結合共沈澱及預凝膠法合成氧化鐵/海藻膠奈米粒子 並用於肝癌細胞的標靶溫熱治療

國立臺灣大學工學院化學工程研究所 碩士論文

Graduate Institute of Chemical Engineering College of Engineering

National Taiwan University Master Thesis

結合共沈澱及預凝膠法合成氧化鐵/海藻膠奈米粒子 並用於肝癌細胞的標靶溫熱治療

Synthesis of Iron(II, III) Oxide/Alginate Nanoparticles through a Combined Pre-gel and Co-precipitation Method

for Targeted Liver Cancer Hyperthermia

廖士翔

Shih-Hsiang Liao

指導教授：吳嘉文 博士

Advisor: Kevin Chia-Wen Wu, Ph.D.

中華民國 102 年 7 月 July, 2013

Synthesis of Iron(II, III) Oxide/Alginate Nanoparticles through a Combined Pre-gel and Co-precipitation Method

for Targeted Liver Hyperthermia

I

誌謝

本論文得以完成，首先感謝指導教授吳嘉文老師，在研究所這段期間的指導 讓我成長許多。讓我培養出做研究應該有的態度，激勵我對自己的研究有更深入 的瞭解。除此之外，也鼓勵我們多培養研究以外的技能與多閱讀課外讀物，讓生 活更精采。也感謝林嘉和教授、謝發坤教授、林峯輝教授、林義峰教授和山内悠 輔教授，在百忙之中抽空前來擔任口試委員，給予許多珍貴的意見，讓本研究更 趨於完整。另外感謝中原大學張雍教室實驗室，協助進行血液相容性的測試，更 加確認材料用於人體的安全性。以及感謝國科會提供研究經費。

感謝實驗室的黃厚升、連泓原、梁智澎、廖祐德、梁永和學長，在研究上傳 授豐富知識與寶貴經驗，並給予許多意見，讓我能更清楚該做什麼。感謝施柏安 同學在溫熱治療實驗上的建議與幫助，讓實驗能順利地進行。感謝同屆的江亞東、

李翊群、石瑋玉同學在一路上互相扶持與鼓勵。感謝王毓樸、張新彥、吳霈恩與 Connie Wu 能幫忙這篇論文進行校稿與英文校正，讓論文內容能更清楚地表達。

也感謝邱瑜婷、鄧有衡、陳靖天和陳偉寧平日幫忙處理實驗室的大小事務與在口 試當天協助口試順利進行。最後，感謝家人們的支持，讓我能專心於學業與研究。

廖士翔 謹致 民國102 年 8 月

II

Abstract

The purpose of this study is to synthesize well-dispersed and hydrophilic magnetic nanoparticles that can target HepG2 (Human hepatocellular carcinoma cell line).

Hyperthermia to kill cancer cells can be achieved by applying an AC magnetic field.

A combined pre-gel and co-precipitation method can adjust the hydrodynamic diameter of Fe3O4@Alg nanoparticles from 552 nm to 122 nm by varying the pH value and amount of sodium alginate. This method does not need a multi-step synthesis and synthesis in an aqueous solution is more suitable for in vivo usage.

Since alginates are rich in hydroxyl (−OH) and carboxylic acid (−COOH) groups, they can provide a highly negative surface charge and make the particle hydrophilic.

Alginate can stabilize the dispersion of Fe3O4 in water, and the carboxylic acid groups can be further modified with targeting molecules. Alginate coated magnetic nanoparticles further modified by EDC/NHS activated carboxylic acids will react with the primary amine groups of the targeting molecule (Folic acid and D-galactosamine) to become amino peptide bonds. The magnetic nanoparticles then become Fe3O4@Alg-FA and Fe3O4@Alg-(D-Gal), so these nanoparticles can target HepG2 cell.

Through a decrease in the zeta potential, as well as a disappearance and multiple shifts in the C−O stretching vibration peaks, we can confirm that alginate and targeting molecules are bonded on the material. Calculation of the wt% of each component can be done using the remaining wt% after heating to 800°C. With SQUID measurements, the materials almost have superparamagnetism properties, and the saturation magnetization is about 70 emu/g. The magnetic field generated by the high frequency (780 kHz; 99 kA/m) causes the targeting-functionalized materials (concentration 0.5 mg/mL) to heat water, and the specific absorption rate (SAR) was detected to be 308.4 W/gFe. Using ICP-MS, we found that the accumulation of Fe3O4

III

in HepG2 for Fe3O4@Alg-FA and Fe3O4@Alg-(D-Gal) are 15.4 and 19.7 times respectively more than that of Fe3O4@Alg. The materials generate heat in HepG2 through an applied magnetic field, leading to hyperthermia. The relative cell viabilities of the Fe3O4@Alg-FA and Fe3O4@Alg-(D-Gal) groups are 0.1 and 0.04, respectively, which is better compared to Fe3O4@Alg (0.61). This result confirms that targeting molecules help Fe3O4@Alg accumulate in cells effectively, resulting in an increased chance for the death of HepG2. Lastly, measurements of the plasma clotting time of the material and hemolytic tests confirmed that the material does not speed up blood clotting and trigger hemolysis, which means that it is safe to be utilized in vivo.

Key words: hyperthermia; folic acid; D-galactose; pre-gel; alginate; iron(II, III) oxide

IV

中文摘要

本研究的目的是合成親水性、分散性良好且能標靶人類肝癌細胞 HepG2 (Human hepatocellular carcinoma cell line)的磁性奈米粒子，並用外加交流磁場進 行 溫 熱 治 療 ， 以 達 到 殺 死 癌 細 胞 的 效 果 。 結 合 預 凝 膠(Pre-gel)與共沉澱法 (Co-precipitation) ， 能 藉 由 調 整 pH 值 與 海 藻 膠 量 合 成 出 流 體 力 學 直 徑 (Hydrodynamic diameter)為 122 nm 到 560 nm 的 Fe3O4@Alg 奈米複合材料，此合 成方法無需多步驟合成且皆在水溶液中反應，用於生物體內較為安全。由於海藻 膠上富含羥基(−OH)與羧酸基(−COOH)，提供材料表面高負電性與親水性，因此 材料合成好即可在水中長期穩定分散，且羧酸基能進一步修飾上標靶分子。海藻 膠包覆的磁性奈米粒子經由EDC/NHS 活化粒子表面的羧酸基，使其與標靶分子 (Folic acid 和 D-galactosamine)上的一級胺基產生胜肽鍵，使磁性奈米粒子成為擁 有folic acid 和 D-galactose 兩種標靶分子的 Fe3O4@Alg-FA 和 Fe3O4@Alg-(D-Gal)，

以標靶人類肝癌細胞HepG2。

藉由測量到表面電位的下降、羧酸基的 C-O 伸縮震動峰的消失與偏移和高 溫(800°C)處理後重量百分比的改變來確認材料中有海藻膠與標靶分子，並推算 各成分的重量百分比。經SQUID 測量材料磁性近似超順磁性(Superparamagnetism) 且飽和磁化強度皆約在70 emu/g。接有標靶分子的材料(濃度 0.5 mg/mL)經高週 波產生的磁場(780 kHz；99 kA/m)加熱純水，測得 specific absorption rate (SAR) 皆為308.4 W/gFe。利用ICP-MS 量測發現接上 folic acid 後材料在細胞中的 Fe3O4

累積量多了15.4 倍，而接上 D-Galactose 後多了 19.7 倍。材料藉由高週波產生的 磁場在細胞內加熱進行溫熱治療，Fe3O4@Alg-FA 和 Fe3O4@Alg-(D-Gal)分別能 使細胞的相對存活率降為0.1 和 0.04，比起 Fe3O4@Alg 的 0.61 有更好的療效，

證實接有標靶分子的Fe3O4@Alg 能有效的累積在細胞內，使溫熱治療殺死 HepG2 細胞的效果更好。最後測量材料的血漿凝血時間(Plasma clotting time)與進行溶血 試驗(Hemolytic test)，證實材料不易造成血液凝血和溶血，能安全用於生物體內。

