3-1 實驗藥品與儀器 3-1-1 實驗材料與樣品
(1) Acetone(CH3)2CO，MW:58.08，購自TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(2) Isopropanol(IPA)
(CH3)2CHOH，MW:60.10，購自TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(3) Nanodiamond
Size:0-0.25μm，購自BAOO WEI International Co., Ltd.
(4) Sulfuric Acid
H2SO4，MW:98.08，購自TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(5) Nitric Acid
HNO3，MW:63.012，購自TAIWAN MAXWAVE Co., Ltd.
(6) Ethanol
CH3CH2OH，MW:46.07，95%，購自UNI-WARD Corp.
(7)malachite green
，購自invitrogen (8)Au particle
Size: 13nm，購自sigma (9) dimethyl sulfoxide(DMSO)
購自sigma
(10) trypsin-EDTA solution
0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na，購自invitrogen (11)Dulbecco’s phosphate buffer saline(DPBS)
購自invitrogen (12) Trypan blue
0.4% w/v，購自GIBCO (13)culture medium
購自invitrogen (14)SU-8 2015
(15)SU-8 development 購自MicroChem
(16)1H,1H,2H,2H-perflurooctyltrichlorosilane(FOTS)
(17) Polydimethylsiloxane (PDMS)
(18) Phosphate buffered saline(PBS)
pH:7.4，購自Bio basic Inc.
(19)EDC (or EDAC; 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)
CH3CH2N=C=N(CH2)3N(CH3)2‧HCl，MW:191.71，98+%，購自Alfa Aesar (20) N-hydroxy succinimide(NHS)
(21) 2-(4-Morpholino) ethanesulfonic acid hydrate(MES) C6H13NO4S‧H2O，MW:213.26，98%，購自Alfa Aesar (22)Human Growth Hormone (hGH)
MW：22.2k，購自Abcam
3-1-2 實驗儀器
(1)旋轉塗佈機( Spin coater ) (2)微量離心機(Micro- centrifuge )
DENVILLE的桌上型離心機260D (3)加熱板( Hot plate )
(4)電子束微影系統( Electron Beam Lithography System，ELS-7500EX，
ELIONIX Inc. )，交通大學奈米科技中心
(5)共軛焦顯微鏡( Confocal microscopy，LabRAM HR800，HORIBA JOBIN YVON )，交通大學奈米科技中心
(6)培養箱（incubator）
COCONO恆溫培養箱，型號HR-80 (7)氧電漿處理器
All real 的plasma cleaner，型號PCD150 (8)血球技術盤
(9)計數器
(10)二氧化碳培養箱(CO2 incubator)
(11) 場發射穿透式電子顯微鏡(Field Emission Transmission Electron Microscope, FETEM)，交通大學奈米科技中心
(12)振盪器
(13)電穿孔儀
BTX 電穿孔儀，型號為ECM830 (14)恆溫水浴槽(water bath)
(15)離心機(centrifuge)
