化學名稱 縮寫 購買廠商
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimmide EDC Sigma-Aldrich 10% neutral buffered formalin Sigma-Aldrich
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MTT Sigma-Aldrich CellTiter 96® aueous MTS reagent power Promega D-galactosamine hydrochloride D-GalN Acros
Fetal bovine serum FBS Biological Industries
Folic acid Sigma
Iron(II) chloride tetrahydrate 98% Alfa Aesar Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich
L-glutamine Biological Industries
N-hydroxysuccinimide NHS Aldrich
Nuclear fast red counterstain Sigma-Aldrich
Penicillin Biological Industries
Phenazine methosulfate PMS AppliChem
Phosphate buffered saline 10x PBS 10x Biological Industries
Potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6] · 3H2O) Sigma-Aldrich
Sodium alginate Alg Aldrich
Sodium bicarbonate solution Biological Industries
Tripsin-EDTA 10x Biological Industries
41
4-2 實驗儀器
儀器名稱 簡稱 廠牌 提供單位
Fourier-Transform Infrared
Spectrometer FTIR Perkin Elmer/
Spectrum 100
台大化工
儀器分析實驗室 Handheld Automated Cell Counter Millpore/
ScepterTM
台大化工 吳嘉文實驗室
High-frequency Heating System 台大醫工
林峰輝實驗室 High Speed Centrifuges SIGMA/
3-30KS
台大化工 吳嘉文實驗室 Inductively Coupled Plasma Mass
Spectrometer ICP-MS Agilent 7700x 台大生農學院 共同儀器中心
Microscope Nikon/
Eclipse-80i
台大化工 吳嘉文實驗室 Superconducting QUantum
Interference Device Magnetometer SQUID Quantum Design/
MPMS7
台大
貴重儀器中心 Thermogravimetric Analysis TGA Perkin Elmer/
Pyris 1
台大化工
儀器分析實驗室 Ultrasonic Liquid Processors Sonicator Qsonic/
Q700
台大化工 吳嘉文實驗室 X-Ray Diffractometer XRD X'PERT 台大化工
儀器分析實驗室
Zetasizer Nano-ZS Malvern 台大化工
粉粒體實驗室
42
4-3 材料製備
4-3-1 實驗總流程
-圖4-1 實驗流程
43
4-3-2 Fe3O4@Alg 製備
取10 mg 海藻酸鈉(Sodium alginate)溶於 55 mL 去離子水中，以磁石劇烈攪 拌至海藻酸鈉完全溶解。接著分別將四個結晶水的二氯化鐵(氯化亞鐵) 0.097625 g 和六個結晶水的三氯化鐵 0.168625 g 溶於 10 mL 的去離子水中。用針筒式幫浦 (Syringe pump)以每小時 30 mL 的速度，將 10 mL 的二氯化鐵水溶液打入含有海 藻酸的水溶液中，接著攪拌 1 小時。接著同樣利用針筒式幫浦以每小時 30 mL 的速度打入10 mL 的三氯化鐵水溶液，攪拌 1 小時。最後以 1.5 N 的氨水溶液將 pH 值調整到 10，攪拌 30 分鐘後取下，步驟如圖 4-2。取出磁石後，可用強力磁 鐵將固體產物與液體分離，收集固體產物並以去離子水清洗，此清洗步驟執行2 次。接著再利用去離子水清洗1 次，這次利用高速離心機分離，最後藉著超音波 粉碎機將材料分散在去離子水中。
