實驗方法

(一) 細胞培養 (Cell culture) :

老鼠成骨細胞株 (mouse osteoblastic cell line; MC3T3-E1) 培養在 α-MEM 培養液中。將 α-MEM 加入 2.2 克的碳酸氫鈉 (Sodium bicarbonate)，以 1 N 鹽酸(HCL) 將 pH 調整至 7.4，再 以 0.22 μm 過濾器(filter)過濾。最後加入 10 %胎牛血清(fetal bovine serum)、100 μg/ml 盤尼西林/鏈黴素(P/S)。將 MC3T3-E1 細胞培養在37℃，5% CO₂的培養箱(incubator)裡，約二到三天 繼代培養一次。

細胞分盤，首先將培養皿中細胞培養液吸出，加入 10 毫 升的phosphate buffered saline (PBS) (0.02 % KH2PO4、0.02 %KCl、

0.8 % NaCl、0.216 % EDTA )緩衝液沖洗二次，再加入 1 毫升 trypsin (含 0.05% trypsin、0.02% EDTA)，能幫助細胞脫離培養 皿底部。置於37℃作用二到三分鐘，使細胞脫離培養皿，如尚

(二) 定量即時聚合酶連鎖反應 (Quantitative Real-time polymerase Chain Reaction; qPCR):

定量PCR 的原理是利用在進行 PCR 時，同步偵測 PCR 產 物，並利用偵測到的產物來回推樣品中原始的基因表現量。主 要可分為兩種方式，分別是TaqMan probe 與 SYBR green。本研 究使用的是SYBR Green 系統，其原理為將未鍵結到 DNA 上的

濃度較低，便會在較高 cycle 數時才能偵測到放大的螢光值， 後，用Beckman DU-800 UV/Visible spectrophotometer 來測量 RNA 濃度，並注意使得 A260/280 數值介於 1.8~2.0 之間，以

細胞存活率測定方法的原理是因為在活的細胞裡，其粒線 體內含有脫氫酵素(Dehydrogenase)，此酵素可以將黃色水溶性 (3-(4,5)-dimethylthiahiazol-2-y1)-2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT) 的 tetrazolium ring 還原切斷，而形成藍色的沉澱物 formazone。而在死亡的細胞裡並不具有脫氫酵素，因此亦不能 形成藍色沉澱物 formazone。而我們最後再透過加入 DMSO 來 溶出藍色沉澱物formazone，然後以 ELISA reader 570 nm 來測 量其吸光值，即可得知細胞存活率。

將成骨細胞分盤至96 孔盤中，每一孔洞的細胞數平均約為 5000 顆，等細胞於孔盤中貼附好之後，抽去原有之培養液，並 加入 serum-free 培養液。且分別加入不同濃度肉蓯蓉粗萃取物 培養四十八小時後，加入MTT 三十分鐘、再抽除培養液。並在 每一孔洞加入100 ml DMSO，然後使用 ELISA reader 570nm 來 測量吸光值。吸光值的計量方式是以生長百分比計算出不同濃 度的藥物對生長的影響。

(四) 西方點墨法 (Western blotting) :

西方點墨法的原理是利用抗原抗體免疫反應的方法，來偵 測我們想要觀察的某些特殊的蛋白質。方法為先將樣本混合物 經過 polyacrylamide 電泳分離出蛋白，然後轉印到硝酸纖維膜 上，接著以標記的抗體與之結合，再用顯影劑使之呈現在感光

SDS-PAGE 中分離蛋白質(以 120 voltage 電壓進行電泳一小時)。

分離後將膠體取出並轉印紙(Polyvinylidene fluoride membrane ; PVDF membrane)放齊，緊接著在轉置槽中注滿 Transfer buffer 後，在 4℃冰上以 400 毫安培電流轉印二小時。之後將轉印紙 置於含5 % 脫脂奶粉由 TBS-T 配置成的 Blocking buffer 15 ml 在室溫中搖晃 1 小時。再與 TBS-T 稀釋之一級抗體 10 ml p-Akt,p-p65, p-p38, p-JNK, p-ERK, Akt,p65, p38, JNK, ERK 於 4℃冰箱搖晃 1 小時至一天後，以 TBS-T 清洗四次，每次 15 分 鐘。緊接著再給與TBS-T 稀釋之二級抗體 10 ml HRP-mouse and rabbit 且於室溫中搖晃一小時後，同樣的以 TBS-T 清洗四次後，

在暗房中加入Enhanced chemiluminescence (ECL)顯像，用感光 底片感光至Band 出現。

(五) 礦化 (Mineralization):