關鍵字：溫熱治療、葉酸、半乳糖、預凝膠、海藻膠、四氧化三鐵。

V

目錄

誌謝... I 英文摘要... II 中文摘要... IV 目錄... V 圖目錄... IX 表目錄... XI 符號索引... XII

第一章 緒論... 1

第二章 文獻回顧 ... 3

2-1 癌症... 3

2-1-1 癌症... 3

2-1-2 癌症的傳統療法... 4

2-1-3 其他療法... 5

2-2 溫熱治療(Hyperthermia) ... 6

2-2-1 溫熱治療的起源... 6

2-2-2 溫度與加熱時間對癌細胞存活率的影響... 6

2-2-3 腫瘤組織的低pH 值提高癌細胞對溫度的敏感性 ... 8

2-2-4 熱休克蛋白引起抗腫瘤免疫反應... 10

2-2-5 腫瘤組織的散熱能力差... 11

2-2-6 溫熱治療的分類... 13

2-2-7 磁性奈米粒子用於溫熱治療的加熱方式... 13

2-3 標靶療法 ... 14

2-3-1 被動標靶... 15

2-3-2 主動式標靶... 15

VI

2-4 磁性原理 ... 18

2-4-1 磁化率與介磁常數... 18

2-4-2 磁性物質的種類... 19

2-4-3 磁滯現象(Magnetic hysteresis) ... 22

2-5 磁性奈米粒子的合成方式 ... 23

2-5-1 氧化鐵奈米粒子的合成... 23

2-5-2 高分子與超順磁氧化鐵的混成奈米材料... 25

2-6 奈米粒子用於生物系統 ... 28

2-6-1 奈米粒子進入人體的方式... 28

2-6-2 材料的選擇... 28

2-6-3 粒徑的限制... 29

2-6-4 氧化鐵奈米粒子進入人體... 29

2-7 海藻膠 ... 30

2-7-1 海藻膠的簡介... 30

2-7-2 預凝膠(Pre-gel)法 ... 31

2-8 表面改質(Surface modification) ... 34

2-8-1 常見的表面改質方法... 34

2-8-2 EDC/NHS ... 36

第三章 研究動機與目的 ... 38

第四章 實驗方法 ... 40

4-1 實驗藥品 ... 40

4-2 實驗儀器 ... 41

4-3 材料製備 ... 42

4-3-1 實驗總流程... 42

4-3-2 Fe3O4@Alg 製備 ... 43

4-3-3 Fe3O4@Alg 接上 Folic Acid ... 43

VII

4-3-4 Fe3O4@Alg 接上 Galactose 殘基 ... 44

4-4 材料性質分析 ... 44

4-4-1 粒徑、電位分析儀... 44

4-4-3 傅立葉轉換紅外吸收光譜(FTIR) ... 45

4-4-4 熱重分析(TGA) ... 45

4-4-5 X 光繞射儀(XRD) ... 46

4-4-6 超導量子干涉磁量儀(SQUID) ... 46

4-4-7 材料藉由高週波(High-frequency)產生的磁場加熱水 ... 46

4-5 細胞實驗 ... 46

4-5-1 生物相容性測試... 46

4-5-2 顯微鏡實驗... 47

4-5-3 感應耦合電漿質譜分析儀(ICP-MS)... 48

4-5-4 磁性溫熱治療實驗... 48

4-5-5 測量材料在血漿中的Plasma Clotting Time ... 50

4-5-6 紅血球的溶血試驗(Hemolytic test) ... 50

第五章 結果與討論 ... 51

5-1 材料性質 ... 51

5-1-1 材料合成... 52

5-1-2 材料中海藻膠及標靶分子的確認及含量... 56

5-1-3 材料磁力特性與加熱效果... 63

5-2 細胞實驗 ... 65

5-2-1 生物相容性測試... 65

5-2-2 顯微鏡觀察... 66

5-2-3 ICP-MS 測量細胞內含鐵量 ... 68

5-2-4 高週波產生磁場加熱材料進行溫熱治療... 68

5-2-5 材料在人類血漿中的抗凝血活性... 70

VIII

5-2-6 材料的紅血球溶血試驗... 71

第六章 結論... 72

第七章 未來展望 ... 73

第八章 參考文獻 ... 74

IX

圖目錄

圖2-1 中國倉鼠卵巢細胞在不同溫度和時間下的細胞存活情形 ... 7

圖2-2 中國倉鼠卵巢細胞在不同的溫度與 pH 值下的細胞存活情形 ... 9

圖2-3 以 43.5°C 處理 30 分鐘後，SCK 腫瘤與鼠腿部肌肉 pH 值的改變 ... 9

圖2-4 藉由溫熱治療導致抗腫瘤免疫反應的機制 ... 11

圖2-5 不同溫度下動物腫瘤與老鼠的皮膚和肌肉中的相對血液流量 ... 12

圖2-6 正常組織與腫瘤組織在高溫熱處理後的差別 ... 12

圖2-7 磁性粒子的尼爾與布朗鬆弛運動 ... 14

圖2-8 葉酸的分子結構 ... 16

圖2-9 鐵磁性物質的磁化向量大小與溫度關係 ... 20

圖2-10 定溫下，物磁磁性隨外磁場變化產生的磁滯現象 ... 22

圖2-11 海藻酸中不同單體(G 酸與 M 酸)之排列情況 ... 32

圖2-12 二價金屬與海藻酸中的 G 酸螯合 ... 33

圖2-13 (a)高 G 酸含量之海藻酸與金屬螯合形成高密度蛋盒結構 (b) 低 G 酸含 量之海藻酸與金屬螯合形成低密度蛋盒結構... 33

圖3-1 研究討論到的範圍 ... 39

圖4-1 實驗流程 ... 42

圖4-2 結合預凝膠法與共沈澱法 ... 43

圖5-1 測量不同的 alginate 量及 pH 值對於 Fe3O4＠Alg 的影響 ... 53

圖5-2 海藻酸量和 pH 值對 Fe3O4＠Alg 的粒徑影響示意圖 ... 54

圖5-3 (a) Fe3O4的SEM 圖 (b) Fe3O4＠Alg 的 SEM 圖 ... 54

圖5-4 Alginate、Fe3O4及Fe3O4@Alg 的 XRD 圖譜 ... 56

圖5-5 Alginate、Fe3O4和Fe3O4@Alg 的 FTIR 穿透度圖譜 ... 58

圖5-6 Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-FA 和 Folic acid 的 FTIR 穿透度圖譜 ... 58

X

圖5-7 Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-(D-Gal)和 D-GalN 的 FTIR 穿透度圖譜 ... 59

圖5-8 藉由 TGA 量測 Alginate、Fe3O4和Fe3O4@Alg ... 61

圖5-9 藉由 TGA 量測 Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-FA 和 Folic acid ... 61

圖5-10 藉由 TGA 量測 Fe3O4@Alg、Fe3O4@Alg-(D-Gal)和 D-GalN ... 62

圖5-11 所有材料的磁滯曲線 ... 63

圖5-12 高週波下，各材料的溫度隨時間的變化 ... 65

圖5-13 以 MTT 法測量所有材料的生物相容性 ... 66

圖5-14 在顯微鏡下觀察材料在細胞當中的情形 ... 67

圖5-15 利用高週波產生磁場進行溫熱治療的效果 ... 69

圖5-16 材料的 plasma clotting time... 70

圖5-17 材料的紅血球溶血試驗 ... 71

XI

表目錄

表2-1 癌細胞的特異生長模式 ... 3

表2-2 各種的 SIONP 表面改質方法 ... 35

表5-1 測量不同的 alginate 量及 pH 值對於 Fe3O4＠Alg 的影響 ... 53

表5-2 有無加入海藻酸鈉對於粒徑及分散性的影響 ... 55

表5-3 合成粒子藉由 Zetasizer 測量值的總整理... 55

表5-4 材料的 FTIR 圖譜... 59

表5-5 所有材料經過高溫(800°C)後，剩下的重量百分比 ... 62

表5-6 藉 TGA 數據計算出材料中各成分的重量百分比 ... 62

表5-7 各材料的飽和磁化強度 ... 64

表5-8 各材料的 SAR ... 65

表5-9 ICP-MS 測量各材料在細胞中鐵的含量 ... 68

XII

符號索引

符號 符號名稱、說明

μ 磁偶矩 μL 軌道磁偶矩 μS 自旋磁偶矩

B 磁感應強度(Magnetic induction intensity)、磁通量密度、磁場

M 單位體積的磁偶矩，可稱為磁化強度

H 磁場強度(Magnetic field intensity) μ 有磁性物質時的磁導率

m 磁化率(Magnetic susceptibility)

κm 介磁常數(Magnetic substance constant)，或稱為相對磁導率

1

第一章 緒論

根據行政院衛生署統計，民國100 年國人因癌症死亡的人數高達 42,559 人，

佔總死亡人數的28%。相較於 10 年前，死亡人數增加將近 1 萬人。其中肝癌為 全世界最好發的癌症之一，肝癌病患從出現症狀到死亡只有3 到 6 個月的時間。

手術切除是主要的治療方式，但由肝臟血液循環豐富，手術過程中要避免因腫瘤 破裂造成的癌細胞散佈，且會受到腫瘤所在位置、腫瘤的數量及大小、肝功能是 否正常等因素限制，能進行手術切除的病患只有一至兩成，且即使經過治療，仍 有很高的機率復發，需輔佐全身性化學藥物治療以降低復發機率[1]。

其他常見的治療方式有經動脈化療栓塞法(TACE) 、微波治療(Microwave ablation)、無線電頻率燒灼(Radiofrequency ablation)、高能超音波(High-intensity focused ultrasound)等[2-4]，這些療法都有共同的缺點是對癌細胞、腫瘤無專一性，

治療後容易有癌細胞殘留，且會受到腫瘤所在位置的限制，使治療效果不佳。多 數的療法不只會傷害癌細胞，也會使正常細胞受到損害。而目前有的標靶治療藥 物，如Nexavar (蕾莎瓦)，不但費用昂貴且效果會因人而異，因此突顯尋找其他 有效治療方式的重要。