圖4-2 結合預凝膠法與共沈澱法
4-3-3 Fe3O4@Alg 接上 Folic Acid
以PBS 緩衝溶液(pH 5-6)將 Fe3O4@Alg 水溶液稀釋成 1.25 mg/mL，取 8 mL 並放入磁石攪拌。用PBS 緩衝溶液(pH 5-6) 1 mL 溶解 EDC (M=191.7) 49.842 mg 並搖勻，同樣用PBS 緩衝溶液(pH 5-6) 1 mL 溶解 NHS (M=115.09) 74.8085 mg 並搖勻，接著依序加入到Fe3O4@Alg 溶液中，攪拌 15 分鐘以活化海藻酸上的羧 酸基。(此時 EDC 濃度為 26 mM；NHS 濃度為 65 mM。)
用強力磁鐵吸住沉澱物與磁石，移去上清液，並用PBS 緩衝溶液(pH 7.5)清 洗一次，以清除未反應的反應物，最後加入PBS 緩衝溶液(pH 7.5) 5 mL。另用 5
44 衝溶液(pH=7.5)溶解 D-galactosamine hydrochloride 56.0638 mg，溶解後加入到已 將羧酸基活化的 Fe3O4@Alg 溶液中，攪拌四小時，形成 Fe3O4@Alg-(D-Gal)。
(D-galactosamine hydrochloride 最後濃度為 26 mM。)同樣以 4-3-3 的步驟用 PBS 緩衝溶液(pH > 9)將未反應的活化羧酸基還原，並以去離子水清洗三次，最後分 Malvern Nano-ZS 測量流體力學直徑及多分散性指數(The polydispersity index, PDI)，結果值都是採用強度分布的結果(The intensity distribution)。測量完後靜置 材料30 分鐘後，再量測一次，觀察材料聚集堆疊的情形。以及比較參數為 10 mg 海藻酸鈉、pH 10 的材料和無添加海藻酸鈉、pH 10 的材料在不同靜置時間(0、
60、120 分鐘)下的流體力學直徑和 PDI。
45
最後藉由 Malvern Nano-ZS 測量 Fe3O4、Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-FA、
Fe3O4@Alg-(D-Gal)在 25°C 的去離子水中的流體力學直徑、ζ 電位及 PDI。
4-4-2 電子顯微鏡(SEM)
將材料Fe3O4、Fe3O4@Alg 的水溶液稀釋至接近透明，滴於鍍有碳膜的銅網 上，銅網底部放上過濾紙吸取過多的液體，並用加熱台加熱50-60°C，以加速液 體揮發乾燥。最後用碳膠帶黏貼於載台上，並放入凍乾機乾燥。使用前，鍍上白 金(參數為 10 mA；2.5 min)。
4-4-3 傅立葉轉換紅外吸收光譜(FTIR)
將合成好的材料(Fe3O4、Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-FA、Fe3O4@Alg-(D-Gal)) 放到冷凍乾燥機中乾燥。取2 mg 乾燥的材料，加入烘乾的 KBr 粉末 0.2 g 並混 合均勻，利用壓片機壓製成薄片，放到機器中測量波長400 到 4500 nm 間的穿透 度。而原本就是粉末的folic acid 和 D-GalN，直接取 2 mg，並加入 KBr 0.2 g，
並製片測量。
4-4-4 熱重分析(TGA)
將合成好的材料(Fe3O4、Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-FA、Fe3O4@Alg-(D-Gal)) 放到冷凍乾燥機中乾燥。在材料槽中放入2-5 mg 材料，放入 Perkin Elmer Pyris1 儀器內，參數設定為在50°C 加熱 10 分鐘，之後以每分鐘 10°C 的升溫速率，從 50°C 上升到 800°C。測量時氮氣流速為每分鐘 20 mL。
Fe3O4@Alg 經過 EDC/NHS 反應後，可能會導致部分 alginate 流失，因此為 了較準確的計算標靶分子在材料內的含量，將Fe3O4@Alg 同樣經 EDC/NHS 反應，
但不加入標靶分子，只加 PBS 緩衝溶液。利用此測量到的值來計算標靶分子含 量。
46
4-4-7 材料藉由高週波(High-frequency)產生的磁場加熱水
