國立臺東大學生命科學系 碩士論文
Department of Life Science National Taitung University Master Thesis
指導教授： 李俊霖 博士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph.D.
探討桑黃子實體與固態發酵物之乙醇萃取物對類澱粉 樣蛋白 1-40 誘導阿茲海默症之改善效果
Effect of the Ethanol Extract of Fruiting Body and the Fermented Product of Phellinus linteus on Improvement
of β-Amyloid 1-40 Induced Alzheimer's Disease
研 究 生：郭亭采 撰 Graduated student: Ting-Tsai Kuo
中華民國 107 年 1 月
June, 2018
II
國立臺東大學生命科學系 碩士論文
Department of Life Science National Taitung University Master Thesis
探討桑黃子實體與固態發酵物之乙醇萃取物對類澱粉 樣蛋白 1-40 誘導阿茲海默症之改善效果
Effect of the Ethanol Extract of Fruiting Body and the Fermented Product of Phellinus linteus on Improvement
of β-Amyloid 1-40 Induced Alzheimer's Disease
研 究 生：郭亭采 撰 Graduated student: Ting-Tsai Kuo
指導教授： 李俊霖 博士 Advisor: Chun-Lin Lee, Ph.D.
中華民國 107 年 1 月
June, 2018
III
IV
V
謝誌
首先感謝口試委員們能抽空參加我的學位論文審查並給予指導與建議。同時 感謝李俊霖老師這二年半的指導，不論是在課業與研究方面，李老師總是願意與 我討論並提供適當的協助，我覺得我不是個合格的研究生，總是想逃避與老師溝 通的機會，而老師會主動關心我的進度，讓我能在時限內順利完成碩士學位，真 的很謝謝老師。感謝生命科學系系辦助理蘇怡菁學姊在就學期間提供行政上的協 助，讓我順利完成很多複雜的流程，並在私底下提供了許多娛樂設備，讓我能在 繁重的課業壓力下喘口氣。感謝黃祥恩老師在我的大學生涯中指導專題，提供意 見並幫我寫推薦函，在我決定從植物生理領域跨足到動物科學領域時也二話不說 地支持我，並幫我找李俊霖老師洽談，真的相當感謝。感謝李老師實驗室及黃老 師實驗室的學長姐帶領我實驗上的技巧並完成許多研究。同時也要感謝同學之間 的幫忙，謝謝林庭安、柯柏均、李中佑和黃志暄從大學到碩士一路上的協助，沒 有你們我應該走不完全程。在實驗方面，感謝劉欣華學妹教導我細胞實驗，吳彥 忠、佘文良、陳宥儒、張育誠、王奕婷、潘崇銘、鄧逸文、陳芷希與黃秀琦協助 我進行動物實驗。最後要感謝我的家人總是鼓勵我並支持我做我想做的事。
I
中文摘要
阿茲海默症 (Alzheimer’s Disease, AD) 是常見的腻神經退化性疾病，其成因 頗為複雜，其中類澱粉樣蛋白 (amyloid β-peptide, Aβ) 假說是目前最為學界接受 的理論。Aβ 在腻部堆積會造成氧化壓力與發炎反應，進一步使神經元受損，造 成記憶學習能力的障礙。桑黃 (Phellinus linteus, PL) 為一種藥用真菌，前人研究 指出 PL 具有抗氧化及抗發炎之能力。本實驗以 PC12 神經纖維母細胞株與 Aβ40 共處理的細胞模式，加上 SD 大鼠連續 28 天腻部注射 Aβ40 之阿茲海 默症模式大鼠，探討桑黃子實體 (fruiting body of Phellinus linteus, PLF) 與固態 發酵物 (fermented product of Phellinus linteus, PLM) 之乙醇萃取物可否藉由降低 Aβ40 所誘導之記憶學習能力損傷、危險因子及相關氧化發炎反應，以達到改善 AD 之效果。在細胞模式中，與 Aβ40 共處理之 PLF 與 PLM 乙醇萃取物皆可 有效提高 PC12 細胞的存活率，且可提升其抗氧化能力。在動物模式中餵食 PLF 與 PLM 乙醇萃取物之組別其記憶學習能力較 Aβ40 組為佳。以細胞模式進一 步以純物質 hispidin 探討其是否為 PL 之主要功效成分，結果發現 hispidin 提 升 PC12 細胞抗氧化能力，由此推論 PLF 與 PLM 可能藉由降低由 Aβ40 引 起之氧化發炎反應，以達到改善 AD 之效果，且 hispidin 可能是其有效成分之 一，未來將進一步探討其作用機制。
關鍵字：阿茲海默症、類澱粉樣蛋白 1-40、氧化發炎反應、桑黃、hispidin
II
Abstract
Alzheimer's disease (AD) is a common neurodegenerative disease, its causes are complicated. Currently, the amyloid hypothesis is the most accepted theory of AD’s formation. Amyloid β-peptide (Aβ) deposition in the brain will cause oxidative stress and inflammatory responses, and further make the neurons injury, resulting in impairment of memory learning ability. Phellinus linteus (PL) is a medicinal fungus;
previous study has shown that PL has antioxidant and anti-inflammatory ability. In this study, we investigate whether the ethanol extract of the fruit body of PL (PLF) or the fermented product of PL (PLM) can reduce the oxidative stress and inflammatory response induced by Aβ40 in vitro and in vivo to achieve the effect of improving AD.
In in vitro cell model, the ethanol extracts of PLF and PLM can effectively improve the cell viability of PC12 cells which are co-treated with Aβ40, and can enhance their antioxidant capacity. In AD animal model, the memory and learning ability of the ethanol extract of PLF and PLM were better than the Aβ40 group. And then we use cell model to explore whether hispidin is the main functional ingredients in PL, it showed that hispidin enhances the antioxidant capacity of PC12 cells. The results suggest that PLF and PLM may against AD by reducing the oxidative stress and inflammatory response, and hispidin may be one of the active ingredient in the extract of PL. In future we will further explore its mechanism of action.
Keywords：Alzheimer’s Disease, amyloid β-peptide 1-40, anti-oxidative and anti-inflammatory effect, hispidin, Phellinus linteus
III
縮寫表
AD (Alzheimer’s Disease)：阿茲海默症 Ach (acetylcholine)：乙醯膽鹼
AchE (acetylcholinesterase)：乙醯膽鹼酯酶 ApoE (apolipoprotein E)：載脂蛋白 E
APP (amyloid precursor protein)：類澱粉樣前驅蛋白
sAPPα (soluble amyloid precursor protein α-secretase cleaved fragment)：水溶性類澱
粉樣前驅蛋白α-分泌酶剪切片段
sAPPβ (soluble amyloid precursor protein β-secretase cleaved fragment)：水溶性類澱
粉樣前驅蛋白β-分泌酶剪切片段
Aβ (amyloid β-peptide)：類澱粉樣蛋白
Aβ40 (amyloid β-peptide 1-40)：類澱粉樣蛋白 1-40 ARE (antioxidant responsive element)：抗氧化反應區位 BACE (beta-site cleaving enzyme, β-secretase)：β-切位剪切酶 CAT (catalase)：過氧化氫酶
COX (cyclooxygenase)：環氧化酶
CYP (cytochrome P450)：細胞色素 P450 GSH (glutathione)：榖胱甘肽
IgE (Immunoglobin E)：免疫球蛋白 E INF-γ (interferin-γ)：干擾素-γ
IL-1β (interlukin-1β)：介白素-1β IL-2 (interlukin-2)：介白素-2 IL-4 (interlukin-4)：介白素-4 IL-6 (interlukin-6)：介白素-6
IV
IL-10 (interlukin-10)：介白素-10
iNOS (inducible nitric oxide synthase)：誘導型一氧化氮合成酶 LPS (lipopolysaccharide)：脂多醣