BECKMAN的桌上型離心機，型號為Allegra X-12R (16)無菌操作台（laminar flow）
REVCD的垂直循環落地型無菌操作台，型號TBH-420 (17)試管振盪器(maxi-mixer)
Scientific industries的試管振盪器，型號vortex-genie2 (18) 共軛焦顯微鏡( Confocal microscopy)
OLYMPUS公司生產的共軛焦顯微鏡，型號為FLUOVIEW™ 1000
3-2 細胞培養與金球表面修飾 3-2-1 細胞繼代培養操作
本實驗使用的細胞為Hep G2，屬於附著型(adherent)細胞，ATCC編號 為60025，cell type為Human hepatoblastoma，是人類肝癌細胞的一種。當細 胞培養至高濃度，導致佔滿平面生存空間時(confluence)，需進行繼代培養 (subcluture)，收集細胞分殖進入新的培養皿中，操作步驟如下：
(1) 吸去舊的培養液。
(2) 用BPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)清洗兩次。
(3) 加入1 ml的trypsin-EDTA溶液(0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na)，並放 入37℃的CO2培養箱作用2分鐘。
(4) 放置於倒立顯微鏡下觀察，可看到將要分離而成圓粒狀浮起的細胞或已 剝落的細胞，此時輕敲培養皿，使更多細胞脫落，並加入1ml含血清之 新鮮培養基(90% Minimum essential medium with non-essential amino acids and Earle’s BSS+10% fetal bovine serum)，血清中的trypsin inhibitor 可終止trypsin的作用，用吸管吸放數次以打散細胞團塊，並依稀釋比例 轉移至添加新鮮培養基之培養皿，繼續放置CO2培養箱中培養。
3-2-2 奈米金修飾上孔雀綠步驟
奈米金球可藉由表面電漿共振來增強吸附於其表面上的奈米粒子訊 號，此篇論文使用孔雀綠吸附在13 nm大小的奈米金上，修飾方法參考文獻 [33]，步驟如下：
(1) 取40 µl的孔雀綠(20 µM) 和160 µl的DMSO混和，將孔雀綠濃度稀釋成 4 µM。
(2) 取420µl的金球和430µl的滅菌水混合，再加入150 µl的4 µM孔雀綠，在 25℃，速度120 rpm下shaking10分鐘。
(3) 加入10 µl的hexanthiol，在25℃，速度120 rpm下反應1小時，此步驟為了 防止金球聚集。
(4) 在轉速8rpm下離心5分鐘，去除上清液，取100 µl的DMSO回溶，並加入 100 µl的FBS，此步驟為了保護金球，使其不易聚集。
3-2-3奈米金球結合人類生長激素步驟
人類生長激素(Human growth hormone，hGH)是一種蛋白質荷爾蒙，由 腦下垂體所分泌，含有192個胺基酸分子，分子量為22.2 kDa。而癌細胞含 有許多生長激素受器(Human growth hormone receptor，hGHR)，分佈在細胞 膜上，一旦與生長激素結合，形成激素-受器複合體，引發一系列的生化反 4. 加入10 µl的保護基hexanethiol，在室溫下反應1小時 5. 以轉速8000 rpm，離心8分鐘
6. 去除上清液，取100 µl的PBST回溶，在4℃下保存
3-2-4 金球電穿孔送入細胞過程
細胞膜或是平面的脂雙層膜，如果在極短時間內施加高電場，會造成細 胞膜的導電性和滲透性雙雙增加，如果電場增強至某種程度，則會造成細 胞形成孔洞結構，這種現象稱為電性破裂（electrical breakdown），屬於可恢 復的破裂。 而電穿孔(electroporation)就是利用此種原理，在兩片距離極近 的電極板通以瞬間高壓，使置於其中的生物體之細胞膜膜電位改變，形成 可逆性孔洞，欲傳送物質經由細胞膜孔而進入細胞中，當電場消失後細胞 膜可再回復，使傳送物質保留在細胞內，此方法可適用於大部分細胞，操 作步驟如下所示：
(1) 用trypsin把細胞打下，離心(800rpm、25℃、5分鐘)，去上清液並加入2-8 ml純MEM回溶，吸放數次，使細胞均勻分佈。
