100、1：500 與 1：1000 三種不同體積比來刺激 MC3T3-E1 成 骨細胞株，實驗初步結果顯示女貞子（圖4.1）、肉蓯蓉（圖4.2）、
行礦化作用，因此我們希望知道肉蓯蓉萃取物是否會加強成骨 細胞的移行聚集反應，進而強化成骨作用，因此利用Migration assay 與 Wound healing assay 來分析 MC3T3-E1 細胞株的移行情 況。在 Migration assay 中發現，給予不同濃度的肉蓯蓉粗萃取 物（0, 6.5, 13, 18.5, 26, 130 μg/ml）刺激，移行的情況並沒有明 顯的增加（圖 4.14Ａ）。此外在 Wound healing assay 中，以不同 濃度的肉蓯蓉粗萃取物（6.5, 13, 26, 130 μg/ml）刺激 MC3T3-E1 成骨細胞株，經過 24 與 48 小時後，觀察到並不會增加細胞的 移行（圖 4.14C、圖 4.14D）。
此外我們想要瞭解，肉蓯蓉的粗萃取物，是否會促進成骨 細胞的增生，於是我們利用MTT assay 來分析 MC3T3-E1 細胞 株 的 增 生 表 現 ， 在 經 由 不 同 濃 度 的 肉 蓯 蓉 粗 萃 取 物
（0,6.5,13,18.5,26,130 μg/ml）刺激後，細胞增生的現象並無明 顯的增加（圖4.14B）。
在造骨的過程之中，成骨細胞必須經由礦化的過程，才能 夠使得骨頭硬化，在給予 MC3T3-E1 細胞株不同濃度的肉蓯蓉 粗 萃 取 物 （0, 6.5, 13, 18.5, 26, 130 μg/ml ） 與 分 化 劑 (β-glycophosphate 10 mM 及 Vitamin C 50μg/ml)之後，利用 Alizarin red stain 進行分析，同時並測量 ALP 活性。由實驗結果 發現，ALP 活性隨著肉蓯蓉粗萃取物濃度的增加有增強的趨勢 MAPKs(mitogen-activated protein kinase) 包 含 了 extracellular signal-related kinase（ERK）、c-Jun N-terminal kinase
（JNK）和 p38 三個成員 54。之前的研究顯示，活化 MAPK pathway 會刺激成骨細胞的 osteocalcin mRNA 表現55，p38 在成 骨細胞的分化裡扮演了重要的角色56，此外 ERK、JNK 也在成
骨細胞分化中扮演重要角色57,58。我們以Western blot 進行分析 發現，再給予肉蓯蓉粗萃取物刺激之後，發現p-ERK（圖 4.16A）
與p-JNK（圖 4.17A）在十五分鐘， p-p38（圖 4.18A）在十分 鐘左右開始有增強的現象出現，而ERK、JNK 與 p38 在各時間 點均無增強的現象，表示成骨細胞在受到肉蓯蓉萃取物的刺激 之後，細胞內的ERK、JNK 與 p38 的磷酸化會增加。
此外我們以 qPCR 進行分析，當我們分別給予三種 MAP kinase 的抑制劑 U0126（圖 4.16B）、SP600125（圖 4.17B）、
SB203580（圖 4.18B）三十分鐘之後，再以肉蓯蓉粗萃取物刺 激，可以發現不管是 ALP、BMP-2 與 OPN 基因的表現量都有 大幅降低的現象，此外若轉染 DN-ERK（圖 4.16C）、DN-JNK
（圖4.17C）與 DN-p38（圖 4.18C）之後，也可發現 ALP、BMP-2 與 OPN 基因的表現量也有明顯被減少，且達到顯著性差異（p
＜0.05）。
(五) Akt 參與肉蓯蓉粗萃取物的訊息傳導路徑中
有研究顯示，Akt 參與了成骨細胞的分化與骨頭的形成 59。 我們以Western blot 進行分析發現，再給予肉蓯蓉粗萃取物刺激 之後，p-Akt 在三十分鐘左右有增強的現象，而β-actin 無明顯 的變化（圖4.19A），表示成骨細胞在受到肉蓯蓉粗萃取物的刺 激之後，細胞內的Akt 磷酸化會增加。
接著我們使用 qPCR 進行分析。當我們給予 Akt inhibitor 三十分鐘後，再以肉蓯蓉粗萃取物刺激，可以發現不管是ALP、
在哺乳類動物裡，NF-κB 由 RelA (p65)，p50，p52，RelB 與c-Rel 等五個成員所組成60,61。Western blot 顯示，MC3T3-E1 細胞株經過肉蓯蓉粗萃取物的刺激之後， p-p65 在十分鐘左右
開始有增強的趨勢（圖4.20A），顯示了肉蓯蓉粗萃取物活化了
SP600125、SB203580、PDTC 以及 TPCK，最後觀察到礦化的 現象皆有明顯的被抑制（圖 4.21A），且於量化後可發現（圖 4.21B），抑制的情況皆達到顯著性差異（p＜0.05）。此外我們測 試了 ALP activity，當加入抑制劑之後的 MC3T3-E1 細胞株，其 ALP activity 都有明顯的減少（圖 4.21C），且達到顯著性差異（p
＜0.05）。
(八) 肉蓯蓉粗萃取物刺激使成骨細胞 NF-κB 活性增加
當細胞受到刺激之後，會活化許多蛋白，最後影響到 NF-κB，
使得 p65 轉位進入細胞核之後，增加 ALP、BMP-2 與 OPN 基 因的表現，進而強化造骨功能。
我們將MC3T3-E1 成骨細胞株轉染 NF-κB luciferase vector 當作NF-κB 活化的指標。我們發現經過肉蓯蓉粗萃取物刺激的 細胞在二十四小之後，NF-κB luciferase 活性有增強的趨勢。此 外若同時再給予Akt-inhibitor、U0126、SB203580、SP600125、
PDTC 與 TPCK 等抑制劑之後，此一活化現象即被減低（圖 22A），
且達到顯著性差異（p＜0.05）。此外我們將細胞轉染 DN-Akt、
DN-JNK、DN-ERK 與 p38 之後，給予肉蓯蓉粗萃取物刺激，亦 發現 NF-κB luciferase 活性也有減少的現象（圖 22B），且達到 顯著性差異（p＜0.05）。