MAPK (mitogen-activated protein kinase)：促分裂原活化蛋白激酶 MMP-9 (matrix metalloproteinase-9)：基質金屬蛋白酶-9
NMDA receptor (N-methyl-D-aspartate receptor)：N-甲基-天門冬胺酸受體 NO (nitric oxide)：一氧化氮
NF-κB (nuclear factor kappa B)：核轉錄因子-κB
Nrf2 (nuclear factor E2-related factor 2)：核轉錄因子 E2 相關因子 2
PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor)：過氧化物酶體增殖物活化受體 PKCδ (protein kinase C δ)：蛋白激酶 C δ 型
ROS (reactive oxygen species)：活性氧原子 SOD (superoxide dismutase)：超氧化物歧化酶
TH1 (T Helper type-1 lymphocytes)：第一型輔助 T 淋巴球 TH2 (T Helper type-2 lymphocytes)：第二型輔助 T 淋巴球 TNF-α (tumor necrosisfactor-α)：甲型腫瘤壞死因子
V
目錄
中文摘要 ... I Abstract ... II 前言 ... XI
第一章 文獻回顧 ... 1
第一節 阿茲海默症之相關研究 ... 1
第二節 桑黃之簡介 ... 9
第三節 桑黃保健功效及功效成分與神經相關疾病之關聯 ... 17
第二章 實驗動機與實驗架構 ... 19
第一節 實驗動機與目的 ... 19
第二節 實驗架構 ... 20
第三章 材料與方法 ... 21
第一節 儀器與設備 ... 21
第二節 藥品 ... 22
第三節 實驗方法 ... 23
第四章 研究結果 ... 37
第一節 桑黃子實體與固態發酵萃取物及 hispidin 對類澱粉樣蛋白 1-40 毒殺神經細胞之體外評估試驗 ... 37
第二節 桑黃子實體與固態發酵萃取物對腻部輸注類澱粉樣蛋白 1-40 之 阿茲海默症模式大鼠記憶學習能力之影響 ... 45
第五章 討論 ... 71
VI
第一節 桑黃子實體與固態發酵萃取物及 hispidin 對類澱粉樣蛋白 1-40 毒殺神經細胞之體外評估試驗 ... 71
第二節 桑黃子實體與固態發酵萃取物對腻部輸注類澱粉樣蛋白 1-40 之
阿茲海默症模式大鼠記憶學習能力之影響 ... 71 第六章 結論 ... 76 第七章 參考文獻 ... 78
VII
圖目錄
圖 1-1、類澱粉樣前驅蛋白之酶切 ... 3
圖 1-2、神經元損傷和 Aβ 沉積引發微膠細胞與星狀細胞活化及促發炎因子之產 生 ... 5
圖 1-3、Tau 蛋白藉由調節激酶及磷酸酶來穩定微管 ... 6
圖 1-4、阿茲海默症之發炎反應 ... 8
圖 1-5、桑黃之子實體型態 ... 11
圖 1-6、桑黃之菌絲體型態 ... 12
圖 2-1、本論文之研究大綱 ... 20
圖 3-1、ALZET 腻部輸注幫浦 ... 28
圖 3-2、腻部輸注 Aβ40 之手術流程 (林 2012) ... 29
圖 3-3、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試驗 日程表 ... 31
圖 3-4、水迷宮裝置與分區域示意圖 ... 33
圖 4-1、不同濃度之 Aβ40 對於 PC12 細胞存活率之影響 ... 38
圖 4-2、不同濃度之桑黃子實體乙醇萃取物 (PLF) 對於 PC12 細胞存活率之影 響 ... 39
圖 4-3、不同濃度之桑黃固態發酵乙醇萃取物 (PLM) 對於 PC12 細胞存活率之 影響 ... 40
圖 4-4、不同濃度之 hispidin 對於 PC12 細胞存活率之影響 ... 41
圖 4-5、不同濃度之桑黃子實體乙醇萃取物對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護影 響 ... 42
圖 4-6、不同濃度之桑黃固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護 影響 ... 43
VIII
圖 4-7、不同濃度之 hispidin 對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護影響... 44 圖 4-8、以不同試驗物質及 Aβ40 共處理 PC12 細胞之脂質過氧化程度 ... 46 圖 4-9、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠於參考記憶試
驗中搜尋平台之時間 ... 47 圖 4-10、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠於空間性探
測實驗中學習與記憶能力 (A) 游泳路徑圖 (B) 目標象限中所花時間 ... 50 圖 4-11、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠於工作記憶
試驗中學習與記憶能力之影響 ... 51 圖 4-12、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠大腻皮質中 Mg2+ 濃度之影響 ... 52 圖 4-13、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠海馬
迴中 BACE 及 RAGE 蛋白表現量之影響 ... 54 圖 4-14、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠大腻
皮質中 BACE 及 RAGE 蛋白表現量之影響 ... 55 圖 4-15、桑黃子實體與固態發酵物之乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠海馬迴
組織中 Aβ40 蛋白沉積量之影響 ... 56 圖 4-16、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠海馬迴組織
中 sAPPα 蛋白表現量之影響 ... 57
圖4-17、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠海馬迴之脂
質過氧化影響 ... 59
圖4-18、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠大腻皮質之
脂質過氧化影響 ... 60 圖4-19、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠大腻皮質之
CAT 活性影響 ... 61 圖4-20、桑黃子實體和固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注 Aβ40 大鼠大腻皮質之
IX
SOD 活性影響 ... 62 圖 4-21、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠海馬
迴中 IL-1β 及 IL-6 蛋白表現量之影響 ... 64 圖 4-22、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠皮質
中 IL-1β 及 IL-6 蛋白表現量之影響 ... 65 圖 5-1、PLF 及 PLM 對 Aβ40 誘發神經元損傷之可能調控機制 ... 75
X
表目錄
表 3-1、桑黃子實體 (PLF) 與固態發酵 (PLM) 乙醇萃取物改善 Aβ40 腻部輸 注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試驗之動物分組 ... 27 表 4-1、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠參考記
憶試驗之曲線下面積 ... 48 表 4-2、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠之血清
肝功能指標 AST、ALT 與 ALP 含量之影響 ... 67
表4-3、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠之血清
肝功能指標 Albumin 與 Globulin 含量之影響 ... 68
表4-4、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 誘發阿茲海默症大鼠之血清
腎功能指標 BUN 與 Creatinine 含量之影響 ... 69 表 6-1、PLF 與 PLM 於體外及體內試驗中各項指標比較………77
XI
前言
阿茲海默症 (Alzheimer’s Disease，AD) 是常見的腻神經退化性疾病，發病 的過程會逐漸損害記憶和學習，進而影響日常活動和與他人溝通的能力
(Hashimoto et al.，2005)。AD 的成因為頗為複雜，包括基因突變、環境因素與 個人習性都可能影響該病的發生及進展；而類澱粉樣蛋白 (amyloid β-peptide，Aβ) 假說則是目前最為學界所接受的理論 (Glenner et al.，1984) 。AD 的神經病理學 特徵是 Aβ 和海馬迴內神經原纖維纏結形成老年斑塊後沉積於大腻皮質 (Braak and Braak，1991)。而沉積斑塊周圍具有扭曲變形的神經元及活化的星狀細胞 (Astrocyte) 及神經膠細胞 (Microglia) (McGleenon et al.，1999)。
桑黃（Phellinus linteus，PL）在「本草綱目」即有記載，性寒，味微苦，
能利五臟，宣腸氣，排毒氣，壓丹石，人熱發，止血等，日本民間使用有止血、
治腹痛、利尿、健胃、止瀉等功能。目前也有許多研究證實 PL 具有抗氧化、抗 發炎、抗血小板凝集、抗糖尿病和抗病毒等功效 (Lee and Yun，2011)。PL 中含 有多種具抗氧化及抗發炎能力之功效成分，其中 hispidin 於過去研究證實具有 抑制 β-secretase (BACE) 活性之能力 (Park et al.，2004)。
前人研究指出 PL 具有抗氧化及抗發炎之能力。本實驗將以體外及體內實驗，
探討桑黃之子實體 (fruit body of Phellinus linteus，PLF) 與固態發酵菌絲體 (mycelium of Phellinus linteus，PLM) 之乙醇萃取物可否降低由 Aβ40 所誘導之 相關氧化發炎反應，以達到改善 AD 之效果。
1
第一章 文獻回顧