溫熱治療(Hyperthermia)有無需開刀、副作用較少、可重複治療等的優點，

利用磁性奈米粒子當做加熱媒介更是目前積極研究的項目。溫熱治療之所以有效 是利用癌細胞比正常細胞對熱更敏感，一般用高於 42.5°C 的溫度進行治療，在 適當的溫度與加熱時間下，可殺死癌細胞又不會對正常細胞造成不可逆的破壞 [5]。且腫瘤組織比起正常組織更容易累積熱量，原因是腫瘤組織的血管功能不 良，導致溫度上升時，無法有效的擴張血管，增加血液流量來帶走熱量[6]。另 外，有研究顯示較低的pH 值，會使癌細胞對熱更敏感[7]，而腫瘤比起正常組織 會更快的消耗養份，代謝出廢物、提高血液中二氧化碳的含量，使血液中pH 值 比起一般值低了 0.2 到 0.4[8]，高溫更會加強這個過程，而產生更低的 pH 值，

使癌細胞更容易因熱而死亡。另外，細胞經溫熱治療後，會產生熱休克蛋白因而 增加細胞表面的主要組織相容性複合體(Major histocompatibility complex, MHC)

2

class I antigens，提高癌細胞被細胞毒性 T 淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL) 辨認的機會[9]，因此溫熱治療對癌治療是一種非常有效又安全的方式。目前溫 熱治療的研究著重在利用超順磁性奈米粒子當做加熱媒介，配合外加磁場使粒子 產生尼爾鬆弛(Neel relaxation)和布朗鬆弛(Bronian relaxation)而產生熱能[10]。利 用奈米粒子的優點在於可以經由血液深入組織深處的腫瘤部位且較不易被巨噬 細胞(Macrophage)吞噬，藉由腫瘤 EPR effect (The enhanced permeability and retention effect)，促使磁性奈米粒子較容易累積在腫瘤部位。但只依賴 EPR 產生 的被動標靶效果有限，因此需賦予磁性奈米粒子主動標靶的能力，提高磁性粒子 在腫瘤的累積量，以提昇加熱的效率。

本研究所用的磁性奈米粒子是近似超順磁性的Fe3O4，其在無外加磁場時無 磁性，因此不會因為磁力而聚集。外部藉由海藻膠(Alginate)包覆，利用海藻膠 上的羥基(−OH)與羧酸基(−COOH)使表面產生高負電性與水分散性，而產生粒徑 一致、親水性且分散良好的磁性奈米粒子，且羧酸基能提供進一步的修飾。海藻 膠是天然的高分子，由β-D-甘露醛酸(β-D-mannuronat，簡稱 M 酸)和α-L-古羅 糖醛酸(α-L-guluronate，簡稱 G 酸) 兩種單糖醛酸隨機組成直鏈狀，擁有高生物 相容性與生物可分解性。當兩個以上的 G 酸排列在一起時，會與二價或多價的 金屬離子(Mg²⁺除外)螯合形成穩定的蛋盒(Egg-box)結構。因此本研究利用海藻酸 包覆鐵離子成預凝膠狀態，此時高分子還未聚合成大分子的凝膠，而是均勻的包 覆鐵離子，再加入氨水而產生共沉澱出Fe3O4。這種預凝膠與共沈澱搭配的合成 法比起利用其他高分子包覆Fe3O4有能藉由控制海藻酸鈉量與pH 值調整粒徑、

無需多步驟合成以及皆在水溶液中反應的優點，用於生物體內也較安全。合成出 的磁性奈米粒子擁有高負電性、親水性、良好的分散性以及提供羧酸基供修飾。

接 著 利 用 EDC/NHS 使 海 藻 膠 上 的 羧 酸 基 與 標 靶 分 子 (Folic acid 和 D-galactosamine)上的一級胺基反應產生胜肽鍵，使磁性奈米粒子成為擁有 folic acid 和 D-galactose 的 Fe3O4@Alg-FA 和 Fe3O4@Alg-(D-Gal)，以標靶人類肝癌細 胞HepG2，提高磁性奈米粒子在癌細胞內的累積量，以提升溫熱治療的效果。

3

第二章 文獻回顧 2-1 癌症[11]

2-1-1 癌症

癌細胞與正常細胞不同之處在於其特異的生長模式，包括：增生、化生、異 生、回變及轉移，簡介整理在表2-1。其中增生、化生、異生和回變都可在身體 某些細胞中發現同樣功能，癌細胞與正常細胞最大的差異是在轉移，也就是癌細 胞能脫離原發部位，透過血管或淋巴管轉移到較遠的器官或組織，然後在該處發 展成為轉移性癌瘤。癌細胞本身不會直接使病患死亡，大部分的癌細胞並沒有毒 素，而是不斷的搶奪正常細胞的養分而快速增生，病患最後因營養不良導致虛弱，

最後因感染而死亡；或是因為癌細胞的增生，導致腫瘤不斷變大，而壓迫其他正 常器官、組織。

表2-1 癌細胞的特異生長模式[11]

增生 癌細胞的細胞分裂不受控制，細胞的數目無限制增加。但正常細胞也會 有增生的行為，如胚胎、皮膚細胞等，所以非癌細胞生成的必要條件。

化生 特定器官或器官構造內的細胞被另一種類型的細胞所代替的可逆過程。

異生 成熟細胞的大小、形狀及組合關係改變，也就是細胞失去正常有規則的 排列。異生也可能發生在正常細胞，如長期發炎的細胞，但是是可逆的。

回變 細胞缺乏分化，也就是缺乏或減少一般成熟細胞的生理功能，但也非絕 對特徵。

轉移 癌細胞能脫離原發部位透過血管或淋巴管轉移到較遠的器官或組織，然 後在該處發展成為轉移性癌瘤。惡性腫瘤與良性腫瘤最大的差別就是在 惡性腫瘤會轉移，而良性不會。

癌症的形成需經長時間刺激，同時需要多種因素，是一種緩慢的過程。

Mottram[12]與 Rous[13]等人率先提出了起始(initiate)與促進(promote)這兩個名詞。

起始期是發生在直接接觸或施用致癌物，一旦細胞被起始劑起始化後，即使經過

4

長時間也不會失去致癌的能力，使細胞產生不可逆的變化。而在促進期需長期接 觸促進劑(promoting agent)才可能致癌，是一種可逆反應。起始劑能夠直接不可 逆地改變細胞遺傳物質的原始分子構造；而促進劑不會與遺傳物質接觸，但卻會 影響遺傳物質的表達[14]。

癌症與生活環境息息相關，長期抽煙易導致肺癌、吃檳榔易得口腔癌、柏油 工人易得皮膚癌等。隨著文明進步，各種的食品添加物、化學香料等也越來越多，

許多物質都潛藏著致癌的危險，即便現代人越來越重視飲食安全，還是有可能遇 到黑心商人違法添加化學物質，如2013 年的違法添加順丁烯二酸酐的毒澱粉事 件和添加工業用的EDTA-Na2到食品中等。或著像是，西元2011 年發生的日本 福島第一核電廠事故，導致的各種食物、水源遭受輻射污染。此外，處於高壓力 的生活環境下，導致免疫力下降或飲食習慣、休眠時間不正常等，也會導致人體 受到的損害無法自癒而得病。這些致癌因子當中，有些可避免，也有一些難以避 免，因此顯得找到良好治療方式的重要性。

癌症的種類多達百種，每種癌症的發生原因與治療方式都不盡相同，只能盡 量減少可能致癌的因子。所幸現在癌症只要能在早期發現，大多數的癌症都能治 癒，但往往出現明顯症狀時，已經相當嚴重。特別是當癌症轉移之後，更難以根 治。

2-1-2 癌症的傳統療法

癌症常用的治療有三種：外科手術、放射線治療、化學藥物治療。放射線治 療與外科手術只能用在局部腫瘤的清除，如果癌細胞已轉移，就只能靠化學藥物 治療，通常會混合兩至三種療法，以確保能達到最佳的治療效果。

I 手術治療

手術是一種簡單且有效的清除腫瘤的方式，但僅限於癌細胞未轉移時。外科 手術除了能治療癌症外，也可用來防止癌症的發生，如：切除患有多發性息肉病 患的結腸，以防止結腸癌的發生。若發生癌細胞轉移，就需要搭配其他療法，如 常見的化學藥物療法等。

5

II 放射線治療

放射治療是利用高能波光束或粒子光束照射患部，一般用來自儀器發出的X 光或自然界的放射性同位素所發出的gamma rays，以干擾癌細胞無限制分裂和 增殖的能力，輻射治療比起手術治療有保留整個器官的功能等優點。放射治療所 用的是高劑量的放射線，所以在殺死癌細胞的同時，也會使正常的細胞受到影響，

若劑量使用不當，可能引發其他癌細胞的產生。當癌症發生在較深層的組織則放 射治療效果較差，且表面的正常組織可能受到較大的傷害，所用的劑量需以腫瘤 組織周圍的正常組織能忍受的輻射劑量來決定，因此限制療效。治療必須少量多 次的照射或對正常細胞塗抹保護劑、對癌細胞施以敏感劑，在盡量不傷害正常細 胞的狀況下治療。