將有磁性的材料用DI water 稀釋到 0.5 mg/mL，吸取 1 mL 放到體積為 1.5 mL 10% FBS，以下皆同)，抑制 Trypsin 的反應。離心去除上清液後，加入新的培養 液至細胞濃度為1x105個細胞/mL。取 96 孔盤將四周孔洞加入 200 μL 的 PBS 緩 衝溶液，中間的每孔加入 200 μL 細胞溶液(1x105個細胞/mL)，培養一天，使其 貼附在孔盤表面約 7 分滿。隔日加入材料前，將培養液移除並用 PBS 緩衝溶液 清洗 3 次，接著加入 100μL 的新培養液，再加入目標濃度兩倍濃度的材料水溶 液100 μL (如測試的材料濃度為 20 μg/mL，則配置 40 μg/mL 水溶液)，每個濃度
47 脫氫酶(Succinate dehydrogenase, SDH)會將 MTT 還原成不溶於水的藍紫色結晶 formazan。Formanzan 的生成量會與粒線體活性有關，因此可用來推算活細胞的 數量。利用DMSO (Dimethyl sulfoxide)將 formazan 溶解，就能在 570 nm 測到吸 光值，而推算細胞的存活情形。 衝液後，每格加入1 mL 的 10% neutral buffered formalin，放置隔夜(約 12 小時)。
移去10% neutral buffered formalin，每孔再加入 1 mL 普魯士藍染色法(Prussian blue staining)染劑，在室溫下等待 20 分鐘後，移去液體並用去離子水清洗 3 次。
移除去離子水後，每格加入500 μL 的 nuclear fast red counterstain，在室溫下等待 5 分鐘，接著用去離子水清洗 1 次。最後在玻片上加 1 滴去離子水並封片，利用
48 鐘。其中一孔加入800 μL 培養液並使細胞均勻分散，接著用 Handheld Automated Cell Counter 測量細胞濃度。其餘孔洞加入 400 μL 濃鹽酸(12 M)，靜置 2 小時，
49 小時。放到microplate reader 中測量 450 nm 波長下的讀值。周圍無培養細胞的孔 洞一樣加入培養液及 MTS 工作溶液，其讀值則為背景值。(MTS 的使用參考至 Promega 的 CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin)
MTS 與 MTT 是類似的試劑，其能在活細胞內被 dehydrogenase enzymes 轉 換成formazan。不同之處在於利用 MTS 生成的 formazan 是可直接溶解在培養液 中，因此少了吸去培養液，加入DMSO 溶解的步驟。所以 MTS 在使用上誤差較 少，且較安全，但是價格昂貴。形成的formazan 量能藉由測量 490 nm 處的吸光 值得知，吸光值會正比於活細胞的數量，本實驗用450 nm 波長測量，此波長仍 在使用手冊認可的範圍內。
50
4-5-5 測量材料在血漿中的Plasma Clotting Time
材料的抗凝血活性可藉由材料在人類血漿中的clotting time 來評估。方法為 在 96 孔盤中混合 160 μL 的 100% platelet-poor plasma (PPP)和材料溶液(0.5 mg/mL，46 μL)。在 37°C 下，加入 1M 的 CaCl2 4 μL 後搖晃 30 秒。在定溫下，
利用PowerWave microplate spectrophotometer 讀取 660 nm 處的光譜，當凝血發生 時會測到光譜的改變，即為血漿的clotting time。此實驗委託中原大學薄膜中心 張雍教授實驗室量測。
4-5-6 紅血球的溶血試驗(Hemolytic test)
利用血液離心機將紅血球分離出來，接著利用0.15 M saline 溶液清洗三次。
利用PBS 將紅血球配成每 500 μL 有 108個紅血球，接著一樣用PBS 將材料配成 濃度20 mg/mL 的溶液，混合 500 μL 的材料溶液與 500 μL 的紅血球溶液。混合 液在37°C 的水域下培養 60 分鐘，接著在 2000 rpm 下離心 5 分鐘，將紅血球與 破裂的膜從溶液中分離。利用the PowerWave microplate spectrophotometer 測量上 清液在541 nm 的吸光值，可得知上清液中含有多少釋放出來的 hemoglobin (Hb) 量。藉由量測108個紅血球分散在DI water 中使其完全破裂，所量測的吸收值即 為造成100%溶血的值；而將紅血球分散在 PBS 中，所測到的吸收值即為不產生 溶血的值。此實驗委託中原大學薄膜中心張雍教授實驗室量測。
51
以推算SAR (Specific absorption rate)。第二部分則是細胞相關的實驗，選用的細 胞為人類肝癌細胞HepG2。首先，測量所有材料與 HepG2 培養 4 小時後的相對