第一節 阿茲海默症之相關研究
失智症是一種臨床綜合症狀，其症狀特徵在於會造成患者記憶困難、語言障 礙、心理和精神變化，以及日常生活活動障礙。其中阿茲海默症 (Alzheimer’s Disease, AD) 是一個會隨年齡增加發病率並影響了約 6％ 的 65 歲以上人口的 疾病 (Ferri et al., 2005)。AD 的成因頗為複雜，包括基因突變、環境因素與個人 習性等等都可能影響其發生及進展；而類澱粉樣蛋白 (amyloid β-peptide, Aβ) 假 說則是目前最為學界所接受的理論 (Glenner and Wong, 1984)。AD 的神經病理學 特徵是 Aβ 和海馬迴內神經原纖維纏結形成老年斑塊後沉積於大腻皮質 (Braak and Braak, 1991)。而沉積斑塊周圍具有扭曲變形的神經元及活化的星狀細胞 (Astrocyte) 及神經膠細胞 (Microglia) (McGleenon et al., 1999)。
(一) 阿茲海默症之介紹與分類
AD 是由德國精神病學家和神經病理學家 Alois Alzheimer 所發現。他 發現一位 51 歲的女性患者具有記憶與語言障礙、定向障礙、心智混亂退化 (幻覺、妄想、偏執狂)，與喪失自我照顧能力。後將其大腻解剖進行神經纖 維染色，發現負責記憶與推理的大腻皮質神經細胞有不正常的雜亂現象，產 生老年斑和神經纖維纏結，日後此種類型的失智症稱為 AD (Pohanka, 2014)。
AD 依照其發病時間可分為兩類。65 歲前發病之 AD 稱為早發性阿茲 海默症 (early-onset Alzheimer's disease, EOAD)，約佔總患者的 5-10%。
EOAD 中 約 有 13% 屬 於 家 族遺 傳 型 阿 茲 海 默 症 (familial Alzheimer's disease, FAD) (Campion et al., 1999)。FAD 為一種體染色體顯性遺傳疾病，
其致病原因已知至少與三個基因的突變相關，位於第 14 對染色體的早老素 1 (presenilin 1, PSEN1) (Rogaev et al., 1997; Del-Favero et al., 1999)、位於第 1
2
對染色體的早老素 2 (presenilin 2, PSEN2) (Levy-Lahad et al., 1995; Rogaev et al., 1995) 與位於第 21 對染色體類澱粉樣前驅蛋白 (amyloid precursor protein, APP) (Citron et al., 1992; Ertekin-Taner, 2007)。而 65 歲之後發病之 AD 稱為晚發型阿茲海默症 (late-onset Alzheimer's disease, LOAD)，為 AD 之最主要類型 (Glenner and Wong, 1984)。
(二) 阿茲海默症之症狀
AD 是一種慢性進行的神經退化性疾病，其有三個主要的特徵病徵期。
前期為認知功能障礙，包括記憶喪失、語言困難和執行功能障礙，即失去智 力協調技能；中期包括精神性症狀和行為障礙，例如抑鬱，幻覺，妄想，激 動；後期則完全喪失其認之記憶，且會伴隨著日常生活活動的障礙，例如喪 失行走與進食能力，導致患者無法自己獨立生活 (Snowdon et al., 1997)。
(三) 阿茲海默症之危險因子
1. 類澱粉樣前驅蛋白質 (amyloid precursor protein, APP)
APP 是一種細胞膜醣蛋白，可藉由易位剪切形成多種 isoform (Matsui et al., 2007)。當 APP 在細胞表面時會被水解，其水解可分為 2 種 路 徑 ：non-amyloidogenic 與 amyloidogenic 路徑 ( 圖 1-1) 。在 non-amyloidogenic 路 徑 中 ， APP 會 經 由 α-secretase 剪 切 後 產 生 secreted amyloid precursor α (sAPPα) 及含 C 端 83 個胺基酸之 peptide (C83)，C83 再經由 γ-secretase 剪切成 p3 與 APP intracellular domain (AICD) 兩部分。有研究指出 sAPPα 具有神經保護、幫助神 經突觸形成、細胞黏附及訊息傳遞有關 (Mattson et al., 1993; Mattson, 1997; Gakhar-Koppole et al., 2008)。在 amyloidogenic 路徑中 APP 會 經由 β-secretase 剪切後產生 secreted amyloid precursor β (sAPPβ) 及 含 C 端 99 個胺基酸之 peptide (C99)，C99 再經由 γ-secretase 在胺 基酸的第 +40 或 +42 位置剪切形成 Aβ 與 ACID，Aβ 大部分為
3
圖 1-1、類澱粉樣前驅蛋白之酶切
Fig.1-1 The processing of APP through the beta-site AβPP-cleaving enzyme BACE1, followed by presenilin-1 (PS1). Sequential beta and gamma-secretase cleavage of APP generates the synaptotoxic amyloid-β (Aβ) peptide species, Aβ1-40 and Aβ1-42. (Mokhtar et al., 2013)
4
Aβ40，少數為 Aβ42，而經由 β- 和 γ-secretase 剪切所產生之 Aβ 經 聚合後具有毒性 (Esler and Wolfe, 2001; Mokhtar et al., 2013)。
2. 類澱粉樣蛋白質 (amyloid β-peptide, Aβ)
Aβ 是 APP 在 amyloidogenic 路徑中經由 β- 及 γ-secretase 剪 切後所產生約 39~43 個胺基酸之 peptide，其中 90％ 為 Aβ40，10
％ 為 Aβ42，Aβ42 相較於 Aβ40 具有更高的毒性 (Mokhtar et al., 2013)。一般人體會產生少量可自行分解的 Aβ，但當人體具有遺傳缺 陷、老化、腻細胞受損或局部發炎的情形時，Aβ 會大量生成並在腻 部聚合形成無法分解之沉積斑塊，進一步使微膠細胞與星狀細胞活化，
使得促發炎因子與氧化壓力產生並加劇發炎反應，導致神經纖維纏結 使神經細胞死亡 (如圖 1-2) (Citron, 2004; Meraz-Rios et al., 2013)。
3. 載脂蛋白 E4 (apolipoprotein E4, ApoE4)
1993 年 Strittmatter 等人研究發現 ApoE4 基因與 LOAD 有密 切關係，ApoE4 對於 Aβ 有高度的親合力，會加速 Aβ 的沉積 (Strittmatter et al., 1993; Evans et al., 1995)，且 ApoE4 與磷酸化作用亦 有關聯，會促使 tau 蛋白過度磷酸化 (Holtzman et al., 2000)。
4. Tau 蛋白
神經元間的物質傳輸是依賴微管 (microtube) 做運輸，特別是軸 突的部分。Tau 蛋白在被正常磷酸化的情形下具有穩定微管的功能，
但當其被異常磷酸化時會形成雙股螺旋纖維，與 Aβ 及 ApoE4 組成 神經纏結，同時會降低微管組裝能力，使得神經元無法順利傳遞物質，
最終導致神經元細胞死亡 (如圖 1-3) (Holtzman et al., 2000)。
5. 氧化壓力
Aβ 在 AD 患者腻中會抑制粒線體中的細胞色素 c (cytochrome
5
圖 1-2、神經元損傷和 Aβ 沉積引發微膠細胞與星狀細胞活化及促發炎因子之 產生
Fig. 1-2 Neuronal damage and Aβ deposition triggers microglial and astrocytes activation and the generation of inflammation molecular mediators (Meraz-Rios et al., 2013).
6
圖 1-3、Tau 蛋白藉由調節激酶及磷酸酶來穩定微管
Fig. 1-3 Stabilisation of microtubules by the tau protein is regulated by kinases and phosphatases.
7
c) 氧化酶，造成粒線體功能損傷，造成氧化壓力上升及增加細胞凋亡。
又 Aβ 片段上的 methionine 35 (Met-35) 為產生氧化壓力之主要胺基 酸，其上的硫分子被氧化成自由基後會攻擊神經細胞，引發細胞膜上
脂質與蛋白質氧化，直接造成細胞之氧化傷害。且其可與 Fe2+ 等金
屬離子結合形成複合物，此類複合物在有氧環境中會行氧化還原反應，
產生大量 ROS，造成氧化傷害 (Clementi et al., 2005; Querfurth and LaFerla, 2010)。
6. 發炎反應
Aβ 生成後在腻部聚合沉積，會促使微膠細胞與星狀細胞活化，
使得促發炎因子如 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 與 ROS 產生導致發炎反 應，tau 蛋白異常磷酸化所形成之神經纏結亦會引起發炎反應，進而 造成神經細胞損傷 (如圖 1-4) (Meraz-Rios et al., 2013)。
(四) 阿茲海默症之治療
現今 AD 的主要治療用藥有二種，分別是 AChE 抑制劑及 NMDA 受體拮抗劑。
1. AChE 抑制劑
在 Aβ 的假說提出之前，膽鹼假說 (cholinergic hypothesis) 是主 要被認為造成 AD 的原因。其闡述 AD 病人之認知功能障礙是由於 神經傳遞物質乙醯膽鹼 (acetylcholine, ACh) 產量不足所導致的，也是 現今大部分 AD 藥物所依據之基礎 (Francis et al., 1999)。ACh 在突 觸前細胞內合成後釋放到突觸間隙，其中一部分的 ACh 會與突觸後 細胞上的乙醯膽鹼受體結合，另一部分則會被 AChE 分解成醋酸鹽 (acetate) 及膽鹼。AChE 抑制劑即是透過抑制 AChE 的分解作用來增 加 ACh 之含量，可延緩 AD 之病程 (McGleenon et al., 1999)。現行 的藥物主要為 donepezil、galantamine 與 rivastigmine，用於治療前期
8
圖 1-4、阿茲海默症之發炎反應
Fig. 1-4 Inflammation in Alzheimer’s disease (Meraz-Rios et al., 2013).
