實驗方法

壹、菌株的培養

BCRC11509 使用培養基為 Medium 66，TRYPTIC SOY BROTH OR TRYPTIC SOY AGAR (DIFCO 0369) 配製 1 L 所需的藥品:

藥品名稱 重量(克重) Tryptone 15.0 g Soytone 5.0 g NaCl 5.0 g Agar 15.0 g

最後調整 pH 值到 7.3，然後放入高壓滅菌鍋（autoclave）中，於高溫 121 °C，

蒸汽壓 15 Psi 狀態下，滅菌 20 分鐘。

貳、藥物處理

我 們選擇 幾 種常 用的 藥物作 為 標 準 處 理 ， 包括 VK₃(medadione sodium bisulfite)、Adriamycin、Cisplatin、Mitomycin C、Sodium butyrate、及 2-Aminopurine 等，大腸桿菌以不同濃度之藥物處理 4hr，然後利用洋菜擴散法分析其抑菌作用。

並以0.22μm的過濾網過濾，之後，加入 20％(v/v)的 TCA(tricholoracetic acid;Sigma Chemical CO.) ，然後分裝在四支微量離心管中，放入-20℃的冰箱靜置 30 分鐘。

將其取出後在 4℃的環境下以 13000G 的轉速離心 10 分鐘，倒掉上層液體，得到 的沉澱物加入丙酮後再放入-20℃的冰箱保存備用。

肆、蛋白質定量

蛋白質定量:(Biorad assay )

以 bovine serum albumin（BSA）作為定量的標準蛋白質。各取 800μl的標 準液（各含 0、5、10、15、20μg的 BSA）和 200μl的 Bio-Rad protein dye 混合。

用分光光度計測其在 595 nm 時的吸光值，畫出一條標準曲線。測樣品在 595 nm 均注入一條 Focusing Tray（Bio-Rad）中，取兩片 wicks，分別置於正負兩極上 方。再使用夾子將 17 公分的 IPG（Bio-rad）strip 撕開，膠體面朝下，對準 Tray 上的正負極，小心的放下膠條，避免有任何氣泡產生，然後以大約 2.5ml 的礦 物油均勻覆蓋在膠條上，以免 buffer 蒸發而乾掉燒焦，最後蓋上蓋子，把此 Focusing Tray 放入 IEF Cell 中。

2. 等電膠電泳分析

Protean IEF Cell(Bio-Rad)設計程式如下：

R（Rehydration）：20℃，50V，12 小時，此一步驟的目的是讓 Rehydration buffer 和樣本混和並吸入 IPG strip 膠條中。

S1（condition Step）：250V，200min，linear，目的是移去鹽類離子及污染物。

S2（Voltage Reagent）：10000V，2.5hrs，linear。

S3（Final Focusing）：10000V，40000V-hr，linear。

S4（Hod step）：500V，以避免過度反應發生。

3. 平衡

配製 Equilibration Buffer：

Equilibration BufferⅠ：取 13.5ml 的 30%Glycerol(Bio-Rad)，加進 Equilibration BufferⅠ(Bio-Rad) （ 6M urea,0.375 M Tris-HCl,pH 8.8,2% SDS,20%

glycerol,2%(w/v)DTT; Bio rad）的瓶子中，放在磁石攪拌器上攪拌，直到溶解為 止。

Equilibration BufferⅡ：取 13.5ml 的 30%Glycerol(Bio-Rad)，加進 Equilibration BufferⅡ(Bio-Rad) （ 6M urea,0.375 M Tris-HCl,pH 8.8,2% SDS,20%

glycerol,2.5%(w/v)iodoacetamide;Bio rad）的瓶子中，放在磁石攪拌器上攪拌，直 到溶解為止。

1. 將 strip 自 focusing tray 取出後，把膠條先過去離子水兩次，然後將膠面朝上，

把 底 部 的 水 及 礦 物 油 以 廚 房 用 的 紙 巾 大 致 吸 除 。 再 將 strip 放 入 裝 有 Equilibration BufferⅠ的長玻璃管中，以震盪器調低轉速搖盪 15-20 分鐘（在搖 盪過程中膠面要朝上）。

2. 取出膠條，過去離子水兩次，將膠面朝上，把底部的水用廚房專用紙巾大致吸 除，然後把 strip 放入裝有 Equilibration BufferⅡ的長玻璃管中，以震盪器調低 轉速搖盪 15-20 分鐘（在搖盪過程中膠面要朝上）。

1.5M Trip PH8.8 8.8ml

10%ammonium persulfate(sigma) 350μl

TEMED(Bio-rad) 14μl

小心的將配好的溶液加入大小玻璃的夾縫中，之後覆上一層去離子水，目

c. 配製 running buffer 配製 3L 所需藥品：

將 Running buffer 加入電泳槽內至少蓋滿膠片玻璃下緣附近的白金線，而 上層 buffer 的量亦是需高過白金線。蓋上電泳槽上蓋，插上電源，使用

依據 Bio-rad 出產的 siliver Stain Plus，過程主要分成四大步驟：

a.固定步驟-20 分鐘

固定溶液的製備（針對 17 公分的膠片）

試劑 體積 體積百分比

Reagent Grade Methanol 200ml 50% V/V Reagent Grade Acetic acid 40ml 10% V/V Fixative Enhncer concentration 40ml 10% V/V Deionized Distilled Water 120ml 30% V/V 將電泳之後的膠片放入此固定液中，並以低轉速搖盪 20 分鐘。