III 藥物治療

外科手術與放射治療只適用於局部性的癌症，當癌細胞轉移後，頂多只能減 輕身體的不適，這時就需使用化學藥物治療。通常外科手術和放射性治療都會配 合化學藥物，以達到較好的治療效果，這就是所謂的補佐療法。化學藥物治療雖 然不怕癌細胞轉移，其可以到達全身各個部位，清除在各個器官內的癌細胞，但 很難把大塊的癌塊的所有癌細胞消滅。所以腫瘤的大小是化學藥物治療的限制之 一。化學藥物雖然可以對轉移的癌細胞造成傷害，但同時也會使正常細胞受到損 害，而產生不良的副作用，如：使白血球和淋巴細胞減少，抵抗力下降、紅血球 減少，產生貧血、血小板減少，使傷口不容易癒合和破壞毛囊等。另外還有一個 缺點，就是癌細胞同樣會有抗藥性，因為癌細胞與正常細胞一樣有選擇與突變的 能力，以適應外界環境的變化。

2-1-3 其他療法

常用的放射線、手術和化學藥物療法仍然存在許多問題，外科手術為了確保 將癌細胞完整去除，會同時切去部分正常細胞；放射線治療會受到正常細胞的限 制，因為正常細胞比癌細胞更容易接受放射線，必須在盡量不傷害正常細胞的狀 況下治療。當癌細胞轉移，就必須依靠化學藥物，但化學藥物通常也會傷害正常

6

細胞，導致諸多不良的副作用，且癌細胞會有抗藥性。近年來癌症治療有諸多突 破，像是免疫療法、干擾素、溫熱治療等，這些方法在治療癌症時，對正常細胞 的影響較小，提供了治療癌症的新選擇。

2-2 溫熱治療(Hyperthermia)

溫熱治療指得是利用各種能產生熱的方式，將組織溫度升高，而達到治療效 果。早期的治療方式是使全身溫度上升，但為了不傷害大腦等對熱較敏感的器官，

而無法將腫瘤組織的溫度提升到能有效殺死癌細胞的溫度，導致療效不佳。近期 是利用電磁波、微波、超音波或雷射等方式加熱特定區域，對正常組織的傷害較 小但仍然無法只加熱腫瘤部位，而不傷害正常組織。溫熱治療屬於物理治療，其 優點是設備簡單、操作容易、應用方便，且副作用也較少[15, 16]，可重複治療。

由於腫瘤與癌細胞對抗熱的能力比正常細胞差，因此只要適當的控制加熱溫度與 時間，就能殺死癌細胞又不會對正常細胞造成永久傷害。近年來用磁性奈米粒子 配合交流磁場來產生熱，使治療更能深入組織內部且不用開刀。

2-2-1 溫熱治療的起源[14]

高溫對於癌症的療效起源於癌症的病患發高燒而獲得症狀的減緩而來，在 Selawry 與其團隊[17]的觀察中發現，突然緩解(Spontaneous remission)的癌症病 患450 件中有 150 件同時併生瘧疾與傷寒等高燒病症。後來有 Coley[18, 19]用細 菌毒素誘致高燒以治療骨肉瘤，但無法確定是高體溫的效果還是細菌毒素所產生 的免疫反應的效果。高體溫以抑制或殺死癌細胞，在 Crile[20]於 1962 年的報告 得到較肯定的療效。許多研究也顯示溫熱治療也能與化學藥物治療或放射性治療 搭配而達到更好的療效[21]。

2-2-2 溫度與加熱時間對癌細胞存活率的影響

溫熱治療的治療時間與溫度是影響治療效果關鍵的因素，Dewey與其團隊[5]

利用中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells)探討溫度和時間對於細胞存 活率的影響(圖2-1)。結果發現能以42.5°C為一個分界點，溫度在41-42°C之間即

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使加熱長時間，細胞存活率只有少許下降，而在42.5°C時，細胞存活率在一開始 快速下降，但在5到6分鐘後，趨於平緩。但當溫度高於43°C後，細胞存活率快速 下降，且無平緩的趨勢。

圖2-1 中國倉鼠卵巢細胞在不同溫度和時間下的細胞存活情形[5]

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2-2-3 腫瘤組織的低pH值提高癌細胞對溫度的敏感性

腫瘤組織會促使葡萄糖的快速消耗與產生大量乳酸(Lactic acid)，並且提高血 液中二氧化碳的含量[22]。Burgess與其團隊[23]的研究指出腫瘤部位的乳酸含量 比一般高出2到3倍，而葡萄糖的消耗的速度快2到10倍。Gullino與其團隊[8]的研 究指出由於乳酸和二氧化碳在腫瘤部位較多，導致腫瘤間質液的pH值範圍為7.19 到6.95之間，比起一般血液的pH值低了0.2到0.4。而Gerwec與其團隊[7]研究中國 倉鼠卵巢細胞在不同的溫度與pH值下的細胞存活情形(圖2-2)，指出在溫度42°C 且pH為7.4下培養4小時，細胞存活率降至10%，若pH改為6.7，細胞存活率更僅 剩0.01%，說明了當pH值越低時，癌細胞對熱越敏感，且溫度越高細胞存活率下 降得越快。腫瘤部位因為癌細胞快速消耗葡萄糖而產生較多乳酸與二氧化碳，而 使pH值較正常細胞低，因此讓熱治療對癌細胞有更佳的療效。後來Rhee與其團 隊[24]的研究指出SCK腫瘤組織在43.5°C加熱30分鐘後，腫瘤內部的pH值下降到 6.71且能維持將近12小時；而老鼠的腿部肌肉細胞在43.5°C加熱30分鐘後，pH值 仍然維持7.42(圖2-3)。由此可知當溫度上升後，能加速腫瘤組織代謝反應，而代 謝物使環境pH值下降，使細胞對熱更敏感，這一連串的反應導致溫熱治療腫瘤 的效果更顯著。

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圖2-2 中國倉鼠卵巢細胞在不同的溫度與 pH 值下的細胞存活情形[7]

圖2-3 以 43.5°C 處理 30 分鐘後，SCK 腫瘤與鼠腿部肌肉 pH 值的改變[24]

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2-2-4 熱休克蛋白引起抗腫瘤免疫反應

熱 休 克 蛋 白(Heat shock protein, HSP) 是 一 種 分 子 監 護 子 (Molecular chaperone)，可以幫助蛋白質折疊，細胞遭受不自然的刺激時(高溫、重金屬、酒 精等)會使蛋白質的三級結構改變並影響細胞的新陳代謝。若細胞先遭遇到較溫 和的刺激，就能使熱休克蛋白表現而抵抗接下的不良環境，此時熱休克蛋白可以 幫助蛋白質重新折疊，而可以使細胞能較有效的抵抗這些刺激，維護細胞生理活 動的穩定[25]。溫熱治療後，癌細胞會出現熱休克蛋白而使得癌細胞產生耐熱的 特性，保護細胞免於熱導致的凋亡(Apoptosis)[26]。

近期研究發現，癌細胞受到溫熱治療後，會使熱休克蛋白HSP70大量表現，

增加內源性抗原的加工與呈遞，提高MHC class I將抗原呈獻在腫瘤細胞表面的數 量，因此腫瘤細胞更容易被细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，簡稱CTL) 辨認[27-29]，而產生抗腫瘤的免疫反應。Akira Ito與其團隊[9]將帶正電的磁性微 脂粒(Magnetite cationic liposome)打入兩側皆有腫瘤的老鼠(T-9 rat glioma model)，

其中一側進行溫熱治療。雖然只有一側有溫熱治療，但28天後兩側腫瘤皆消失，

經量測後發現兩側腫瘤都有NK (Natural killer)細胞、CD8-postive T細胞和 CD4-postive T細胞出現，其原因是因為溫熱治療導致出現抗腫瘤免疫反應。

經過一連串的研究，Akira Ito與其團隊提出圖2-4的機制[30]。首先，原本腫 瘤細胞只有較低濃度的細胞內HSP-peptide複合物，因此較少內源性抗原加工程 序發生，所以細胞表面只有很少的MHC class I-peptide複合物，不太會發生免疫 反應。當經溫熱治療產生亞致死壓力(Sublethal stress)造成細胞內HSP-peptide複合 物增加，而提高內源性抗原加工的發生，使細胞表面的MHC class I-peptide複合 物的數量增加，因此腫瘤細胞更容易被MHC class I-restricted CTLs所辨認。而被 CTLs或溫熱治療所殺死的腫瘤細胞，會釋放含有HSP-peptide複合物的細胞內物 質到環境中。釋放出來的HSP和(或)抗原性的peptides會活化鄰近的單核球 (Monocytes)使其產生前發炎性細胞激素(Proinflammatory cytokine)，而產生發炎 反應，促使免疫細胞在該處聚集。另外，也會進入到抗原呈現細胞 (Antigen