9
至中期之 AD 患者。
2. NMDA 受體拮抗劑
除了 ACh 之外，glutamate 也是重要的神經傳遞物質之一，其主 要 作 用 於 NMDA 受 體 。 當 訊 息 傳 遞 發 生 時 ， 突 觸 前 細 胞 釋 放 glutamate，其會與 glycine 結合到突觸後細胞之 NMDA 受體，同時 細胞膜電位會發生改變使 Mg2+ 釋放，進而使離子通道開啟，Ca2+ 藉
由離子通道進入突觸後細胞以活化後續之訊息傳遞。Aβ 會使 NMDA
受體離子通道持續開啟，引起氧化壓力而造成神經細胞損傷。NMDA
受體拮抗抑制劑能阻斷離子通道，使 Ca2+ 無法進入突觸後細胞，進
而降低氧化壓力所造成之神經細胞死亡 (Li and Tsien, 2009; Danysz and Parsons, 2012)。
(五) 治療阿茲海默症之困境
現今 AD 治療藥物以增加神經傳遞物質與減少神經興奮毒性為 主，而這只能緩解症狀但無法根治 (McGleenon et al., 1999)。Aβ 假說 目前被視為是形成 AD 之主因，因此抑制 Aβ 生成、阻斷 Aβ 聚合 沉積、促進 Aβ 移除及降解與減少 Aβ 造成氧化發炎現象等欲根治 AD 之治療方向是需要進一步探討的 (Walker et al., 2005)。
第二節 桑黃之簡介
桑黃 (Phellinus linteus, PL) 在明代李時珍的「本草綱目」即有記載，性寒，
味微苦，能利五臟，宣腸氣，排毒氣，壓丹石，人熱發，止血等，在中國有長 久的使用歷史。日本民間使用上則有止血、治腹痛、利尿、健胃、止瀉等功能，
據日本調查報導，長崎縣的居民大多長壽，除了環境外，其飲食種類是很重要 的因素，其中桑黃便是家庭常用的藥方。第二次世界大戰後，日本廣島的大部 分地區受到核彈輻射影響，造成附近居民陸續出現一些慢性病及癌症患者並引
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起極大的恐慌，當時日本政府強制疏散居住在廣島地區的民眾至各島嶼區域，
並將已罹病或有罹病跡象之居民進行治療、觀察與追蹤。其中移居至女島、八 丈島，及由卡坦半島此三座島嶼的病患陸續傳出初期癌症康復或症狀改善之現 象，後經過日本醫學家的探討，發現居民經常摘取當地野生桑樹上生長之桑黃 做為一般食用，更進一步研究發現，其中含有相當多的活性成分，並具有抗腫 瘤之功效 (Sasaki et al., 1971)。
(一) 桑黃之分類
桑黃又名桑臣、桑耳、胡孫眼及女島瘤蕈等，因其生長於桑樹上，並 呈現硫黃色而有此名。學名為 Phellinus linteus，為真菌界 (Fungi)，擔子 菌 門 (Basidiomycotas) ， 層 菌 綱 (Hymenomycetes) ， 無 褶 菌 目 (Aphyllophorales) ， 銹 革 孔 菌 科 (Hymenochaetaceae) ， 木 層 孔 菌 屬 (Phellinus)，桑黃種 (Phellinus linteus)。子實體為多年生，無柄，側生，硬 木質，菌傘為扁半球形、馬蹄形、貝殼狀或規則形，常見色澤為黃褐色、
咖啡色或黑褐色，長徑 3~20 公分，短徑 2~15 公分，厚 2~12 公分，有 同心環稜，子實層顏色鮮黃，有大量錐形刷毛，孢子近球形，菌絲不分支 無橫隔，如圖 1-5 及 1-6 所示 (Chen et al., 2016)。
(二) 桑黃之培養
早年之桑黃子實體皆採集自桑樹，因桑黃具有抗腫瘤功效之研究陸續 被發表，且民眾之保健意識逐年提升，導致其用量日益增加，使得野生資 源越來越少，因此各國皆積極進行桑黃之人工栽培技術研究。目前桑黃之 培養方法可分為短段木栽培法及袋栽法 (Chen et al., 2016; Han et al., 2016)。
1. 短段木栽培法
主要使用國家為韓國、日本及中國大陸。將桑黃以大麥做為固態 發酵基質，在 28℃ 培養 30~40 天後做為栽培用菌種，接種在桑樹
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圖 1-5、桑黃之子實體型態
Fig. 1-5 The plant and medicinal materials (fungus parasitizing on the trees (a) the fruiting body (b) and decoction pieces (c)) of PL (Chen et al., 2016).
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圖 1-6、桑黃之菌絲體型態
Fig. 1-6 Phellinus linteus (holotype). A, Contextual skeletal hyphae; B, Contextual generative hyphae; C, Tramal skeletal hyphae; D, Tramal generative hyphae; E, Hymenial setae; F, Basidia; G, Basidiospores (Han et al., 2016).
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或楊樹之段木內，控制溫度、濕度與光照等生長環境，經 3~6 個月 可培養出桑黃子實體 (吳等 2012)。
2. 袋栽法
主要採用國家為中國大陸。將木屑、麩皮、玉米粉、糖、磷肥與 石膏以固定比例混合，調整其含水量後裝袋，做為培養基質，接菌後 控制溫度、濕度與光照等生長環境，每天通風 30 分鐘，每周將菌袋 上下翻動乙次，待菌絲長滿後用刀片進行開口，以便出菇，從開口至 出菇並採收需要約 50 天 (吳等 2012)。
(三) 桑黃之保健功效
許多文獻指出，桑黃除了具有抗腫瘤活性外，尚有調節免疫功能、改 善糖尿病、保護肝臟、抗氧化發炎能力及神經相關活性等保健功效。分述 如下：
1. 調節免疫功能
在許多研究中，桑黃已被證明是一種有效的免疫調節劑。在 1996
年，Kim 等人從桑黃之菌絲體培養物中純化多醣，並藉由體外及體內
實驗觀察其免疫調節功能，結果發現桑黃多醣能提高由自然殺手細胞 及巨噬細胞所介導之非特異免疫功能 (Kim et al., 1996)；桑黃子實體 萃取物與胞外多醣亦能增加小鼠體內 TH1 中 INF-γ 與限制 TH2 中 IL-4 及 IL-10 的表現，阻礙 B 細胞中的 IgE 產生，進而抑制免疫反 應，幫助恢復自體免疫系統的平衡 (Kim et al., 2004; Inagaki et al., 2005; Lim et al., 2005; Oh et al., 2006; Hwang et al., 2012)。
2. 抗腫瘤活性
抗腫瘤為桑黃最早發現之藥理活性，透過大量藥理研究，桑黃已 被證實為有效的抗癌藥物，其不只可殺死癌細胞 (Mei et al., 2015)，更 可預防癌症，目前已知具有抗肝癌 (Huang et al., 2011; Wang et al.,
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2012; Li et al., 2013)、抗黑色素瘤 (Han et al., 1999; Lee et al., 2005;
Han et al., 2006; Park et al., 2010)、抗結腸直腸癌 (Li et al., 2004; Li et al., 2011; Song et al., 2011; Zhong et al., 2013)、抗惡性肉瘤及白血病 (Kim et al., 2004; Lee et al., 2006b; van Griensven and Verhoeven, 2013;
Huang et al., 2016b)、抗肺癌 (Lee et al., 2006a; Lee et al., 2009)、抗乳 癌 (Sliva et al., 2008; Lee et al., 2015) 等功效。
3. 改善糖尿病
糖尿病可分為第一型糖尿病、第二型糖尿病與妊娠糖尿病等等類 型；第一型糖尿病是由於人體胰臟中負責合成胰島素之 β 細胞受到 自體免疫攻擊而被破壞，導致患者無法自行合成胰島素，桑黃中的多 醣會透過降低 TH1 的發炎因子 (如 IFN-γ、IL-2 與 TNF-α) 之表現 量與增加 TH2 的 IL-4 之表現量來抑制自體免疫反應 (Kim et al., 2010; Zhao et al., 2014)；而第二型糖尿病為最常見之糖尿病類型，其 誘因相當多，患者雖能自行合成胰島素，但其量不足以降低血糖或是 其細胞受器無法正常運作導致細胞無法利用血液中之葡萄糖，桑黃多 醣能經由調節 PPAR-γ 所介導之脂質代謝來提高細胞受器對胰島素 之敏感性 (Choi et al., 2004; Yamac et al., 2016)
4. 保護肝臟
在體外實驗中，桑黃多醣對細胞色素 P450 (cytochrome P450，
CYP) 1A1、CYP1A2、CYP2B1 及 CYP2E1 的活性具有抑制作用 (Shon and Nam, 2003)；桑黃萃取物能藉由減少過氧化物的產生及增加 CAT 及 SOD 的活性來達到改善由硫代乙醯胺或是四氯化碳誘發之 大鼠肝纖維化 (Jeon et al., 2003; Wang et al., 2012)；自桑黃菌絲體萃取 物分離出來之 phellinulin A 能抑制大鼠肝星狀細胞之活化，顯著抑制 其肝纖維化 (Huang et al., 2016a)。
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5. 抗氧化能力
桑黃菌絲體水萃物具有清除 DPPH 自由基、抑制脂質過氧化、
提高細胞中的 SOD、CAT 與 GSH 的活性及螯合鐵離子能力，桑黃 子實體乙醇萃取物亦具有清除 DPPH 自由基及抑制脂質過氧化之能 力 (Song et al., 2003; Lee et al., 2006b; Lung et al., 2010)。
6. 抗發炎能力
桑黃乙醇萃取物能透過 PKCδ/Nrf2/ARE 路徑，提高 RAW 264.7 細胞中 HO-1 的表現量，亦能藉由 NF-κB/MAPK 路徑，降低 iNOS 及 COX-2 的表現量，來減少由 LPS 所誘導之 NO、ROS 及 PGE2 的 產生，並抑制 p38、ERK 及 JNK 的磷酸化來達到抑制發炎反應，且 其具有劑量效應 (Kim et al., 2006; Kim et al., 2007a; Kim et al., 2007b)；
在利用葡聚醣硫酸鈉誘發結腸炎的小鼠模式中，以發芽糙米做為發酵 基質之桑黃萃取物能降低 NF-κB、ERK 及 p38 的表現量，進而降低 iNOS 及 COX-2 的表現量 (Song and Park, 2014)。
7. 神經調節相關活性
Kim 等人研究發現，桑黃中的功效成分 hispidin 可抑制 BACE-1 的活性 (Park et al., 2004b)；又前人研究指出桑黃甲醇萃取物具有促進 神經細胞的增生與維持及抑制 BACE-1 之表現 (黃等 2016)，桑黃子 實體之乙酸乙酯萃取物能藉由提高 HO-1、CAT、GPx-1、SOD-1 及 SOD-2 的表現量與降低細胞內 ROS 的產生來達到抑制由 H2O2 對 神經細胞 SK-N-MC 之毒性 (Choi et al., 2016)，顯示其對治療阿茲海 默症之潛力。
(四) 桑黃之功效成分
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桑黃中含有多種活性成分，包含多醣類、醣蛋白、黃酮類化合物、萜 類化合物、固醇類化合物及多酚類化合物如 hispidin、hispolon 及 inotilone 等 (Chen et al., 2016)。
1. 多醣類
真菌多醣主要可分為結構性多醣及活性多醣二種。結構性多醣為 組成真菌細胞壁之主要結構，活性多醣則為真菌菌絲所產生之二次代 謝物，亦為真菌多醣中主要具有免疫生理活性之多醣，其中主要活性 成分為 β-D-葡聚醣。β-D-葡聚醣能藉由刺激巨噬細胞、T 細胞、B 細 胞與自然殺手細胞來達到調節免疫及抗腫瘤之功效，目前已知桑黃多 醣具有調節免疫、抗腫瘤、改善糖尿病、抗氧化及抗發炎等功效 (Chen et al., 2016)。
2. Hispidin
Hispidin 與 inotilone 及 hispolon 同屬於桑黃中的多酚類活性成 分，具有極強的抗氧化能力 (Park et al., 2004a)，為 PKC 的抑制劑，
可阻斷 MAPK 訊息傳遞路徑 (Gonindard et al., 1997; Lee et al., 2010)。
目前已知 hispidin 可藉由其抗氧化能力來抑制過氧化氫毒殺胰 臟 β 細胞 (Jang et al., 2010; Lee et al., 2011)、利用引起腫瘤細胞之自 噬作用與降低由腫瘤細胞引發之發炎反應來達到抗腫瘤之功效 (Ali et al., 1996; Gonindard et al., 1997; Lim et al., 2014)，及其具有抑制 BACE 活性之能力 (Park et al., 2004b)。