培養的成骨細胞礦物質堆積可以用 von Kossa stain 或 Alizarin red stain 來作觀察。其中 von Kossa stain 是用銀離子與 phosphate 反應來觀察，而非直接與鈣結合染色。而 Alizarin red stain 可以直接對磷酸鈣沉積物做染色，因此本實驗以此染色法 觀察成骨細胞礦化的現象。

將細胞培養到約九分滿，而約2~3 天即更換培養液以及分 化劑(β-glycophosphate 10 mM 與 Vitamin C 50 μg/ml)，同時給予 不同濃度的肉蓯蓉粗萃取物刺激。約十四天之後，以PBS 清洗 細胞，並以 10％福馬林固定 15 分鐘、PBS 清洗，接著以 Alizarin red stain 來進行避光染色超過 1 小時以上，再用滅菌水清洗。將 最 後 的 細 胞 染 色 結 果 以 照 相 系 統 拍 照 ， 再 使 用 10%

cetylpyridinium chloride 溶下 Alizarin red，並用 ELISA reader 550 nm 吸光值來進行測量。

(六) 細胞移行實驗 (Migration assay) :

細胞移行實驗是以transwell (Costar, NY ; pore size, 8-μm) 二十四孔盤為材料，在大約種植2 10Ⅹ ⁴ 的細胞量之後，將 200 μl serum-free 培養液置於 transwell 的上層，並在下層加入不同 濃度的肉蓯蓉粗萃取物及300 μl serum- free 培養液，置於 37℃、

5% CO₂ 培養箱中培養二十四小時。最後利用福馬林固定十五 分鐘，接著以0.05% crystal violet 染色十五分鐘。並以棉棒去 除膜上層的細胞，用 PBS 清洗之後，剩下移行到膜下層吸附的 細胞，此時以顯微鏡計數細胞總量，並將計得之量進行統計分 析。

(七)傷口癒合實驗(Wound healing assay) :

MC3T3-E1 細胞取得之後，培養在 6 well 的培養皿，每一格 well 的細胞數為 1×10⁵ /ml，等到培養皿上的細胞成長到 80％到 90％滿之後，再加入肉蓯蓉培養 24 到 48 小時。利用無菌的 P-200 pipette tip 在培養皿上水平刮出線性的直線，此時刮出來的直線 上細胞也跟著被移除，形成簡易的傷口模型，並且在培養皿的底 層以簽字筆畫出黑色直線做為記號，對於每次在作傷口癒合的分 析時可以藉由直線的相對位置，準確定位觀測在位置都在同視野。

之後放入培養箱中進行培養，每隔二十四小時及四十八小時利用 Nikon ECLIPSE Ti 倒立螢光顯微鏡（目鏡 CFWE10×/18；物鏡 E4×）觀察，並進行拍照。取得相片之後，利用軟體 NIS-Elements Basic Research 3.0 進行分析。其中要注意的是，因為從培養箱取 出之細胞培養皿，與室溫有溫差的存在，因此導致培養皿上蓋會 出現薄霧的現象，影響觀察。所以當薄霧出現的時候，可用手指 在上蓋摩擦，以減少溫差，降低薄霧形成並儘速完成觀察與拍 照。

(八)ALP activity assay

利用p-Nitrophenyl phosphate 被鹼性磷酸酶分解後會變成最 大吸光值405 nm 的 p-nitrophenol 的特性，藉由偵測吸光值來定 量鹼性磷酸酶的活性。

將 經 過 肉 蓯 蓉 粗 萃 取 物 刺 激 二 十 四 小 時 後 ， 取 其 培 養 MC3T3-E1 成骨細胞株之上清液，加入 100 λ p-Nitrophenyl phosphate，混合後以 ELISA reader 測量 405nm 之數據並量化之。

(九) 冷光酵素 (Luciferase) 活性測定

將已經過十六至十八小時轉染NF-κB luciferase vector 的成

骨細胞株，再加肉蓯蓉粗萃取物培養二十四小時後，抽掉培養 基，以 PBS 清洗兩次並抽出 PBS，接著加入 80 μL 的 Reporter lysis buffer，小心輕柔的將細胞充分打散並均勻的將細胞刮取至 1.5 ml 離心管，並放置在冰上反應 10 分鐘，使得細胞完全被 打破而將蛋白質釋出。再以 13200 rpm 將離心管離心三分鐘之 後，取出 20 μL 之上清液，並加入 80 μL 的 luciferase substrate 使之迅速均勻混合，並以冷光儀測定測其 luciferase 活性，讀 取冷光產量數值後，以百分率換算表示之。

(十) 統計分析:

本實驗的結果以 Sigma plot 統計軟體進行分析，實驗結果 以成對t 檢定(paired t-test)計算分析。數據結果以 mean± S.E. 表 示各項數值，p＜0.05 表示達到顯著性差異。