壹、藥物對大腸桿菌蛋白質表現的影響
我們選擇幾種常用的藥物作為標準處理，包括 Vitamin k3(medadione sodium bisulfite)、Adriamycin、Cisplatin、Mitomycin C、Sodium butyrate、及 2-Aminopurine 等，大腸桿菌以不同濃度之藥物處理 4hr，然後收集其蛋白質，定量後進行二維 蛋白質電泳。有些藥物(如 Mitomycin C)處理後，蛋白質電泳膠片無法用 PDQuest Advanced 8.0.1 進行分析，其電泳膠片圖則列於附錄中。
VK3對大腸桿菌蛋白質表現的影響
維他命 K 又稱氫化甲荼錕﹝Menadione﹞，屬脂溶性維他命，維他命 K 共有 三種，K1、K2 可由腸內菌製造，K3 則是合成物質。維他命 K 屬於 Quinone 類 的物質，對於人體的功效是幫助凝血。VK3 曾進入第三期的癌藥試驗，其作用 機制可能是造成細胞氧化壓力，導致細胞凋亡。以 VK3 藥物處理過的大腸桿菌 蛋白質膠片比對結果顯示 RecA、GroES、Zwf、UspF 的濃度都有增加兩倍以上 的變化，而 DnaK、UspA、UspE、SodB、TrxA 的濃度則有減少兩倍以上的變化，
GroES、Zwf、DnaK、UspF 這些蛋白質變化與文獻報告相同(Han & Lee, 2006;
Lasserre et al., 2006; Nystrom, 2006; Oishi et al., 2006)(Dwyer, Kohanski, Hayete, &
Collins, 2007)；而 RecA、UspA、UspE、SodB 則與文獻報告相反(Han & Lee, 2006;
Lasserre et al., 2006; Righetti & Boschetti, 2007; Weber, Kogl, & Jung, 2006)。一般 來說 DnaK 或壓力相關蛋白質 UspA、UspE 等，在細胞受到氧化壓力時，會增量 表現來保護細胞，蛋白質變化與文獻不同的地方，可能與菌種及培養狀態有關 (Dwyer et al., 2007; Easton, Thompson, & Crowder, 2006; Han & Lee, 2006)。
另外從數據分析的結果中選擇其濃度變化有遞增或遞減的幾點蛋白質，並用 生物資訊找出其可能的名稱，如 Odp2、ClpB、PflB GltD、Syn 等變化，則是本 研究的發現◦
Sodium butyrate 對大腸桿菌蛋白質表現的影響
丁酸鈉(sodium butyrate)原是抗氧化物質，最近發現有許多用途。例如可改 變 SMN2 基因的 splicing pattern 進而治療脊髓肌肉萎縮症(Li, Wang, Cui, Chen, &
Zhang, 2006)。丁酸鈉也是組織蛋白去乙醯酵素(HDAC; histone deacetylase)的抑 制劑，有調控基因轉錄的效果進而使得外來基因表現量提升(Balakrishnan &
Milavetz, 2007; Kumar, Sonnemann, & Beck, 2006; Vlasakova et al., 2007)。所以在 這我們設計一組實驗，大腸桿菌先以 Sodium butyrate 藥物處理過，收集其蛋白 質，定量後進行二維蛋白質電泳，蛋白質膠片比對結果如圖 4-1、4-2、4-3 ◦
Sodium butyrat 會增加 DnaK、RecA、GroEL、UspE 的表現，而使 UspA、
SodB、Tpx、TrxA 的濃度下降 ◦另外從數據分析的結果發現蛋白質 Sym、GroEL、
ClpB、MurE、 FucK、TalB、Tig、Kad、 HypB、OmpA 的濃度發生變化。蛋白 質變化與文獻互有異同(Arnold, McElhanon, Lee, Leonhart, & Siegele, 2001; Biard, Maratrat, Thybaud, Melcion, & Sarasin, 1992; Li et al., 2006)。由於組織蛋白去乙醯 酵素(HDAC; histone deacetylase)的抑制劑目前是重要的篩選藥物標的，因此蛋白 質變化圖譜可以用來尋找新的 HdaC 抑制劑◦