3. Hispolon
Hispolon 為一種自桑黃中分離出的多酚類活性物質，其結構與目 前已知的強抗氧化物白藜蘆醇類似，具有抗氧化及抗發炎之能力。
Hispolon 最早之藥理研究為其抗腫瘤能力，其可藉由 ERK1/2 及
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JNK1/2 相關路徑引起腫瘤細胞之自噬作用，並阻止血管新生，防止 腫瘤細胞擴散，且可降低因腫瘤細胞引起之發炎反應，來達到抗腫瘤 之功效 (Chen et al., 2006; Chen et al., 2008; Lu et al., 2009; Chang et al., 2011; Hsiao et al., 2013; Yang et al., 2014; Zhao et al., 2016)；且林在 2010 研究指出，hispolon 可藉由增加微膠細胞 BV-2 中 HO-1 之蛋 白表現量來抑制由 LPS 所誘導之 NO 產生，進而達到神經保護之功 效 (林 2010)。
4. Inotilone
最初被發現於同屬於銹革孔菌科之纖孔菌屬真菌中 (Wangun et al., 2006)，後亦在桑黃中被發現 (Huang et al., 2012)。已知 inotilone 可 藉 由 降 低 iNOS 的 表 現 量 、 抑 制 NF-κB 與 MMP-9 的 活 化 及 COX-2 的活性與阻斷 MAPK 的訊息傳遞路徑來降低發炎因子 NO 及 PGE2 的產生，達到抗發炎作用 (Kuo et al., 2009; Huang et al., 2012;
Kuo et al., 2012)。
第三節 桑黃保健功效及功效成分與神經相關疾病之關聯
(一) 桑黃之抗氧化發炎能力與神經相關疾病之關聯性Choi 等人將桑黃子實體水萃物利用乙醇沉澱及乙酸乙酯萃取製備出 桑黃子實體乙酸乙酯萃取物 (PLEA)，並利用其預處理添加 H2O2 之人類 神經母細胞 SK-N-MC，其可降低 H2O2 之細胞毒性，並可藉由提升 HO-1、
CAT、GPx-1、SOD-1 及 SOD-2 的表現量來減少細胞內 ROS 之含量，
達到神經保護作用 (Choi et al., 2016)。2010 年林研究指出，桑黃中的功效 成分 hispolon 可藉由提升 HO-1 之表現量來達到抑制在微膠細胞 BV-2 中由 LPS 所誘發之發炎反應 (林 2010)。
Aβ 在腻部之聚合沉積會造成嚴重之氧化壓力及發炎反應 (Clementi
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et al., 2005; Querfurth and LaFerla, 2010; Meraz-Rios et al., 2013)，又前人研 究指出桑黃萃取物具有良好抗氧化發炎能力 (Song et al., 2003; Kim et al., 2006; Lee et al., 2006b; Kim et al., 2007a; Kim et al., 2007b; Yan et al., 2016)，
因此桑黃對預防或改善由氧化發炎引起之神經相關疾病應有極大潛力。
(二) Hispidin 與阿茲海默症之關聯性
Park 等人在 2004 年將自桑黃中分離出之功效化合物 hispidin 與將 APP 剪切成 Aβ 之關鍵酵素 BACE1 共處理後觀察其酵素活性變化，發 現處理 4 μM 之 hispidin 即可抑制 50% 之酵素活性，顯示其可能具有抑 制Aβ 生成之能力 (Park et al., 2004b)。
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第二章 實驗動機與實驗架構
第一節 實驗動機與目的
AD 為常見的腻神經退化性疾病，其主要成因為腻部神經細胞膜上之 APP 經 BACE 剪切後形成 Aβ 並聚集沉積在腻部，引發氧化及發炎反應後，逐漸 損害記憶和學習能力，進而影響日常活動和與他人溝通的能力(Glenner and Wong, 1984)。目前的治療藥物大多針對神經傳導並未能根治該疾病的藥物 (McGleenon et al., 1999)。本草綱目記載：「桑黃性寒，味微苦，能利五臟，宣
腸氣，排毒氣，壓丹石，人熱發，止血等。」，日本民間認為其有止血、治腹痛、
利尿、健胃和止瀉等功能 (Sasaki et al., 1971)。前人研究指出，桑黃本身具有調 節免疫功能、抗腫瘤活性、改善糖尿病、保護肝臟、抗氧化能力、抗發炎能力 及神經調節相關活性 (Seo et al., 2011; Chen et al., 2016; Huang et al., 2016a)，且 含有多醣、黃酮類、萜類、固醇類及多酚類化合物等功效成分 (Chen et al., 2016)，
而其中又以多酚類化合物 hispidin 在過去研究中被證實具有抑制 BACE 活性 之能力而受到矚目 (Park et al., 2004b)。
本實驗第一部分為細胞模式，評估桑黃子實體、固態發酵乙醇萃取物及 hispidin 與 Aβ40 共處理後對於 PC12 神經纖維母細胞之影響，另評估桑黃乙 醇萃取物及 hispidin 是否能改善由 Aβ40 引起之氧化發炎反應。第二部分以微 型幫浦固定在 SD 大鼠腻部，連續 28 天輸注 Aβ40 誘導阿茲海默症，並餵 食桑黃子實體或固態發酵乙醇萃取物，評估桑黃乙醇萃取物是否能改善由 Aβ40 引起之阿茲海默症。
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第二節 實驗架構
圖 2-1、本論文之研究大綱 Fig. 2-1 The outline of the study
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第三章 材料與方法
第一節 儀器與設備
(一) 細胞實驗相關設備1. 純水製造機 (Ultrapure water system) RO-1070, PA-E Machinery Industrial CO., Taichung, Taiwan
2. 滅菌釜 (Autoclave) Model ss-320, Tomy Co., Tokyo, Japan
3. 離心機 (Centrifuge) Sorvall Legend Micro 17R, Thermo Fisher Scientific Inc., Germany
4. 無菌操作台 Kansin Co., Taipei, Taiwan 5. 倒立式顯微鏡 BI-500, Motican Co., USA
6. 酵素免疫分析儀 (Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA, SUNRISE, Tecan Trading AG, Switzerland)
7. 恆溫水浴槽 (Water bath) FirstTek scientific, Taipei, Taiwan 8. 酸鹼測定器 (pH meter) MP220, Mettler Toledo, UK
9. 二氧化碳之濕式培養箱：(Decontamination CO2 Incubator, Model RCO3000TABB, Revco Techologiey, USA)
(二) 動物實驗相關設備
1. 動物腻部立體定位儀 (stereotaxic instrument) (Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)
2. 氣體麻醉機 (anesthetic vaporizer) (Matrix VIP 3000 Veterinary Vaporizer, Midmark Corp., Versailles, OH, USA)
3. 微 小 滲 透 壓 幫 浦 (mini-osmotic pump) (Model 2004, ALZET®, Cupertino, CA, USA)
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4. 腻部輸注套組 (brain infusion kit 2, 3-5 mm, ALZET®, Cupertino, CA, USA)
5. 自動縫合器 (autoclip applier) (ST-C200 14 mm, Karl Klappenecker GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany)
第二節 藥品
(一) 一般試藥1. 95% 酒精購自台灣菸酒公司
2. Aβ 1-40 購自 Tocris Bioscience Co. (Ellisville, MO, USA) 及 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)
3. Acrylamide 、 Ammonium persulfate (APS) 、 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、Deoxycholate (DOC)、Glycine、
HCl 、 Hematoxylin 、 H2SO4 、 Methyl Alcohol 、 NaOH 、 Tetramethylethylenediamine (TEMED) 、 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP)、Thiobarbituric acid (TBA)、Trichloroacetic acid (TCA)、Tween 20、
Xylene 購自 Merck Co. (Darmstadat, Germany)
4. BCA protein assay reagent 購自 Pierce Co. (Box, PO, USA) 5. Coomassie brilliant blue R250、3,3'-Diaminobenzidine (DAB)、
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 、 Dimethylsulfoxide (DMSO) 、 Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)、Hispidin、NaCl、
NaF 、 Na3VO4、Polymer of horseradish peroxidase (Poly-HRP) 、 Poly-L-lysine、Sodium dodecyl sulfate (SDS)、Trypan blue solution 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)
6. ECL Kit 顯影劑 購自 PerkinElmer Co. (Boston, MA, USA)
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7. Kodak Bio-Max film 購自 Kodak Co. (New York, NY, USA)
8. Prestained SDS-PAGE Standards, Broad Range 、 Prestained SDS-PAGE Standards, High Range、Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range、Tris 購自 Bio-RAD Co. (CA, USA)
9. PVDF membrane 購自 Amersham Biosciences Ltd. (Taiwan Branch) 10. Triton X-100 購自 Schwarz/Mann Biotech Co. (Cleveland, USA) (二) 細胞培養基
1. Fetal Bovine Serum、Horse serum、RPMI 1640 細胞培養基購自 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA）
(三) 抗體
1. Polyclonal IL-1β antibody (sc-7884) 及 Polyclonal IL-6 antibody (sc-1265) 購自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA)
2. Monoclonal BACE antibody (5606) 購 自 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)
3. Monoclonal β-actin antibody (MA5-15739) 、 Polyclonal RAGE antibody (PA3- 030A) 購自 Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA)