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presenting cells, APC)中，如HSP-peptide複合物被樹突狀細胞(Dendritic cell, DC) 吸收後，會經由MHC class I抗原和(或) MHC class II抗原呈遞訊息給T細胞，使T 細胞轉換成對腫瘤細胞有專一性的細胞毒殺T細胞。這種HSP-peptide從死亡腫瘤 細胞釋放出來，造成類似疫苗的抗腫瘤免疫反應，稱為in situ vaccination[29]。

圖2-4 藉由溫熱治療導致抗腫瘤免疫反應的機制[30]

2-2-5 腫瘤組織的散熱能力差

腫瘤在遇到高溫時，無法有效的擴張血管，增加血液流量來帶走熱量。由圖 2-5[6]可知腫瘤、老鼠皮膚和老鼠肌肉的相對血液流量在不同溫度下的變化，腫 瘤呈現是一個區域是由於這是集合多種動物腫瘤的結果。部分腫瘤的血管在剛加 熱時就壞死，使血液流量下降，也有一部分在加熱後，血液流量是上升的，但即 使血液流量上升，也不會高於2倍。而老鼠的皮膚和肌肉處的血液流量在43-45°C 間上升了8到10倍。大部分的腫瘤處都會觀察到血管增生，但大多是無組織性且 功能異常的血管，因此當溫度上升時，不能有效的增加血液流量而將熱量帶走，

而正常組織則可以，如圖2-6 [31]。

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圖2-5 不同溫度下動物腫瘤與老鼠的皮膚和肌肉中的相對血液流量[6]

圖2-6 正常組織與腫瘤組織在高溫熱處理後的差別[31]

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因此溫療法對於腫瘤細胞特別有效，主要原因可分兩個層面，第一個是細胞 層面，腫瘤細胞經溫熱治療後產生熱休克性蛋白質來抵抗外界熱對細胞的傷害，

同時也增加內源性抗原的加工與呈遞，進而使MHC class I 抗原在腫瘤細胞表面 的密度提高，因此腫瘤細胞更容易被细胞毒性T 淋巴细胞辨認，腫瘤細胞壞死 使細胞內部的HSP70-peptide 釋放出來產生類似疫苗的功能，而產生抗腫瘤免疫 反應。令一個是組織層面，腫瘤發生的部位，雖然血管會有增生的現象，但大都 為無組織性或功能異常的血管，血管通透能力差，且血管膨脹的程度也比不上正 常血管，因此當在該區域溫度上升後，無法大量提昇血液流量而將熱量帶走，導 致熱量容易累積；正常組織能藉由血管的膨脹，大量提高血流量，而將大多數熱 量帶走。除此之外，腫瘤部位pH 值低，使癌細胞對高溫更敏感，當升溫後會加 速代謝，而使pH 值更低，使溫熱治療的療效更好，由此可知腫瘤本身對溫熱治 療就有選擇性。

2-2-6 溫熱治療的分類

溫熱治療可以依照使用的區域範圍來分類，而分成局部溫熱治療(Local hyperthermia)、區域溫熱治療(Regional hyperthermia)和全身溫熱治療(Whole body hyperthermia)。局部溫熱治療只專注在很小的區域上，如腫瘤；區域溫熱治療則 是針對較大的區域，如整個組織和器官；全身溫熱治療是使全身溫度都上升，可 治療已分散到全身的轉移性癌細胞。[21, 32]

2-2-7 磁性奈米粒子用於溫熱治療的加熱方式

早期的溫熱治療是利用提高整體體溫，但這類高溫全身療法限制在於，溫度 必須設定在人體能耐最高溫度 42°C，否則會引起大腦等溫度敏感器官的受損，

且組織深淺處的溫度有差異，不容易控制。若是局部性的高溫熱治療則不受42°C 限制，可高達45°C 以上，較不具不良的副作用。近期較多研究著重在利用磁性 奈米粒子當做加熱媒介，藉由 EPR 效應或主動標靶將磁性粒子累積於腫瘤或接 到癌細胞後，施以交流磁場，使磁性奈米粒子產生熱能，此屬於非侵入式的療法，

且能加熱組織深處。

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材料用於高溫熱治療產生熱的方式有包含：磁滯損耗(Hysteresis loss)、尼爾 鬆弛(Neel relaxation)和布朗鬆弛(Bronian relaxation)等三種產生熱的方式[10]。當 加熱的媒介屬於較大的磁性物質時，由於材料內會有次晶格(Sub-domains)，每個 次晶格都指向隨機方向，當外部磁場出現時，次晶格會隨磁場強度增強而統一磁 場方向，但磁場移去後，次晶格的磁性不會完全回復，而產生磁滯現象。磁滯現 象是物質內部磁性重新排列而引起的結果，會有磁滯損失。

當所用的加熱媒介為單一磁域的超順磁性奈米粒子時，則有尼爾鬆弛和布朗 鬆弛兩種產生熱的方式。由於單一磁域的奈米粒子呈現超順磁性，所以當有外磁 場時，磁矩會轉向磁場方向，而外磁場移去後，超順磁粒子又會完全回復到原本 狀態，無任何磁滯的現象，故無法利用磁滯損耗產生能量。尼爾鬆弛運動(圖 2-7) 是當外磁場出現，會給予能量使粒子內部的磁矩改變方向，而當外磁場移去時，

此時內部磁矩回復到原本方向時而放出能量，在粒子無法任意轉動時為主要加熱 方式，如粒子與細胞產生鍵結時。另一種是布朗鬆弛運動(圖 2-7)，指得是當粒 子隨外磁場轉動而與外部溶液產生摩擦，而產生的熱，通常發生在粒子懸浮在溶 液中時產生。

圖2-7 磁性粒子的尼爾與布朗鬆弛運動[21]

2-3 標靶療法

一般當癌細胞轉移時，只能依靠化學療法，但其副作用大，不但殺死癌細胞，

同時也會損害正常細胞，而造成嚴重的副作用，如：掉髮、免疫能力下降、噁心 嘔吐、器官功能損害等，造成病患與家人的痛苦，且會有抗藥性的產生而使療效

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下降。因此在治療時都會希望能賦予藥物標靶的能力，使藥物能有效利用，將對 正常細胞的傷害降到最低。標靶治療就是能使藥物對特定細胞有專一性，只會攻 擊一開始設定的目標，對正常細胞則無，因而能將藥物累積在特定部位。若將材 料表面修飾上標靶分子，也能將材料專一性地送往目標細胞，而減少材料使用的 量。生物體內的標靶治療主要分為兩種：被動式標靶與主動式標靶[33]。

2-3-1 被動標靶

被動標靶指的是並非利用材料或藥物來產生標靶效果，而是利用細胞、組織 本身的特性來產生累積的效果。像是腫瘤的EPR (The Enhanced Permeability and Retention)效應，只要選擇大小適當的粒子，其容易累積在腫瘤組織處，而不易 累積在正常組織。EPR 效應的原理為癌細胞為了快速成長的需求，分泌比正常細 胞多的VEGF (Vascular endothelial growth factor)和其他生長因子，而不斷增生血 管來獲得更多養分與氧氣，而這些血管的結構通常很混亂、不平滑，因而比其正 常組織表面有較大孔隙，容易累積粒子。因為腫瘤組織的高血管物質通透性與缺 乏有效的淋巴液引流來帶走液體，因此只要選擇適當粒徑便能產生標靶的效果，

每當材料或藥物流經腫瘤處就會有部分累積，但其效果並不好，在體內循環的材 料或藥物容易被肝、腎和脾臟等器官代謝掉[34, 35]。

2-3-2 主動式標靶

平常所提到的標靶是指主動式標靶，其原理是利用癌細胞上的特殊結構或分 子為目標，再利用可標定這些分子的物質進行治療。依標靶分子作用在目標分子 上的目的，可分為抑制腫瘤血管新生、阻擋癌細胞訊息傳遞的路徑及連結到癌細 胞表面抗原三類。標靶分子通常為抗體[36]、核酸適體(aptamer)[37]、寡核甘酸 (oligonucleotide)[38]和胜肽[39]等。此處將會介紹本研究會用到的兩種標靶分子 葉酸(Folic acid)與半乳糖(Galatose)。

2-3-2-1 葉酸

葉酸是一種低分子量的維他命，其在維持細胞生命中扮演一個很重要的角色。

葉酸由喋啶(Pteridine)與對胺苯甲酸(Para amino benzoic acid)組成喋酸(Pteroic

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acid)，再與麩胺酸(Glutamic acid)連結而成。多數動物自身無法製造葉酸，因為 無法合成出對胺苯甲酸或是無法將麩胺酸鹽(Glutamate)連結到喋酸上。因此必須 由飲食中攝取葉酸，大多來自於綠葉蔬菜[40]。

葉酸受體屬於glycosylphosphatidylinositol-anchored 膜蛋白，葉酸與葉酸受體 (Folate receptor)有極高的親和性(KD ~ 10^-10M)。葉酸受體在卵巢、肝、乳、腎、

腦和結腸等人類癌細胞上皆有過度表現的現象，在部分正常組織中也能發現葉酸 受體，不過表現的程度遠小於癌症[41-43]。當修飾葉酸的材料與細胞膜上的葉酸 受體接觸後，電漿膜會開始內陷，接著會在細胞內形成一個獨立的囊泡(Vesicle)，