圖4.1 女貞子粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.2 肉蓯蓉粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.3 骨碎補粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.4 山藥粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.5 淫羊藿粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.6 杜仲粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.7 補骨脂粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.8 菟絲子粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.9 山茱萸粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.10 續斷粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.11 巴戟天粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.12 熟地黃粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖 4.13 不同濃度下肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞活性指標之影響 肉蓯蓉粗萃取物刺激成骨細胞後，以 qPCR 測量得 ALP、BMP-2 與 OPN 之變化(＊p＜0.05, compared with control)
圖 4.14 肉 蓯 蓉 粗 萃 取 物 不 影 響 成 骨 細 胞 增 生 或 移 行 能 力 (A)Migration assay 測量不同濃度之肉蓯蓉粗萃取物刺激下成骨細胞 的移行能力(B)MTT assay 測量不同濃度之肉蓯蓉粗萃取物刺激下成 骨細胞的增生率(C)(D)Wound healing assay 測量不同濃度之肉蓯蓉粗 萃取物刺激下，在不同時間點觀察成骨細胞的移行能力，並量化之。
圖 4.15 肉蓯蓉粗萃取物增強成骨細胞礦化能力(A)不同濃度肉蓯蓉粗 萃取物刺激成骨細胞所影響之ALP 活性(B)成骨細胞在不同濃度之肉 蓯蓉粗萃取物刺激下的礦化反應。(＊p＜0.05, compared with control)
圖4.16 肉蓯蓉粗萃取物透過 ERK 影響細胞活性 (A) Western blot 檢視 不同時間點，肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞 p-ERK 與 ERK 之影響(B) 以 qPCR 測量加入 ERK 抑制劑 U0126 之後，ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量變化 (C)以 qPCR 測量將成骨細胞轉染 DN-ERK 之後，
ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量變化(＊p＜0.05, compared with control；
＃p＜0.05, compared with treatment)
圖4.17 肉蓯蓉粗萃取物透過 JNK 影響細胞活性 (A) Western blot 檢 視不同時間點，肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞p-JNK 與 JNK 之影響(B) 以qPCR 測量加入 JNK 抑制劑 SP600125 之後，ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量變化 (C) 以 qPCR 測量將成骨細胞轉染 DN-JNK 之後，
ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量變化(＊p＜0.05, compared with control；
＃p＜0.05, compared with treatment)
圖4.18 肉蓯蓉粗萃取物透過 p38 影響細胞活性 (A) Western blot 檢視 不同時間點，肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞 p-p38 與 p38 之影響(B)以 qPCR 測量加入 p38 抑制劑 SB203580 之後，ALP、BMP-2 與 OPN 基 因表現量變化 (C)以 qPCR 測量將成骨細胞轉染 DN-p38 之後，ALP、
BMP-2 與 OPN 基因表現量變化(＊p＜0.05, compared with control；＃p
＜0.05, compared with treatment)
圖4.19 肉蓯蓉粗萃取物透過 Akt 影響細胞活性 (A) Western blot 檢視 不同時間點，肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞 p-Akt 與 Akt 之影響(B)以 qPCR 測量加入 AKT 抑制劑之後，ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量 變化 (C)以 qPCR 測量將成骨細胞轉染 DN-Akt 之後，ALP、BMP-2 與OPN 基因表現量變化(＊p＜0.05, compared with control；＃p＜0.05, compared with treatment)
圖 4.20 NF-κB 家族之 p65 參與肉蓯蓉粗萃取物之活化路徑 (A) Western blot 檢視不同時間點，肉蓯蓉粗萃取物對成骨細胞 p-p65 與 p65 之影響(B)以 qPCR 測量加入 NF-κB 抑制劑 PDTC 與 TPCK 之後，
ALP、BMP-2 與 OPN 基因表現量變化(＊p＜0.05, compared with control；
＃p＜0.05, compared with treatment)
圖4.21 抑制劑對成骨細胞礦化與 ALP 活性之影響 (A)( B) 以肉蓯蓉 粗萃取物刺激成骨細胞並加入抑制劑之後，成骨細胞礦化反應(C) 以 肉蓯蓉粗萃取物刺激成骨細胞並加入抑制劑之後，成骨細胞 ALP activity 反應 (＊p＜0.05, compared with control；＃p＜0.05, compared with treatment)
圖 4.22 轉錄因子 NF-κB 參與成骨細胞活化路徑 (A) 以 NF-κB luciferase assay 測量成骨細胞經肉蓯蓉粗萃取物刺激並加入抑制劑之 後，成骨細胞之反應 (B) 以 NF-κB luciferase assay 測量成骨細胞經肉 蓯蓉粗萃取物刺激之後，轉染隱性變異質體，成骨細胞之反應。(＊p
＜0.05, compared with control；＃p＜0.05, compared with treatment)