4. Polyclonal amyloid beta A4 antibody (AB2500) 購自 Merck KGaA.
(Millipore) (Darmstadt, Germany)
5. Monoclonal sAPP α antibody (11088) 購 自 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. (Minneapolis, MN, USA)
第三節 實驗方法
(一) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物 (PLF & PLM) 由輔英科技大學保健營養系王志傑老師提供
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(二) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物及 hispidin 對類澱粉樣蛋白 1-40 毒殺神經細胞之體外評估試驗
1. PC12 大鼠腎上腺之嗜鉻神經纖維母細胞株之培養
PC12 大鼠腎上腺之嗜鉻神經纖維母細胞購自食品工業發展研究 所生物資源保存中心 (BCRC, 60048, Hsinchu, Taiwan) 以 RPMI 1640 medium (含 5% fetal bovine serum、10% horse serum)，培養於 37℃、
5% CO2 之環境下，每星期繼代培養兩次。
2. 桑黃乙醇萃取物抑制 Aβ40 毒性之試驗 - MTT assay
MTT 是一種 tetrazolium salt，全名是 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]
2,5-diphenyl -tetrazolium bromide，為一黃色的染劑，可被活細胞吸收 並被粒線體 (mitochondria) 中的 succinate tetrazolium reductase (一種 succinate dehydrogenase) 還原成藍色的 formazan，常用來檢測細胞的 增殖。將5 × 104 個 PC12 細胞置於 96-well 中培養 24 hr 後，培養 液更換成不含血清的培養液，並加入 0.6 μM Aβ40 與不同濃度之桑黃 子實體與固態發酵乙醇萃取物及 hispidin，每個培養皿的乙醇濃度不 超過 0.5%，培養 48 hr。將培養液換成不含血清的培養液，加入 50 μL 的 MTT 溶液 (50 μg/mL)，培養 24 hr 後測定波長 595 nm 之吸光值，
吸光值越高表示存活細胞數越多，以未經過處理之細胞其吸光值作為 control。計算細胞存活率，既等於桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物 及 hispidin 對 Aβ 神經細胞毒性之抑制率，以 % 表示之。
細胞存活率之計算公式如下：
Cell viability (%) = (Sample-Blank) / (Control-Blank) ×100％。
3. 脂 蛋 白 脂 質 過 氧 化 測 定 分 析 法 (thiobarbituric acid reactive substances；TBARS)
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脂質過氧化分析法是參考 Tarladgis et al. 之方法 (Tarladgis et al.
1964)，以 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) 為標準品，先以二次蒸 餾水將 TMP 稀釋為 1 mM，再以 1 N H2SO4 溶液將其濃度分別稀釋 為 0，20，40，60，80，100 μM，各取 100 μL，分析方法與樣品相 同。將 1 × 107 個 PC12 細胞置於 10-cm dish 中預培養 24 hr，再更 換成不含血清的培養液，並加入 0.6 μM Aβ40 與不同濃度之桑黃子實 體與固態發酵乙醇萃取物及 hispidin，每個培養皿的乙醇濃度不超過 0.5%，培養 48 hr。細胞以 PBS (pH 7.4) 沖洗 3 次後，離心 (9,000 x g, 15 min) 去除上清液，加入 100 µL lysis buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris，pH 7.5；100 mM NaCl、40 mM NaF、0.2% SDS、0.5%
deoxycholate、1 mM EDTA、1 mM EGTA 及 1 mM Na3VO4) 保存於 -20℃ 保存。取樣時以 10,000 x g 離心 10 min，取其上清液進行分析。
取25 μL 的細胞 lysis 上清液加入 150 μL 的 5% trichloroacetic acid 及50 μL 60 mmol/L 的 TBA，於 95℃ 反應 30 min 後，冷卻於室溫，
再離心 (12,000 x g，15 min，4℃)，取上清液以供 MDA 濃度之分析。
利用樣品若含丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 與 thiobarbituric acid (TBA) 溶液在酸性環境下，加熱一段時間後會生成粉紅色物質，並在 波長 532 nm 下測定吸光度，以推算檢體之 「脂質過氧化」 程度。
TBA 是分析脂質過氧化作用所產生的產物，一般以 MDA 的產量表 示之 (Tarladgis et al., 1964)。
(三) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物對腻部輸注類澱粉樣蛋白 1-40 之 阿茲海默症模式大鼠記憶學習能力之影響
1. 實驗動物飼養與分組
動物分組如表 3-1 所示，餵食劑量參考自 Seo 等人於 2011 年 之研究 (Seo et al., 2011)，採用之動物為購自樂斯科股份有限公司之
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SD 品系雄性大鼠，週齡 8 週大，體重約 250 g，每組 8 隻，飼養 於具空調之空間，溫度維持在 23±1℃ 燈光控制採 12 小時亮 12 小 時暗 (08:00 燈亮、20:00 燈暗)，食物與水不予限制。大鼠育養至體 重達 300 g 時進行實驗分組與腻部輸助幫浦植入手術。
2. 阿茲海默症大鼠模式之建立
(1) 誘發大鼠記憶學習能力損傷之設備 (如圖 3-1 所示)
由微小滲透壓幫浦 (Mini-Osmotic Pump, Model 2004, Alzet Corporation, Palo Alto, CA, USA.)，輸注速率 0.25 μL/hr，內容量 234 μL，與腻部輸注套組 (brain Infusion Kit II，3-5 mm，Alzet©) 組 成。腻部輸注套組所含之軟管長約 10 cm，內容量 3.74 μL/cm，
其結構如圖 1 所示，配合動物腻部立體定位儀對大鼠腻部進行定 位，進而將藥品輸入至大鼠腻部，以誘發阿茲海默症之大鼠。
(2) 阿茲海默症模式大鼠建立之手術操作 (如圖 3-2 所示) Aβ40 使用前需先於 37℃ 無菌水中聚合 7 天，再配製成含 35% acetonitrile、0.1% trifluoroacetic acid 之溶液。配製完成的 Aβ40 溶 液 或 未 加 入 Aβ40 之 溶 液 ( 做 為 Vehicle 組 ) 注 入 mini-osmotic pump，接上 brain infusion kit II 並使溶液充滿整個 輸注管與輸注頭。將軟管結成單結狀，使 pump 與輸注頭間有一 定之延展性，避免植入後因大鼠活動造成軟管斷開。將大鼠以動 物用氣體麻醉劑 isoflurane 麻醉後，置於動物腻部立體定位儀上，
根據 Paxinos 與 Watson 之大鼠腻部立體解剖圖進行左側腻室 定位。以頭蓋骨上之 bregma 為中心，於縱軸 0.8 mm，橫軸 1.4 mm 位置進行側腻室之定位並進行鑽孔 (Paxinos and Watson, 2005)。待完成鑽孔後，將 brain infusion kit II 之輸注頭置入，輸
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表 3-1、桑黃子實體 (PLF) 與固態發酵 (PLM) 乙醇萃取物改善 Aβ40 腻部輸 注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試驗之動物分組
Table 3-1 Animal grouping for the study on the effect of the ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) and mycelium (PLM) on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ40-infused rat
Groups Brain infusion sample Samples (dosage) Hispidin concentration (μg/ml)
Vehicle vehicle solution water 0
Aβ Aβ40 water 0
PLF-L Aβ40 PLF (25 mg/kg/day) 44.52 PLF-H Aβ40 PLF (75 mg/kg/day) 133.56 PLM-L Aβ40 PLM (25 mg/kg/day) 11.54 PLM-H Aβ40 PLM (75 mg/kg/day) 34.63
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圖 3-1、ALZET 腻部輸注幫浦
Fig. 3-1 Mini-osmotic pump and brain infusion kit II (Alzet©, http://www.alzet.com/)
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圖 3-2、腻部輸注 Aβ40 之手術流程 (林 2012)
Fig. 3-2 The surgery process of intracerebroventricular infusion of Aβ40
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注頭之深度為距離頭蓋骨 4.0 mm。完成後以生物黏合膠固定接 著墊片與接頭於頭蓋骨上。並將 mini-osmotic pump 置於頸後皮 下區。最後以自動縫合器縫合，待大鼠甦醒後歸回飼養籠中照顧。
每個 mini-osmotic pump 均充填 180 μL 之 Aβ40 溶液，並以 0.25 μL/hr 之速率連續 28 天輸注於大鼠腻部，實驗結束後將釋 出 約 5.5 nmol 之 Aβ40 (24.299 μg/rat) (Flood et al., 1991;