稱為早期核內體(Early endosome)。在核內體膜上的質子幫浦會促使囊腔內的 pH 值下降到5。這酸化的現象會使葉酸受體蛋白上的羧酸基質子化，因而促使葉酸 -葉酸受體複合物構形改變，而使葉酸受體釋放回到細胞膜表面[44]。接上葉酸的 材料與葉酸受體接觸時，會很快結合在一起，並引起胞吞作用(Endocytosis)，而 將材料噬入細胞內，這是屬於非破壞性進入細胞的路徑[45]。葉酸有分子小、便 宜容易取得、容易修飾和不會造成免疫反應等優點[40]。

圖2-8 葉酸的分子結構

細胞膜上的葉酸受體可辨認葉酸上的α-羧酸基與γ-羧酸基，特別是α-羧酸 基，其與葉酸受體有很高的親和性[46]。因此我們能藉由葉酸上的一級胺基或γ -羧酸基與材料結合，而不會對葉酸與葉酸受體的結合造成太大影響。葉酸受體 在人類肝癌細胞HepG2 上有表現[47-49]，Manoj Kumar 與其團隊[49]利用 citric acid/2-bromo-2-methylpropionic acid 包覆超順磁氧化鐵奈米粒子，使其產生水溶 性與分散性，再與葉酸連接用於標靶有葉酸受體的乳癌細胞MCF-7 與肝癌細胞 HepG2，以及無葉酸受體的肺癌細胞 A549，並使用這些超順磁性奈米粒子當對

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比試劑(Contrast agent)以提升核磁共振造影(Magnetic resonance imaging，簡稱 MRI)的效果。結果在 MCF-7 與 HepG2 中，接有葉酸比沒接葉酸的磁性氧化鐵奈 米粒子在細胞內的量多2-15 倍。接有葉酸的磁性氧化鐵奈米粒子在 MCF-7 與 HepG2 中的量也比 A549 多了 10-12 倍。因此，證實了接有葉酸的氧化鐵奈米粒 子能更有效的進入HepG2 中。

2-3-2-2 半乳糖

ASGPR (The asialoglycoprotein receptor)是一種肝細胞表面的受體，屬於 C- 型凝集素(C-type lectin)，C-型凝集素是一種鈣離子依賴型的凝集素。ASGPR 主 要由 hH1 和 hH2 兩種次單元組成，而次單元當中有識別醣類結構的區域(The carbohydrate recognition domain, CRD)[50]。ASGPR 能專一性的辨別半乳糖和 N- 乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)殘基，ASGPR 在生理上主要的作用是對包 含半乳糖或 N-乙醯半乳糖胺殘基的醣蛋白(Glycoprotein)進行鍵結、內在化 (Internalization)和從循環中清除。ASGRP 在透過 Ca²⁺依賴的胞吞作用和溶酶體降 解(Lysosomal degradation)以清除循環的去唾液酸醣蛋白(Desialylated glycoprotein) 兩種行為中，扮演很重要的角色。當ASGP (Asialoglycoprotein)緊密結合到肝細 胞膜上的ASGPR 後，會經由 ASGPR 內在化，接著會傳送到溶酶體中降解。當 ASGP 被降解後，ASGPR 會循環重新回到細胞膜上，每個 ASGPR 單位可以重複 使用達200 次[51, 52]。

Mi Kyong Yoo 與其團隊[53]在超順磁氧化鐵奈米粒子上塗裝有半乳糖殘基 的 polyvinylbenzyl-ο-β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide (PVLA)，因此能對有 ASGPR 的細胞產生專一性。將 SIONPs (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles) 塗裝上 PVLA 與另一種無半乳糖殘基的 pyrrolidone 後，當做核磁共振造影的對 比試劑，透過尾靜脈(The tail vein)的靜脈注射打入老鼠體內，進行肝信號強度的 測量，發現PVLA 塗裝的 SPIONs 能更有效的累積在肝臟部位，產生更清楚的影 像。在人類肝癌細胞 HepG2 上已經確認有 ASGPR，在 4°C 時每個細胞約有 150,000 個配位分子，這些受體顯示出高親和性(Kd=7×10^-9 M)的結合位[54]。

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Guifang Huang 與 其 團 隊 [55] 將 有 氨 基 官 能 化 的 超 順 磁 氧 化 鐵 (Amino-functionalized superparamagnetic iron oxide, ASPIO)分別進行乳糖修飾 (Lactosylation)和乙醯化(Acetylation)，產生有 galacstose 的 ASPIO (Gal-ASPIO)和 N-乙醯化的 ASPIO (Nac-ASPIO)。接著分別培養於有 ASGPR 的 HepG2 與無 ASGPR 的 143B 人類骨肉瘤(Osteosarcoma)細胞中，在顯微鏡下發現 Gal-ASPIO 能與HepG2 產生緊密的結合而 143B 沒有；而 Nac-ASPIO 在 HepG2 或 143B 中 都沒有發現結合的現象，顯示有galactose 殘基的粒子能有效的標靶 HepG2。

2-4 磁性原理[56]

磁的正負極是以磁偶極的方式同時出現的。磁偶極對外磁場呈現磁偶矩μ 抗拒性。材料磁性的來源是由於組成物質的原子是由帶正電的原子核和帶負電的 電子組成，電子同時會繞著原子核和自旋，因此產生兩種磁效應。電子繞著核運 動產生的是軌道磁偶矩μL，而本身的自旋產生的是自旋磁偶矩μS。對於自由電 子來說，就只有自旋磁偶矩μS，是電子具有的內稟磁性，簡稱電子磁矩。因此，

只要是帶有電荷的物質，便會因為其運動的變化而產生磁性，使其周遭亦伴隨著 磁場的產生。一個物質所有電子的軌道磁矩和自旋磁矩相疊加後，若最後的總磁 矩不為零，該物質便具有磁性。μL和μS本來是無固定方向的，當出現一個外磁 場Bext時，便會受影響而改變方向。非磁性物質在外部磁場移除後，便回復原狀，

不呈現磁性；磁性物質在外部磁場移除後，μL和μS方向不會完全回復，而產生 磁性。

2-4-1 磁化率(Magnetic susceptibility)與介磁常數(Magnetic substance constant) 以下介紹常用於探討物質磁性的單位與公式：

B 為磁場，當 B=0 表示無磁場

無磁性物質時，B(無磁性物質)≡B0≡μ0 H……….... (1) 當出現磁性物質時，B^總＝B0+B^物＝μ0H+μ0M ≡μH ………..……….…..…... (2) B^物≡ m B0……….….……..……...………...….. (3)

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將式(3)帶入式(2)，可得 B^總＝(1+ m) B0≡κm B0………..………….………….….(4) 將式(1)帶入式(2)中，B^總＝B0+μ0M，與(4)結合，得 B^總＝B0+μ0M＝(1+ m) B0， 再經移位後可得M＝ mB0/μ0＝ m H………...……….…..………...….. (5) 式(4)移位後可得 κm≡ ^{有磁性物質}

無磁性物質 ….……...….………..……...……...(6) B：磁感應強度(Magnetic induction intensity)、磁通量密度，或簡稱為磁場 M：物質單位體積的磁偶矩，可稱為磁化強度

H：磁場強度(Magnetic field intensity) μ：有磁性物質時的磁導率

m：磁化率(Magnetic susceptibility)

κm：介磁常數(Magnetic substance constant)，或稱為相對磁導率。

磁導率μ 是實值量(μ≧0)，且在 MKSA 制中 μ0＝4π x10^{-7 •} >0，因此由式 (6)可知 κm≧0。當 κm＝1 時，μ＝μ0，也就是沒有磁化現象；κm≠1 時，表示有磁 化。當κm>1 時，表示 M 和 H 同向；當 κm<1 時，表示 M 和 H 反向，並且需滿 足-1< m<0。

當 m＝-1 時，由式(4)可知此時 κm＝0，進一步由式(6)得知 μ＝0，最後可由 式(2)得知 B^總＝0，表示磁性物質內沒有磁場，物質的磁場 μ0M 剛好抵消外磁場 μ0H，此時物質呈現特殊狀態，磁性物質內沒電阻，所以一旦出現電流，就能保 持 10⁹ 秒 之 久 ， 因 為 沒 有 電 阻 來 損 耗 能 量 ， 此 狀 態 是 由 荷 蘭 物 理 學 家 H.