(2) 取10 µl的細胞懸浮液和10 µl的trypan blue等體積混和均勻。
(3) 取10 µl的混和液自血球計數盤chamber上方的凹槽加入，並蓋上蓋玻 片，放置於倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(活細胞
(5) 取50 µl的Au-MGITC溶液和750 µl的細胞懸浮液混和，進行電穿孔，電 壓600ｖ，施加時間100 µs，間隔100 ms，進行8次。
(6) 把滅菌過的矽基版放置於6-well的培養皿內，將電穿孔完成的細胞滴在 基版上，並加入2 ml的新鮮培養基，放入CO2培養箱內一天，等待細胞 貼附。
(7) 在倒立顯微鏡下觀察細胞有無貼附，吸起舊培養液，並用外用PBS沖洗 三次，再加入paratromaldehyde固定細胞，反應20分鐘。
(8) 去除paratromaldehyde，用外用PBS清洗三次。
3-3 奈米鑽石酸化與表面修飾 3-3-1 奈米鑽石酸化
經由酸洗過程可去除奈米鑽石表面的sp2結構，產生羧基-COOH，並可 和含有胺基-NH2的生物分子相互鍵結，強氧化酸洗奈米鑽石的方式則是參 考本實驗室林柏凡學長的論文，見圖3.1[48]，酸洗步驟如下：
1. 取0.15克的100 nm奈米鑽石粉末。
2. 取12 ml硫酸、4 ml硝酸，混合之後加入奈米鑽石粉末。
3. 超音波振盪1小時，攪拌11小時，接著再振盪1小時，攪拌11小時。
4. 離心5分鐘，去掉酸液。
5. 加入D.I. water，離心5分鐘，去掉上清液，重複此步驟兩次。
6. 加入D.I. water，超音波振盪5分鐘，接著全部裝入20 ml樣品瓶中，置於 90℃烘箱中烘乾。
7. 刮下，即可得到酸化過的奈米鑽石粉末。
圖3.1 奈米鑽石的強氧化酸洗步驟[48]
3-3-2 奈米鑽石修飾上hGH步驟
在此部份我使用EDC/NHS試劑[49]活化奈米鑽石表面的羧基，讓羧基 容易與hGH形成醯胺鍵(Amide bond)而連接，反應機制如圖3.2[50]所示，試 劑比例是參考實驗室林柏帆學長的論文(MES buffer : ND :DI water : EDC : NHS = 3 ml : 6 ml : 3 ml : 6 ml : 6 ml)，故我將0.1 mM的MES buffer：30 µl、
0.025 M的EDC：60 µl、0.025 M的NHS：60 µl、100 µg/ml的鑽石:60 µl加入 濃度1 µl/ml的hGH:10 µl，在常溫下反應2小時，以轉速12000 rmp離心12分 鐘，去除上清液後加入100 µl的滅菌水回溶。
圖3.2 形成醯胺鍵的反應機制[50]
3-4 PDMS翻製法製作微流道
加入丙酮(Acetone)、異丙醇(Isopropanol, IPA)以及去離子水(DI water)，依序將破片放入清洗並配合超音波振盪五分鐘，最後用氮氣槍吹乾。
2. 利用旋轉塗佈機(spin coater)將電子阻劑塗佈在清洗好的破片上，在此選 用的是SU-8 2015是一種可產生高圖像縱橫比(aspect ratio)結構的負光 阻，在顯影完後會把未曝光區域去除，已曝光部份則因分子形成鍵結而 留下圖案。參考MICROCHEM所提供的旋塗參數，見圖3.4[51]，我們選 用的旋塗參數為前10秒500 rpm，後50秒2000 rpm，可得到厚度約21 µm 的阻劑層，之後以95℃軟烤3分鐘，180℃硬烤30分鐘，此步驟為了減少 光阻中的溶劑含量，使光阻平坦化並增加光阻的附著力。
3. 使用weacas繪圖程式設計圖型，為三條寬度不同的溝槽結構，寬度分別 是30 µm、45 µm、60 µm。
4. 把晶片置於電子束微影的移動平台，推進電子光學柱的真空腔體中，進
行曝光。加速電壓固定在50 kV，電流大小為600 pA，並利用電腦來控制
8. 將由Dow Corning公司所生產之矽膠樹酯(Sylgard 184 silicone elastomer) 和固化劑(Sylgard 184 elastomer curing agent)以重量10:1的比例混合，倒 於母模上，並用真空幫浦抽真空至150 mTorr，以去除混合時所產生的氣 泡。
9. 放置於加熱板上，以150℃加熱15分鐘使其固化，即可將PDMS從母模上 剝除並用針頭鑽孔，完成流道結構。