Hashimoto et al., 2005)。實驗動物於手術後隔日開始進行試驗物質 之餵食，完整實驗日程如圖 3-3 所示。
3. 記憶學習能力試驗: Morris 水迷宮試驗 (Morris water maze test) 水迷宮試驗方法為英國的心理學家 Morris 於 1981 年發表。利用 大鼠在水池中探索目標物的方法，研究大鼠海馬迴等腻區受到損傷後的 學習、記憶和空間定向以及認知能力。藉由觀察與記錄動物入水後搜索 隱藏於水下之平臺所需的時間與游泳軌跡，進而分析和推斷動物的學習、
記憶和空間認知等方面的能力 (Morris, 1981)。本研究之水迷宮試驗分 為參考記憶試驗 (reference memory task) 、空間性探測試驗 (probe test) 與工作記憶試驗 (working memory task) (Wang et al., 2012)。
(1) 水迷宮實驗裝置
手術後第 24 天開始進行水迷宮記憶學習能力試驗，依次為 參考記憶試驗、空間性探測試驗與工作記憶試驗。水迷宮裝置如 圖 3-4 所示，圓形泳池之直徑為 140 cm，深度為 45 cm，泳池 中含有一可移動的休息平臺 (或稱逃逸平臺，escape platform)。
平臺之直徑為 10 cm，高度為 25 cm。實驗進行前泳池頇加水至 27 cm 之液面高度，並於水中加入數滴墨汁，避免大鼠看見平台。
泳池區分為四個象限 ( I、II、III 與 IV 象限)，並設置 5 個起始 點，休息平臺放置於任一象限之中心點。試驗期間並於泳池中心
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圖 3-3、桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試 驗日程表
Fig. 3-3 The experiment schedule of learning and memory task of ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) and mycelium (PLM) for Alzheimer's disease rats
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點正上方架設攝影機，並使用動物軌跡追蹤系統，以記錄實驗動 物尋找休息平台之時間及游泳路徑 (Yamaguchi et al., 2006)。
(2) 參考記憶試驗 (reference memory task)
參考記憶試驗於手術後第 24 至 26 天進行。休息平臺固定 置於第 IV 象限中，將大鼠頭向外隨機進入四個起始點，每天訓 練 4 次，每次 90 sec，共進行 12 次；若大鼠於 90 sec 內即找 到休息平臺，讓大鼠於平台上休息 30 sec 後，回籠子休息 30 sec，
然後進行下一次測試；但若大鼠於 90 sec 內未找到休息平臺，
則將大鼠引導至休息平臺，同樣給予 30 sec 之休息時間後，回 籠子休息 30 sec，再進行下一次訓練。若大鼠於休息期間離開平 台，則將大鼠引導回平台後重新計時，確保每隻大鼠有相同記憶 平台位置時間。又因折線圖無法明顯看出長期記憶之差異，參考 測定血糖值之 OGTT，以搜尋平台時間折線圖之曲線下面積進行 量化，計算公式如下：% of AUC = 各組搜尋平台時間折線圖曲 線下面積之積分值/Vehicle 組搜尋平台時間折線圖曲線下面積之 積分值 × 100%
(3) 空間性探測實驗 (probe test)
空間性探測實驗於手術後第 26 天之參考記憶試驗後立即進 行。將休息平臺移出泳池，將大鼠頭向外由起始點 1 進入泳池，
游泳 90 sec，紀錄大鼠於第 IV 象限 (參考記憶試驗中休息平臺 放置之象限) 中所停留之時間與全程游泳之路徑，此實驗進行 1 次。
(4) 工作記憶試驗 (working memory task)
工作記憶試驗於手術後第 27 天進行。休息平臺改放置於第
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圖 3-4、水迷宮裝置與分區域示意圖 Fig. 3-4 Instrument of water maze task
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III 象限，訓練 5 次。將大鼠頭向外隨機由 5 個起始點進入泳池，
每次 90 sec；若大鼠於 90 sec 內找到休息平臺，讓大鼠於平台 上休息 15 sec 後，移回籠中休息 60 sec，然後進行下一次之訓 練；但若大鼠於 90 sec 內未找到休息平臺，則將大鼠引導到休 息平臺，同樣休息 15 sec 後，移回籠中休息 60 sec，再進行下 一次之訓練。試驗結束後將試驗結果進行平均並統計組間之差異，
除第 1 次訓練為認知訓練，不列入計算。
4. 生理與生化分析 (1) 腻組織之處理
實驗完成後犧牲老鼠，並取出腻部組織，按 Groswisky 方法 (Yamaguchi et al., 2006) 分成 cortex、hippocampus 區域。分別加 入 lysis buffer 均質。Cortex 分成左右腻，各加入 1 mL buffer 後，
均質離心 (15,000 x g，30 min，4℃) 取上清液。Hippocampus 加 入 1 mL buffer 後，均質離心 (15,000 x g，30 min，4℃) 取上清 液，保存於 -80℃ 的冷凍櫃中以供後續之分析。
(2) 脂蛋白脂質過氧化測定分析法 (thiobarbituric acid reactive substances；TBARS)：與細胞實驗相同。
(3) 蛋白質含量之測定
以 bicinchoninic acid (BCA) 法蛋白質定量套組進行分析，
BCA 法是利用蛋白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原，所生成的 Cu2+ 可以 BCA 專一性地呈色而定量，BCA reagent kit (23225, Pierce, Box, PO, USA) 含 Reagent A (BCA) 及 Reagent B (CuSO4)，先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻混合，
BSA 標準品 (2 mg/mL) 以 Tris 稀釋一系列濃度，2000、1000、
500、250、125、62.5 與 31.25 mg/mL。各標準品每濃度與樣品
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取 20 μL 以 3 重複加入微量滴定盤之孔槽內。每槽加 200 μL 上述之混合 BCA reagent，輕拍滴定盤的一側，使添加的各個成 份均勻混合。靜置 37℃ 反應 10 min。以 ELISA reader 測 570 nm 吸光。作圖畫出標準校正線，並決定未知樣本的濃度。
(4) 蛋白質電泳
將製備之蛋白質電泳膠片注入 4 μL marker 及 20 μL/well 之 定量完畢檢體蛋白質。通入電流 80 伏特至跑完 stacking gel，再以 120 伏特跑完 running gel 直到跳海。
(5) 蛋白質轉漬
於電泳結束後將蛋白質電泳膠片取出，截去上層膠體，並以 semi-dry 蛋白質轉漬槽進行轉漬。依正極至負極方向依序疊放：5 張 3 M paper、已用 methanol 溼潤的 polyvinylidene fluoride (PVDF) 轉 漬膜、電泳膠片、5 張 3 M paper，將其組合完成後將以轉漬槽上蓋 蓋上，以 400 毫安培通電轉漬 2 小時。轉漬完成後，取出轉漬膜 並於右上方截去一角以作標示，再將轉漬膜浸置於含明膠-NET 之 Tris-NaCl buffer saline tween 20 (TBST) 室溫震搖 1 小時，以完成 blocking 動作。將 blocking 完成之轉漬膜浸於一次抗體溶液中震搖 1 小時，再以 TBST 溶液沖洗轉漬膜 15 min 重複 3 次。加入接 有 hydrogen peroxidase (HRP) 標示之二次抗體 (1:10,000) 後置於 室溫下震搖 1 小時。以 TBST 溶液沖洗轉漬膜 15 min 3 次。加入 HRP 冷光呈色劑反應 5 min，在弱光下將轉漬膜固定於壓片夾上，
再於暗房中以底片進行壓片 (20 sec - 1 min，效果不佳可重複壓片)，
再分別以顯影劑、水、定影劑 (各搖晃維持 10 sec) 順序進行洗片。
訊號強度以 ImageJ 軟體進行分析比對。
(6) 組織免疫染色 (immunohistochemistry stain)
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大鼠犧牲後取腻組織並快速浸泡於 10% 的福馬林中，進行
石蠟包埋與切片 (3-5 μm/片)。將完成的組織切片置於 superfrost coating slide 上，以 45oC 烘片隔夜。之後將切片置於 xylene 中 脫臘 3 次，每次 10 min。隨後依序置入 100%、95%、85%、75%、
65%、55% 之乙醇溶液中去除 xylene。再以 TBS 溶液清洗 3 次，
每次 5 min 進行回水作用。切片浸泡於 10 mM 之檸檬酸鈉中，
並以 100oC 加熱 30 min 以進行抗原復性作用，待其冷卻。完成 後立即將切片浸泡於室溫的 TBS 溶液中 10 min。以邊界筆 (DakoCytomation Pen, Glostrup, Denmark) 在切片之組織外圍進 行圈畫。加入適量 3% H2O2 反應 10 min。再以 TBS 溶液清洗 1 次。加入 10% goat serum-PBS 溶液進行 blocking 作用 1 hr。甩 掉 blocking 溶液並滴上已稀釋之抗體溶液 (Monoclonal sAPPα antibody, Monoclonal Aβ40 antibody)，於 4oC 下反應隔夜或 37℃
反應4 小時。完成後以 TBS 溶液清洗 1 次。加入 superenhancer 溶液於室溫下避光反應 30 min。再以 TBS 溶液清洗 1 次後以 DAB 呈色 1.5 min。再以 hematoxylin 進行 counter stain。完成 後於光學顯微鏡下觀察。
(四) 統計方法
實驗結果均以平均值 ± 標準誤差 (mean ± SD) 表示。利用 SPSS 系統 之單因子變方分析 (One-way ANOVA) 進行統計處理，再以 Duncan’s multiple range test 作組間的差異性比較，p< 0.05 表示具有顯著性差異。
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第四章 研究結果
第一節 桑黃子實體與固態發酵萃取物及 hispidin 對類澱粉樣蛋白
1-40 毒殺神經細胞之體外評估試驗