Kamerlingh – Qnnes 在 1911 年發現的超導狀態。

2-4-2 磁性物質的種類

I. 順磁物質(Paramagnetic substance)

當出現外磁場Bext時，Bext影響原子的電子軌道磁偶矩μL和自旋磁偶矩μS， 導致μL傾向隨機方向，而μS與Bext的方向相同，所以磁化強度M 和 Bext同向。

總磁場為B^總＝μ0(H + M)＝μH。在常溫下(300K)，其磁化率 m很小和磁導率值 約為μ＝μ0[1 + (10^-4 ~ 10^-6)]，物質不容易產生磁性。磁化率與溫度成反比，隨著

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溫度越高，熱擾動的動能增加，使原子的磁矩方向越難與外磁場一致。

II. 反磁物質(diamagnetic substance)

當出現外磁場 Bext時，自旋磁偶矩 μS通常不受影響，除非在低溫且磁場很 強外；而電子軌道磁偶矩μL為與Bext的方向相反，因此磁化強度M 和 H 的方向 相反，所以式(2)會變成 B^總＝μ0(H - M)。由式(5)可知道為磁化率 m負值，磁導 率值約為10^-6μ0。磁化率與溫度較無關係。此類物質有玻璃棒、金、銀、鉛、鋅 和碳等物質。

III. 鐵磁物質(Ferromagnetic substance)

在室溫下(約 300 K)，鐵磁物質的原子電子的兩種磁偶矩之間和各自之間 (μL-μs、μs-μs、μL-μL)就有很強的作用力，導致物質能分成很多的小磁域(magnetic domain)，各磁域有各自的磁化強度 M 且都隨機指向，因此物質整體是沒有磁性 的。當出現外磁場Bext時，各個小磁域會重新組合，並逐漸向指向Bext的方向，

最後全部指向Bext的方向，B^總＝μ0(H+ M)＝μH。其磁化率 m>0 且很大，磁導率 μ＝μ0 [1 + (2 或 3 ~ 10³)]。

當溫度升高時，鐵磁物質的磁化會減小，當溫度到達居禮溫度(Curie temperature, TC)時，會轉變成順磁物質，關係如圖 2-9(參考[56])。磁化率與溫度 的關係為 m＝C/(T- TC)，C 為居禮常數，此公式稱為 Cuire-Weiss Law，溫度低於 TC為鐵磁性；溫度高於TC則為順磁性。

圖2-9 鐵磁性物質的磁化向量大小與溫度關係[56]

Tc

M(磁化向量)

T(溫度) MS

鐵磁性

順磁性

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IV. 反鐵物質(Antiferromagnetic substance)[15, 16]

反鐵物質相鄰的電子自旋磁偶矩大小相同但方向相反(反平行)，導致 m磁化 率接近0，由 Louis Neel 在 1932 年首次發現。有外加磁場時，當溫度大於尼爾 溫度(Neel temperature, TN)時，磁化率與溫度的關係為 m＝ 。當溫度小於TN

時，會有兩種情況，第一種是外磁場方向垂直電子自旋方向，此時磁化率約為常 數C/TN；另一種是當外磁場方向平行於電子自旋方向時，溫度為0 K 時，磁化 率為0，若在 0 K 到 TN之間，則磁化率會緩慢地升至C/TN。

V. 陶鐵磁物質(Ferrimagnetic substance) [15, 16]

和反鐵磁性一樣，物質內部相鄰的磁矩方向相反，不同的是大小不一，作用 力無法完全抵消，因而磁矩不為0。常發生在亞晶格(sub-lattice)是由不同材料或 不同價電的鐵組成時(Fe²⁺和Fe³⁺)，如磁鐵礦(Fe3O4)，就屬於陶鐵磁性。和鐵磁 性一樣，當溫度高於居禮溫度TC時，會轉變成順磁性。

VI. 超順磁物質(Superparamagnetic substance) [3, 33]

磁性粒子的磁性會隨著粒子大小、形狀和結構而改變。當物質越大時，會出 現越多磁域。隨著粒子逐漸的減小，會從多磁域轉變成單磁域。當粒子達30 nm 左右時，會變成超順磁性。超順磁的特性是在較弱的磁場中，容易呈現磁飽和，

且無磁滯現象，也就是當磁場一移除，物質就成無磁性。超順磁性奈米粒子可藉 由外加磁場之導引而輕易回收或集中粒子，在外加磁場移除後，只要有適當的表 面官能基，就能使超順磁性奈米粒子保持極佳的分散性。

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2-4-3 磁滯現象(Magnetic hysteresis)

一般物質在外部磁場移除後，磁性都會回復原狀，無任何磁性。但鐵磁性物 質的各個磁域(Magnetic domain)不會完全回復，而有殘留磁性，這現象稱為磁滯 現象。一開始物質不具任何磁性，隨著外部磁場的增強，物質各個磁域重排且方 向與外部磁場一致，而開始產生磁性(圖 2-10(參考[56])中的虛線 a 到 b)。當物質 全部磁域統一後，磁化向量達到飽和不再增加，得到飽和磁化強度Ms(圖 2-10 中的點b)。再將磁場逐漸變小至完全移除(圖 2-10 中的實線 b 到 c)，此時磁域不 會完全回復，而導致出現殘留磁性，稱為頑磁性(retentivity) Mr (圖 2-10 中的點 c)。再施以與一開始相反的磁場，逐漸大到磁力飽和後(圖 2-10 中的實線 c 到 d)，

會得到飽和磁化強度「-Ms」(圖 2-10 中的點 d)。最後將磁場逐漸移除，再加入 一開始的磁場(圖 2-10 中的 d 經 c’到 b)，若以磁化強度 M 對外部磁場作圖，此 時得到一個封閉曲線，稱為磁滯迴圈(Hysteresis loop)。物質受到接觸環境的影響，

而改變性質的現象，稱為滯後現象(Hysteresis)，滯後現象是物質內部重新排列而 引起的結果，所以會消耗能量，稱為滯後損失(Hysteresis loss)。

圖2-10 定溫下，物磁磁性隨外磁場變化產生的磁滯現象[56]

B＝μ0(H+ M)

a

b

c

d

c’

Bext

Ms

-Ms

Mr

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2-5 磁性奈米粒子的合成方式 2-5-1 氧化鐵奈米粒子的合成[16]

超順磁性氧化鐵奈米粒子(SIONPs)有磁鐵礦(Magnetite, Fe3O4)和磁赤鐵礦 (Maghemite, γ-Fe2O3)兩種。其在生物醫學上可用於核磁共振造影的對比試劑、

標靶藥物載體、溫熱治療、催化(Catalysis)、生物分離(Biological separation)、生 物感應器(Biosensors)和診斷醫學設備(Diagnostic medical devices)等[57, 58]。合成 奈米尺寸的氧化鐵的方式相當多種，如：藉由一氧化碳還原Fe2O3、Fe²⁺和Fe³⁺

水溶液藉由鹼產生共沉澱、微波電漿合成、高溫分解法、水熱法、機械研磨等，

每種合成法都有其特色。以下介紹幾種常見的方法，像是可合成出較一致粒徑的 高溫分解法，和較常使用於生醫材料領域的共沉澱法，以及能合成出較大粒徑(20 nm < d < 100 nm)超順磁性氧化鐵奈米粒子的水熱法。

2-5-1-1 高溫分解法

高溫分解法是利用高溫使金屬錯合物裂解，產生金屬原子並慢慢聚集成粒子，

此方法可產生單分散的SIONPs。Taeghwan Hyeon[59]在 2001 年發表的研究中，

利用Fe(CO)5在油相中合成出粒徑一致且單分散氧化鐵奈米粒子，合成方法簡述 如下。將油酸(Oleic acid)放入辛醚(Octyl ether)中，升溫到 100°C 後加入 Fe(CO)5。 加熱1 小時後，溶液顏色轉黑，此時表示 Fe(CO)5放出CO 氣體，並形成鐵原子。

等溫度回到室溫後，加入無水(CH3)3NO，幫助鐵粒子氧化成氧化鐵奈米粒子。

在氬氣下，加熱到130°C 維持 2 小時，此時會形成棕色溶液。慢慢升溫到熱回流 (reflux)的溫度，並回流 1 小時，溶液顏色會再次轉黑，形成 γ-Fe2O3。待溶液冷 卻，用乙醇清洗黑色沉澱物，沉澱物可回溶到有機溶液中，如：hexane、octane 和toluene 等。簡單的說就是在 100°C 將鐵金屬錯合物裂解出鐵金屬，再利用氧 化劑將其氧化成氧化鐵奈米粒子。

另 外 ，Shouheng Sun 團 隊 [60] 在 2002 年 發 表 了 一 篇 將 iron (III) acetylacetonate (Fe(acac)3)混合在含有油酸、油胺(oleylamine)及 1,2-十六烷二醇 (1,2-hexadecanediol)的二苯醚(Phenyl ether)溶液中，在氮氣下將溫度升至產生回

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流(265°C)，加熱 30 分鐘。待溫度降至室溫，以乙醇清洗後，再次溶解於含有 油酸和油胺的hexane 溶液中，並藉由加入乙醇再次產生沈澱，而得到 4 nm 的 Fe3O4奈米粒子。將產物的奈米粒子再次放到合成步驟中當做晶種，可獲得更大 的 Fe3O4奈米粒子，藉由調控放入的晶種量，能得到不同大小的 Fe3O4奈米粒 子。

此方法的優點是產物為高度結晶化且單一分散性的奈米粒子、改變實驗參數 即可調整粒徑大小、可量產等[59]。缺點是此方法是在油相合成，且最後產物 必需分散在有機溶劑中才能均勻分散，在生醫方面的使用受到限制。

