B16F10 老鼠黑色素瘤細胞取自 NHRI 細胞庫 (台灣˙新竹)，這些 細胞利用 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY) 培 養 ， 其 中 含 有 10% 的 小 牛 血 清 (PAA Laboratories GmbH, Linz, Austria) 和抗生素。每次培養液約 1-2 天 更換一次直到細胞在培養皿上達到適當的滿度。繼代的培養我們 會將培養液吸乾，並利用 phosphate-buffered saline 清洗三次後加 入 Trypsin-EDTA solution (Gibco)。經過適當的震搖後移至 37 C 培養箱約 40 秒。取出後利用 phase-contrast microscope 去觀察細胞 確定其貼附情形喪失後再給予 10 mL DMEM 使 Trypsin 功能喪失 以解低其對細胞的傷害。離心 (900 G 五分鐘)後底部的沉積物再 利用 DMEM 將其打散並種殖在新的培養皿上。實驗前會先將 medium 改成 DMEM contain 1% serum 進行培養。
2. 電子順磁共振儀 (ESR)偵測自由基釋放
本實驗為了偵測各種化合物的抗氧化程度分為三個系統：
第一個系統是根據Hsiu-Chen Lin等人的方法 (Lin et al., 2008)，製 備250 μM的1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate (DPPH)在3 mL的
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甲醇裡，在此加入各種coumarin衍生物100 μM和vitamin C 100 μM，避光且在室溫反應一個半小時。接著以電子順磁共振儀 (ESR) 直接分析，和無加入coumarin衍生物的control DPPH相比，分析各 種coumarin衍生物和vitamin C抑制自由基產生的情形。
Percent of control value for ROS scavenger＝
signal height (coumarin derivatives) Signal-height (control DPPH)
第二個系統是根據 Hsiu-Chen Lin 等人的方法 (Lin et al., 2008)，
superoxide 是由 xanthine oxidase/ hypoxanthine 系統所產生。XO/HPX 系統的反應混合物包括 xanthine oxidase 0.4 U/mL 50 μL、
hypoxanthine 5 mM 50 μL、DTPA(diethylene triamine pentaacetic acid) 1.5 μL，再加入待測的 sample solution 50 μL(coumarin 衍生物 20 μM 和 vitamin C 20 μM)，反應三分鐘。本實驗以 DMPO (100 mM)當作 電子自旋捕捉劑。接著以電子順磁共振儀 (ESR)直接分析產生的 superoxide，和無加入 coumarin 衍生物的 solvent control 相比，觀察 各種 coumarin 衍生物和 vitamin C 抑制自由基的情形。
Percent of control value for ROS scavenger＝
signal height (coumarin derivatives) Signal-height (control)
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第三個系統是根據 Duen-Suey Chou 等人的方法 (Chou et al., 2005, Chou et al., 2009)，電子順磁共振儀 (ESR)直接分析 B16F10 老鼠黑 色素瘤腫瘤細胞受到 baicalein 刺激後所釋放之 Hydroxyl radical (OH〃)，再加入 coumarin 衍生物 20 μM 和 vitamin C 20 μM 觀測其抑 制的情形。本實驗以 DMPO (100 mM)當作電子自旋捕捉劑，並將 B16F10 打散成懸浮液。
ESR 偵測其 baicalein 刺激自由基之產生藉由下列的公式做比較 Percent of control value for ROS scavenger＝
signal height (coumarin derivatives) Signal-height (baicalein)
電子順磁共振儀 (ESR)的其他參數如下：microwave power, 20 mW;
modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude 1 G; sweep time, 100 G; time costant, 40.96 ms (20.97 ms); conversion time, 40.96 ms; sweep time 42s; receiver gain 2 × 104; number of data points, 1024.
3. 細胞存活率測定 (MTT assay)
我們將 B16F10 黑色素瘤細胞經過適當天數的培養後，以 1 × 105 細胞數/well 種殖在 96 well 盤上，培養一天待細胞貼附在底層後給 予 coumarin 衍生物 20 μM 和 Vitamin C 20 μM。給藥 1 小時後，給
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予 baicalein 50 μM。給藥 24 小時後，吸乾上面的培養液並將 MTT 以 0.5 mg/ml 的方式泡製在 DMEM 中給予 3 小時避光的 treatment，而 後將培養液吸乾後避光給予 DMSO 300 μL wash。30 分鐘後將每個 well 取出 200 μL 置於 ELISA 盤去測吸光值。此實驗目的主要是利 用活細胞內粒線體中 reductase 將黃色的 MTT 詴劑去還原成 formazan 的紫色結晶並堆積於細胞中，當加入 DMSO 使其溶解，
即可利用測定 OD 值得知細胞還原 MTT 的能力，此 OD 值代表了 活細胞內粒線體的 reductase 活性，即活細胞數目。每次詴驗各實 驗控制組皆會以 triplicate 方式種殖，並以平均值去做統計。
細胞存活百分比 (%) =
加藥 24 小時後的細胞吸光值
×100 (%) 控制組 24 小時後的細胞吸光值
4. 統計分析
實驗數據皆以平均值 ± 標準誤差 (mean ± SEM)表示，控制組與 實驗組之間的比較以 One-Way ANOVA 做統計分析。若 p < 0.05 則表示有意義的差別。
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