(一) Aβ40 濃度對於 PC12 細胞存活率之影響本研究以大鼠腎上腺之嗜鉻神經纖維母細胞 PC12 細胞株評估體外 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物抑制 Aβ 對於細胞毒殺的影響。以經 7 天聚合之不同濃度的 Aβ40 處理 PC12 細胞後可發現其細胞存活率與 Aβ40 的濃度可呈現劑量效應關係 (圖 4-1)。由結果可證明 PC12 細胞確 實可作為 Aβ40 誘發細胞毒性的體外評估模式。
(二) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物(PLF 與 PLM) 及 hispidin 對於 PC12 細胞之影響
分別以不同濃度之 PLF 與 PLM 及 hispidin 處理 PC12 細胞後可 發現其細胞存活率並不會受到此試驗物質濃度增加而有所影響 (圖 4-2、
4-3 及 4-4)。由此結果可證明本論文所使用之試驗物質對 PC12 細胞無任 何影響。
(三) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物 (PLF 與 PLM) 及 hispidin 對於 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之影響
分別以 PLF 與 PLM 與 Aβ40 (0.6 μM) 共處理 PC12 細胞後，可發 現無論是 PLF 或 PLM 均能使 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之效果明顯降低，
其細胞存活率與試驗物質濃度呈現劑量效應關係，且 PLM 較 PLF 具有 更好的抑制效果 (圖 4-5 及 4-6)。
以 hispidin 與 Aβ40 (0.6 μM) 共處理 PC12 細胞，其存活率如圖 4-7 所示，所有處理組別 (最高處理濃度為 1μg/mL) 均無法抑制 Aβ40 對於
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圖 4-1、不同濃度之 Aβ40 對於 PC12 細胞存活率之影響
Fig. 4-1 The effect of increasing concentration of Aβ40 on PC12 cell viability.
Data are presented as means ± SD (n=4). Mean values within each column with different superscripts are significantly different (＊p< 0.05 vs. control group).
0 20 40 60 80 100 120
control 0.6 0.7 0.8
Cell viability (%)
Aβ40 concentration (μM)
* * *
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圖 4-2、不同濃度之桑黃子實體乙醇萃取物 (PLF) 對於 PC12 細胞存活率 之影響
Fig. 4-2 The effect of ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) concentration on PC12 cell viability. Data are presented as means ± SD (n= 4).
Mean values within each column with different superscripts are significantly different (＊p< 0.05 vs. control group).
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圖 4-3、不同濃度之桑黃固態發酵乙醇萃取物 (PLM) 對於 PC12 細胞存 活率之影響
Fig. 4-3 The effect of ethanol extracts of Phellinus linteus mycelium (PLM) concentration on PC12 cell viability. Data are presented as means ± SD (n= 4).
Mean values within each column with different superscripts are significantly different (＊p< 0.05 vs. control group).
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圖 4-4、不同濃度之 hispidin 對於 PC12 細胞存活率之影響
Fig. 4-4 The effect of hispidin concentration on PC12 cell viability. Data are presented as means ± SD (n= 4). Mean values within each column with different superscripts are significantly different (＊p< 0.05 vs. control group).
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Aβ40
(μM) 0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
PLF
(μg/mL) 0 0 0.5 0.75 1 3 5
圖 4-5、不同濃度之桑黃子實體乙醇萃取物對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護 影響
Fig. 4-5 The protection effect of ethanol extracts of Phellinus linteus fruit body (PLF) concentration on the protection of PC12 cell viability against Aβ40 induced cytotoxin. Data are presented as means ± SD (n= 4). Mean values within each column with different superscripts are significantly different (***p< 0.001 vs. Aβ40 group).
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Aβ40 (μM)
0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
PLM
(μg/mL) 0 0 0.5 0.75 1 3 5
圖 4-6、不同濃度之桑黃固態發酵乙醇萃取物對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護 影響
Fig. 4-6 The protection effect of ethanol extracts of Phellinus linteus mycelium (PLM) concentration on the protection of PC12 cell viability against Aβ40 induced cytotoxin. Data are presented as means ± SD (n= 4). Mean values within each column with different superscripts are significantly different (***p< 0.001 vs. Aβ40 group).
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Aβ40 (μM)
0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
HIS
(μg/mL) 0 0 0.1 0.2 0.5 0.8 1
圖 4-7、不同濃度之 hispidin 對 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之保護影響
Fig. 4-7 The protection effect of hispidin concentration on the protection of PC12 cell viability against Aβ40 induced cytotoxin. Data are presented as means ± SD (n=
4). Mean values within each column with different superscripts are significantly different (***p< 0.001 vs. Aβ40 group)
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PC12 細胞毒殺之影響，推測可能原因為 hispidin 之處理濃度過低，過去 研究需 400 μg/mL 之 hispidin 始有抑制 BACE 之效果 (Park et al., 2004b)，抑或是在 PLF 及 PLM 中抑制 Aβ40 毒殺 PC12 細胞之功效成 分不只有 hispidin，還有其他抗氧化成分之共同影響，如 hispolon 及 inotilone (Chen et al., 2016)，因而造成此結果。
(四) 桑黃子實體與固態發酵乙醇萃取物 (PLF 與 PLM) 及 hispidin 於 PC12 細胞中的抗氧化能力
PLF 與 PLM 及 hispidin 於 PC12 細胞中 MDA 濃度之影響如圖 4-8 所示，PC12 細胞中之 MDA 濃度在添加 Aβ40 (0.6 μM) 後會被提高，
但此 MDA 濃度的上升在添加較高濃度的桑黃子實體與固態發酵乙醇萃 取物與 hispidin 後可有效的被降低，添加較低濃度的桑黃子實體與固態發 酵乙醇萃取物與 hispidin 則無法降低 PC12 細胞中 MDA 之濃度，可能 因 PLF 及 PLM 中除了 hispidin 外還有其他的抗氧化物質，因而造成結 果。
第二節 桑黃子實體與固態發酵萃取物對腻部輸注類澱粉樣蛋白
1-40 之阿茲海默症模式大鼠記憶學習能力之影響
(一) 參考記憶試驗 (Reference memory task)參考記憶試驗是在泳池的第 IV 象限中放置一個沒入水面之平台，藉 由大鼠每次搜尋平台花費的時間，作為評估大鼠長期記憶能力之標準，此 試驗分為三天共進行 12 次，大鼠於第 5 與第 9 次試驗時所花費之時間 長短反應其長期記憶能力。結果如圖 4-9 及表 4-1 所示，在同一天之 4 次訓練中，隨次數增加各組搜尋平台時間皆明顯減少，又參考記憶試驗曲 線下面積顯示 Aβ 組之每日搜尋平台時間均較具正常記憶能力的 Vehicle 組長 (p < 0.05)，餵食試驗物質組別則可改善此情形；在經過一夜休息之第