b.潤洗步驟 -20 分鐘

2.Coomassie blue R-250

將電泳完畢的膠片浸入 coomassie blue(sigma)（0.125％，Coomassie blue R-250，50％methanol，10％Acetic acid）中，以震盪器調低轉速搖盪至少 24 小 時。染色後的膠片先浸入 destain Ⅰ buffer（50％Methanol，10％acetic acid）以震 盪器調低轉速搖盪，直到看出最靠近膠片末端的藍線，接著再將膠體繼續浸入 destain Ⅱ buffer（5％methanol，7％acetic acid），同樣以震盪器調低轉速搖盪直 至 看 清 最 靠 近 膠 片 末 端 的 藍 線 為 止 ， 若 一 直 得 不 到 滿 意 的 結 果 ， 可 更 換 destainⅡbuffer 數次，直到染色的結果滿意。

膠片掃瞄、軟體比對(PDQuest 使用) 中，浸泡樣品 15mins，並重複一次◦(此目的在將 Coomassie blue 的染劑洗出) 5. 去除上述的溶液，並加入適量 100％的氰化甲烷，然後以 10000G 離心 1min，

接著將清洗過的試管攤平置於烘箱烘乾備用◦

2. 將前一天放入水浴的試管拿起，加入 50μl的 50％的氰化甲烷/5％的甲酸混合 溶液，並用超音波震盪 1min，再停 1min，重複 10 次◦(避免連續震盪太久造 成高溫而破壞蛋白質)

3. 以 10000G 離心 15~20mins，使膠沉澱方便取上層液，吸取上層液至已消毒烘 乾過的試管◦(須注意千萬不可取到底部的膠)

4. 重複步驟 2 和 3，並將取得的上層液結合，然後將試管在 35℃下真空抽氣離 心乾燥至少1.5hrs◦

蛋白質膠內水解（in-gel digestion）

將膠點泡於 200μl 50％ Acetoitrile（ACN, 配製於 25mM 之 NH4HCO3, pH8.0），輕拍並放置十分鐘，然後吸掉 ACN，重複 2~3 次；接著用 100％ ACN 將膠點脫水，置於室溫五分鐘後移除 100％ ACN，用蛋白質抽乾機(Speed-Vac) 將膠體抽乾，約 30 分鐘。為了得到膠體中的 peptide 片段，利用胰蛋白酶水解 膠體。用5~10μl的胰蛋白酶（10μg/ml，配製於 25mM NH₄HCO3, pH8.0）處理 退染後且抽乾的膠體，置於室溫約十分鐘，然後放置在 37℃的培養箱中約 16~24 小時，以充分進行膠內分解 peptide 片段的作用。接著先將與膠體作用的胰蛋白 酶溶液收集到一支新的微量離心管。再用含有 50％ ACN 和 5％ formic acid 的 溶液 5μl再次萃取，靜置於室溫三十分鐘至一小時後，收集萃取後的溶液，此 步驟進行兩次。之後將所有收集到的萃取物（約 25μl）用 Speed-Vac 抽乾，約 三至四個小時。樣品委託鐠德公司進行質譜儀分析(Peptide Mass Fingerprinting Analysis)，樣品經 Q-TOF ESI/MS/MS 分析後，於 MASCOT 資料庫比對的蛋白 質 ID 鑑定結果。

玖、生物資訊分析

1.進入全球最早也最完整的蛋白質資訊網站 SWISS-2DPAGE，並在視窗的左方找 到 search proteins by pI/ Mw range，點選進入畫面◦

2.鍵入 pI 值及蛋白質分子量的範圍，並選擇為 ECOLI map，按下 refresh maps 便 開始搜尋◦

3.依 pI 值及子分量的大小會出現數個符合上述條件的蛋白質，選擇其一有興趣的 蛋白質點選便可進入單一蛋白質介紹◦

4. 進入此畫面後點選 MAP LOCATIONS，便會開啟另一視窗◦

5.由此可得知該蛋白質在 2D-PAGE 上的相對位置◦

6.運用上述方法找出下表中蛋白質的位置，並將其相對位置與本實驗中對照組的 大腸桿菌蛋白質表現和以 VK₃ 處理四小時後大腸桿菌蛋白質表現的兩膠片比 對時所產生的主膠比對，訂出已知蛋白質的 ssp 相對座標值，以做為每次不同 膠片比對時所需觀察蛋白質的參考座標位置◦

Protein name

Full name pI Mw ssp

AhpC (7) Alkyl hydroperoxide reductase subunit C (EC 1.11.1.15) (Peroxiredoxin) (Thioredoxin peroxidase) (Alkyl hydroperoxide reductase protein C22) (SCRP-23) (Sulfate starvation-induced protein 8) (SSI8)

5.01 21579 3358

CheY (6) Chemotaxis protein cheY 4.59 9749 ? SucB (4,5) Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase

component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex (EC 2.3.1.61) (E2) (Dihydrolipoamide

succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex)

5.4 52658 5626

LysA(1) Diaminopimelate decarboxylase (EC 4.1.1.20) (DAP decarboxylase)

5.76 45059 6579 G3p1(2,3) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A (EC

1.2.1.12) (GAPDH-A)

6.28 32860 8508