB 呈色 1.5 min。再以 hematoxylin 進行 counter stain。完成 後於光學顯微鏡下觀察。
(四) 統計方法
實驗結果均以平均值 ± 標準誤差 (mean ± SD) 表示。利用 SPSS 系統 之單因子變方分析 (One-way ANOVA) 進行統計處理，再以 Duncan’s multiple range test 作組間的差異性比較，p< 0.05 表示具有顯著性差異。
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