Adriamycin 對大腸桿菌蛋白質表現的影響
Adriamycin(俗稱為「小紅莓」，其藥物為紅色之故)是非常重要的抗癌藥物。
其作用機制被深入研究，可能在 DNA，自由基，甚至蛋白質後轉譯修飾等層次 發生作用(Abramov, Aronovitch, & Ramu, 1996; Amash, Brown, & Padron, 1995;
Gelvan, 1997; Kaur & Russell, 1998)。大腸桿菌先以 Adriamycin 藥物處理過，二 維蛋白質電泳蛋白質膠片比對結果如圖 5-1、5-2、5-3 ◦
Adriamycin 藥物處理後的大腸桿菌，其蛋白質 DnaK、RecA、Gor、UspA、
UspE 、SodB 、Tpx 、TrxA 的濃度都有減少兩倍以上的變化 ◦比較文獻的結果，
可能是 Adriamycin 實驗劑量稍高，造成細胞受損嚴重。另外從數據分析的結果 中找出蛋白質 NlpD、DegP、YliB、GlyA 的變化情形 ◦可作為篩選藥物的參考圖 譜。
Cisplatin 對大腸桿菌蛋白質表現的影響
順鉑(Cisplatin)也是非常重要的抗癌藥物，是唯一被使用於抗腫瘤藥物的重 金屬物質，其作用機制之一為阻斷 DNA 的合成(Arner et al., 2001; Bhattacharya &
Beck, 2002; Nimonkar, Le Gac, Villani, & Boehmer, 2006; Nowosielska & Marinus, 2005; Zdraveski, Mello, Marinus, & Essigmann, 2000)。大腸桿菌先以 Cisplatin 藥 物處理過，二維蛋白質電泳蛋白質膠片比對結果如圖 6-1、6-2、6-3 ◦
Cisplatin 降低 DnaK、UspA、UspE、SodB、Tpx、TrxA 的濃度，另外從數 據分析的結果找出蛋白質 HtpG、GlnA、FtsZ、Syd、NusA、GlpK、K6pF2、IlvC (Chen, 2006; Eisenstein, 2006; Han & Lee, 2006)。
VK3和 Sodium butyrate 合併使用對大腸桿菌蛋白質表現的影響
VK3和 Sodium butyrate 在氧化壓力機制的兩端上作用(Arnold et al., 2001;
Bore et al., 2007; Grebenova et al., 2006)。在大腸桿菌上檢驗這兩種藥物處理後的 蛋白質表現差異，可以提供氧化壓力機制的深入探討及理論建模的數據(Chen, 2006; Dwyer et al., 2007; Maillet et al., 2007)。合併藥物處理的大腸桿菌蛋白質膠 片比對，結果如圖 8-1、8-2、8-3 ◦ 部分結果如預期，有些壓力蛋白質 UspE、
MurE 持續增加，有些下降，如果要進一步分析，則可以增加 VK3 和 Sodium butyrate 不同濃度比的實驗。從從數據分析的結果及 ExPASy 蛋白質體資料庫，
找出一些與氧化壓力機制可能有關的蛋白質，如 MurE、Syq、FabD、K6pF2 、 DhsA、G3p1 等，都可作為監測藥物處理效果的標的物。
VK3和 Adriamycin 合併使用對大腸桿菌蛋白質表現的影響
VK3 和 Adriamycin 在藥理作用上有許多相同機制，同樣會造成氧化壓力 (Gelvan, 1997; Nystrom, 2006)，但 Adriamycin 會直接作用到 DNA 上，而 VK3則 與細胞週期蛋白質磷酸化有影響(Kaur & Russell, 1998)。蛋白質膠片比對結果顯 示以 VK3和 Adriamycine 處理後，大腸桿菌受損嚴重，大部分蛋白質表現皆下降，