10.將製作好的流道和清洗過的矽晶圓破片以氧電漿處理使表面改質，成為 親水性而接合，在此所使用的氧電漿機台是由交通大學奈米所許証宗老 師實驗室所提供，在打電漿前先抽真空至100 mTorr，之後以16 W的強度 進行30秒的氧電漿處理，處理完後要儘快將流道和矽基板黏合，避免接
觸空氣太久而恢復成疏水性。
圖3.3 流道製作流程
3-5 樣品注入與光譜量測
本篇論文分成三大主題，第一部份是用修飾上孔雀綠的奈米金球，標 定人類肝癌細胞(Hep G2)，偵測其拉曼訊號，並建立距離對強度的二維圖 譜，以觀察金球在細胞裡的分佈空間，之後接上hGH，改由標定細胞膜位 置，同樣偵測其拉曼訊號，並比較與前一種方式在細胞裡分佈位置的不同。
第二部份則是改用奈米鑽石來標記Hep G2細胞，第三部分則分別把奈米金 球和奈米鑽石注射進入微流道系統，量測其不同濃度和流速的拉曼訊號變 化情形。注射幫浦使用的是KDS100，見圖3.5，流速範圍可從0.1 µl/h~426 ml/h。
圖3.5 KDS 100注射幫浦
第四章 量測結果與討論
200 μm、積分時間10秒、量測波段1100-1800 cm-1)，可看出金球在此波段沒 有特別明顯的拉曼訊號。為了要量測孔雀綠的拉曼光譜訊號，需先對其溶劑DMSO做量測，以避 免溶劑訊號和孔雀綠訊號相互混淆，DMSO的拉曼光譜如圖4.3所示(量測參 數：雷射光源633 nm、光柵600、共焦針孔200 μm、積分時間10秒、量測波 段200-2000 cm-1)，其中521 cm-1為矽基板之訊號，其餘的峰值為DMSO的特 徵峰(306 cm-1,334 cm-1,381 cm-1,700 cm-1,953 cm-1,1043 cm-1,1421 cm-1)。接著
量測4 µM孔雀綠的拉曼訊號，並跟接上金球和保護基的孔雀綠做比較(量測 參數：雷射光源633nm、光柵600、共焦針孔200 μm、積分時間1秒、量測波 段200-1800 cm-1)，如圖4.4所示。孔雀綠在單獨存在情形下特徵峰不明顯，
反倒是溶劑DMSO的訊號強度較大，接上金球後可看出孔雀錄的特徵峰（435 cm-1，732 cm-1，799 cm-1，915 cm-1，1169 cm-1，1165 cm-1，1590 cm-1，1615 cm-1），其中，1615 cm-1是孔雀綠強度最強的特徵峰，是由phenyl C-C鍵所 造成。
之後將修飾上孔雀綠的金球以電穿孔的方式送進Hep G2細胞(電穿孔 參數：施加電壓600 V、施加電壓時間100 µs、間隔時間100 ms，總共進行8 次)，穿孔完成後養在培養皿內一天，用paratromaldehyde固定細胞和經過PBS 的反覆沖洗，即可對貼附在矽基板上的細胞進行光譜量測。首先需量測純 Hep G2細胞和只有送入金球的Hep G2細胞，以建立背景值訊號的圖譜並做 為對照組，先用100倍物鏡在光學顯微鏡下找到Hep G2細胞，如圖4.5(a)所 示，接著就可進行拉曼量測(量測參數：雷射光源633 nm、光柵600、共焦針 孔200 μm、積分時間10秒、量測波段1100-1800 cm-1) ，Hep G2細胞的拉曼 光譜圖見圖4.5(b)，可看出在1100-1800 cm-1的範圍內並無明顯訊號，接著我 們對其做xy平面的mapping圖，其OM見圖4.5(c)，掃描範圍見表4.1，鎖定1617 cm-1做xy平面與訊號強度圖，如圖4.5(d)所示，也可看出並無特殊訊號。同 樣以100倍物鏡找到送入金球的Hep G2細胞，對其進行光學量測(量測參
數：雷射光源633 nm、光柵600、共焦針孔200 μm、積分時間5秒、量測波 段1100-1800 cm-1)，其OM圖如圖4.6(a)所示，拉曼光譜圖見圖4.6(b)，並無 明顯的訊號，對其做xy平面的mapping，OM如圖4.6(c)所示，掃描範圍見表 4.2，鎖定1617 cm-1峰值，對其做距離和訊號強度的2D圖，可發現訊號極弱，
並無孔雀綠訊號，見圖4.6(d)。最後，對送入修飾上孔雀綠金球的Hep G2細 胞做光學量測(量測參數：雷射光源633 nm、光柵600、共焦針孔200 μm、
積分時間5秒、量測波段1100-1800 cm-1)，OM見圖4.7(a)，拉曼光譜圖見
積分時間5秒、量測波段1100-1800 cm-1)，OM見圖4.7(a)，拉曼光譜圖見