2-5-1-2 化學共沈澱法

共沈澱法就是在含多種陽離子的溶液中加入沈澱劑，使金屬離子完全沈澱，

而得到複合氧化物的方法[61]。氧化鐵的共沉澱法是將二價鐵離子和三價鐵離子 以適當比例溶解於水溶液中，再加入鹼使鐵離子產生沈澱，形成Fe3O4。一般而 言，FeCl3和FeCl2水溶液以Fe(III)/Fe(II) = 2/1 的比例混合，並加入氨水調整 pH 值至鹼性，而得到Fe3O4奈米粒子。共沈澱法可藉由調整pH 值、溫度、混合方 法以及陰離子的濃度與本性來得到粒徑較一致的產物。此方法的優點是在水溶液 中反應，無需用到有機溶劑，適合用於生醫方面的應用。

2-5-1-3 水熱法

水熱法的原理是將在常溫常壓下不容易氧化的物質，施以高溫高壓而使其快 速的氧化。例如：將鐵金屬放到98 MPa、400°C 的水熱條件下 1 小時，可得到 數十到100 μm 的磁鐵礦[61]。Daou[62]團隊利用水熱法合成出平均粒徑為 39 nm 且單分散性的磁性粒子。其方法為將二價和三價鐵離子溶解在鹽酸水溶液中，系 統維持在70°C 並通以氬氣，接著緩慢加入 25%的 N(CH3)4OH，劇烈攪拌。溶液 會由橘色轉變成黑色沉澱，接著裝入鐵氟龍反應釜中，在250°C 下加熱 24 小時，

即可獲得氧化鐵奈米粒子。

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2-5-2 高分子與超順磁氧化鐵的混成奈米材料[57]

將SIONPs 用於生物醫學領域，需先改變表面化學性質，由於 SIONPs 容易 因為高表面積/體積比和偶極-偶極交互作用(dipole-dipole interaction)，導致奈米 粒子容易聚集堆積，而不利於應用。若將表面進行修飾，不但能增加分散性，還 能產生親水性、生物相容性和提供官能基以修飾上標靶分子、預防助嗜作用 (Opsonization)等[63]。產生高分子與 SIONP 混成奈米材料的方式有直接修飾高分 子(Direct modification with polymers)、表面引發控制聚合反應(Surface-initiated controlled polymerization)、無機二氧化矽與高分子雜交(Inorganic silica/polymer hybridization)、自組裝(Self-assembly)、自結合(Self-association)以及異質相聚合反 應(Heterogeneous polymerization)等方法[57]。

2-5-2-1 直接修飾高分子

此方法藉由多齒(Multi-dentate)高分子來修飾 SIONPs，以產生能分散在水中 的SIONPs。所謂的多齒高分子是指主鏈上有多種的錨式基團(Multiple anchoring groups)的高分子。一般有物理吸附和加入第二層(The addition of a second layer) 兩種方法。

物理吸附的方法是藉由在製備SIONPs 的途中或製備之後加入能提供穩定的 共聚物。能提供穩定的共聚物可分為兩個區段，一個是錨式區段，其能黏附於 SIONPs 表面；另一個是水溶性區段，可提供 SIONPs 在水中分散的能力與生物 相容性。可控制的自由基聚合反應法(Controlled radical polymerization methods, CRP)可用來製備能妥善控制的嵌段共聚物(Block copolymers)，而產生預定的分 子量且分子量分布較一致。原子轉移自由基聚合反應(Atom transfer radical polymerization, ATRP)是 CRP 法中的其中一種，已被用來製備能妥善控制的 poly(oligo(ethylene oxide) monomethyl ether methacrylate)-b-poly(t-butyl methacrylate) (POEOMA-b-PtBMA)，POEOMA-b-PtBMA 嵌段共聚物在酸性下水 解產生POEOMA-b-poly(methacrylic acid) (POEOMA-b-PMAA)，PMMA 區段可 用來固著於 SIONPs 表面；POEOMA 區段則能提供水分散性與生物相容性。在

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有POEOMA-b-PMMA 的水溶液中，藉由 Fe(II)和 Fe(III)產生共沈澱，而合成出 POEOMA-b-PMMA 嵌段共聚物包覆的 Fe3O4奈米粒子，此產物具有良好的膠體 穩定性，並且能藉由改變共聚物的濃度合成出粒徑範圍在10-25 nm 的粒子[64]。

除了利用 CRP 法產生嵌段共聚物之外，其他聚合反應產生的高分子也可用包覆 SIONP 粒子，只要高分子擁有羧酸基或環氧基(Epoxy group)就可固著於 SIONPs 上。另外，生物高分子也可修飾上錨定基團，以包覆 SIONPs，如與多巴胺共軛 的玻尿酸(Dopamine-conjugated hyaluronic acid)[65]。

增加第二層的方法是藉由加入雙親嵌段共聚物(Amphiphilic block copolymer) 來和原本用來穩定 SIONPs 的疏水配位基(如油酸)反應。雙親嵌段共聚物的疏水 部分和磁性奈米粒子上的用於穩定的疏水配位基作用，而親水部分則能提供水溶 性。這類例子如先合成出油酸包覆 Fe3O4 奈米粒子，再將此溶液加入到含有 Pluronic F127 ( PEO-b-PPO-b-PEO 嵌段共聚物)的水溶液中，形成 oil-in-water 微 乳化(microemulsion)溶液，乾燥後便可得到粉末狀的藉由 F127 穩定的 Fe3O4奈米 粒子，而能重新分散在水中[66]。

2-5-2-2 表面引發控制聚合反應：主鏈接枝法(Grafting from method)

表面引發控制聚合反應包含表面引發的 CRP 法，使高分子在粒子表面呈現 刷狀的形態。不同於物理吸附的 CRP 法，此處所用的高分子是在高分子鏈的末 端僅有單一錨式基團的單牙配位高分子(Monodentate polymers)，藉由錨式基團使 高分子固著於SIONPs 上來產生穩定的奈米粒子。

SIONPs 藉由可引發 ATRP 的物質(通常為鹵化物(Halides))來產生表面引發的 控制聚合反應以改質。目前有兩種路徑來固定鹵化物於SIONPs 上，一種是藉由 有 酸 官 能 基 的 鹵 化 物 進 行 物 理 吸 附 ， 如 3-chloropropionic acid[67] 、 2-bromo-2-methyl propionic acid[68]等。這些酸官能基鹵化物會引發在有機溶劑中 的styrene 和 OEOMA 產生 ATRP 反應，使疏水性的 PS (Polystyrene)或親水性的 POEOMA 塗裝在 SIONPs 上。另一個路徑是藉由引發 ATRP 的鹵化物經產生矽 氧化(Silanization)而共價在 SIONPs 上，如[4-(chloromethyl)phenyl]trichlorosilane

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用於聚合OEOMA[69]。除了 grafting from，接枝到主鏈法(grafting onto)也可用於 產生單層高分子塗裝的 SIONPs。此方法是藉由設計出高分子鏈末端有單牙配位 的高分子來與SIONPs 反應。

2-5-2-3 無機二氧化矽與高分子混成

利用tetraethyl orthosilicate (TEOS)的 sol-gel 程序在 SIONPs 外產生一層二氧 化矽層，進一步藉由高分子改質以產生多功能的混成奈米材料。在有Fe3O4 NPs 和fluorescein isothiocyanate (FITC)的溶液中進行 TEOS 的 sol-gel 反應，而得到有 Fe3O4 核 和 有 螢 光 的 二 氧 化 矽 層 。 接 著 二 氧 化 矽 殼 層 進 一 步 藉 由 與 3-methacryloxypropyltrimethosysilane (MPS)反應產生 methacrylates 官能基，再與 ethylene glycol dimethacrtlate (EGDMA)和 vinyl benzyl chloride 作用產生的自由基 交聯聚合，而生成chlorine。Chlorine 基團能當做 OEOMA 的 ATRP 反應的引發 物，最後生成外層擁有刷狀POEOMA 的混成奈米材料[70]。

2-5-2-4 自組裝(self-assembly)

製備能在水中產生自組裝，形成核殼微胞奈米粒子的雙親嵌段共聚物，其疏 水性的核能當做抗癌藥物和SIONPs 的載體；親水性的殼層則提供材料在水溶液 中的穩定性。2-hydroxyethyl-2’-methyl-2’-bromopropionate 藉由 ROP (Ring opening polymerization)和 ATRP 反應形成 PLA-b-POEOMA 雙親嵌段共聚物，其在含有 疏水性Fe3O4奈米粒子的溶液中自組裝，形成在水中分散性良好的磁性奈米粒子，

且能進一步修飾上葉酸，用於癌細胞標靶[71]。

2-5-2-5 自結合(self-association)

自結合一般是藉由SIONPs 和陰離子或陽離子的高分子以離子交互作用而產 生。如帶正電的SIONPs 與負電的 poly(amidoamine) (PAMAM) 樹枝狀聚合物作 用[72]。

2-5-2-6 異質聚合反應(Heterogeneous polymerization)

這類聚合反應有逆細乳化聚合反應(Inverse miniemusion polymerization)、分 散 聚 合 反 應 (Dispersion polymerization) 和 沈 澱 聚 合 反 應 (Precipitation