而與 VK3合併 Adriamycin 使用特定相關的蛋白質有 DnaK、RecA、UspA、UspE、
SodB、Tpx、TrxA 等，其間的關係提供進一步的探討背景。另外從數據分析的 結果中找出 OpgG、Syq 蛋白質的變化也值得注意◦
參、藥物處理時間對大腸桿菌蛋白質表現的影響
在藥理作用機制研究上，觀察藥物處理時間與藥物效果之間的關係是很重要 的實驗，因為藥物進入細胞後會反應、分解、代謝甚而排除。了解不同藥物處理 時間的蛋白質表現變化，對基因調控及藥效才有更進一步的認識(Kuznetsov et al., 2007)。數據分析結果如圖 10-1、10-2、10-3◦由不同時間的蛋白質表現變化，根 據圖 10-2 和 10-3 中的長條圖，以蛋白質最大的表現量當作基準，依序算出每個 白質的量有震盪式的表現，有 RecA、GroEL、UspE、SodB、 TrxA、和 Zwf。
結合時間序列實驗結果及原有藥物作用模式，可以更完整分析此藥物之作用機制
(Govorun & Archakov, 2002; Weinstein, 2001)。
肆、2-Aminopurine 處理對大腸桿菌蛋白質表現的影響
2-氨基嘌呤(2-aminopurine)是嘌呤的氨基化衍生物,細菌以 2-Aminopurine 藥 物處理過，會減少 DNA 合成(Hong, Yeung, Funchain, Slupska, & Miller, 2005;
Matic, Babic, & Radman, 2003; Matic, Ekiert, Radman, & Kohiyama, 2006; Pitsikas, Patapas, & Cupples, 2004; B. T. Smith, Grossman, & Walker, 2001)。選擇藥理機制 單純的 2-氨基嘌呤進行藥物合併實驗，希望藥物合併處理後蛋白質表現也單純，
易於分析。蛋白質質膠片比對結果如圖 11-1、11-2、11-3 ◦
2-Aminopurine 藥物處理後的大腸桿菌，與 DNA 合成相關蛋白質 GroES、
GroEL、DnaB、Eno、ClpB 如預期地增加(Matic et al., 2003; Matic et al., 2006; Miller etal.,1999;B.T.Smith etal.,2001)◦
VK3和 2-Aminopurine 合併使用對大腸桿菌蛋白質表現的影響
VK3 和 2-Aminopurine 藥物處理的大腸桿菌蛋白質膠片比對，結果如圖 12-1、12-2、12-3◦
由圖 12-2 可知，VK3對蛋白質 UspF、Pt1、DnaB、Eno 有增加濃度的影響。
而 2Aminopurine 對蛋白質 Tpx、DnaB 的濃度有增加兩倍以上的的影響，另外從 數據分析的結果中找出蛋白質 DgaL、MetK 或 Idh、K6pF2、AroG 與此兩種藥物 的交互作用機制可能有關。 pathway)(Andersen & Mann, 2006; Ettema et al., 2005; Gatenby & Frieden, 2007;
Herrera et al., 2007)。生化路徑分析在於研究生物內元素間化學反應的關係。由於 生化路徑的複雜度極高，利用數學運算模型化工具分析實驗及模擬資料後，以使 用者較方便(drag-and-drop)的圖像介面，描繪出整個生化路徑，是目前比較為人 接受的表現方式。除此之外，可進行敏感度分析，評估參數改變所帶來的影響，
並標示出在生化路徑內可能的藥物標地。藉由實驗數據，細胞試驗的層級轉而對 細胞訊息傳遞及調控層級的了解，進而辨識藥物或基因在生物功能上所能影響的
程度和機制。加上整合比較各種模式生物在網路上的微陣列基因分析數據，運用 多層次自我組織圖神經網路，建立加值資料庫，找出具有代表性的基因藥物作用 網路；建立一個基因藥物協同作用的機制模式。(T. L. Lee et al., 2006; Yamada et al., 2007; Yan, King, He, Caldwell, & Zhou, 2006a)