Buffer 配製 Glacial acetic acid 28.55ml
0.05M EDTA 50ml
H2O To 500ml
Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X)
Component Quantity required to make a 10X solution Tris Base 29.0g
Glycine 144.0g SDS 10.0g DI Water To 1.0L
Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)
Component Quantity required to make a 25X solution Tris Base 18.2g
Glycine 90.0g DI Water To 500mL
Tris-Glycine Transfer Buffer (1X) DI Water 760 mL 25X Transfer Buffer 40mL
MeOH 200mL
一、RAW 264 巨噬細胞株之培養
RAW 264 巨噬細胞，使用 75 T 培養瓶培養於含 10 % 胎牛血清
（fetal bovine serum﹐FBS），100 unit/ml penicillin 及 100 unit /ml
streptomycin 之 DMEM 培養液中，將 75 T 培養瓶置於 37 ℃ 恆溫且含 penicillin 及 100 unit /ml streptomycin，不含 10 % 胎牛血清（fetal bovin serum﹐FBS）之 DMEM 培養液。細胞數為 2x106 cell/well，並將其置於 37
℃ 恆溫且含有 5 % CO2 之培養箱中。兩小時後取出 96 well 培養盤，將 培養液抽出，更換成含 10 % 胎牛血清（fetal bovine serum﹐FBS），100 unit/ml penicillin 及 100 unit /ml streptomycin 之 DMEM 培養液，同時以 LPS (1 μg/m l ) 和不同濃度之 miyabenol A 處理 18 小時後，測量培養液 中的一氧化氮含量。
為了評估 miyabenol A 是否影響 iNOS 酵素活性，細胞先以 LPS 刺激
succinated-tetrazolium reductase system（Slater et al., 1963） 將 MTT 的 tetrazolium ring 轉變為非水溶性呈藍紫色的 formazan。藉由測量細胞培養 液中 formazan 產量所產生之顏色變化，即可快速判斷細胞存活及增生情
aprotinin 1 μg/ml、leupeptin 1 μg/ml、peptastatin 1 μg/ml、PMSF 1 M)並使 其均勻分布於 dish 表面。刮下細胞後，連同 lysis buffer 吸至離心管，反 應四十分鐘，再以超音波打碎機（0.5 cycle﹐amplitude 60 ％）作用 1 分
鐘。之後將含有蛋白質的離心管，置於 4 ℃ 下以 14000 rpm 離心 10 分
leupeptin; 1 μg/ml aprotinin ; 1 % NP40)並使其均勻分布於 dish 表面。利用 橡膠刮刀刮下細胞後，連同 lysis buffer 吸至離心管，反應四十分鐘，再以 超音波打碎機（0.5 cycle﹐amplitude 60％）作用 1 分鐘。之後將含有蛋白 質的離心管，置於 4 ℃ 下以 9500 rpm 離心 10 分鐘，上清液即為細胞質
RAW 264 細胞置於 3.5 cm dish 中，培養 24 小時後，先以不同濃度 的 miyabenol A 處裡 1 小時之後，分別加入 LPS (1 μg/m l ) 作用 10 分 鐘及 30 分鐘。之後抽去培養液，以冰 PBS 清洗兩次，加入適量的 total lysis buffer ( Tris-HCl 50 mM、NP-40 1 %、Na-deoxycholate 0.25 %、NaCl 150 mM、EDTA 1 mM、NaF 1 mM、Na3VO4 1 mM、aprotinin 1 μg/ml、leupeptin 1 μg/ml、peptastatin 1 μg/ml、phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) 1 mM) 反應 40 分鐘，以超音波打碎機（0.5 cycle﹐amplitude 60 ％）作用 1 分 membrane 先以 methanol 浸潤去極化，連同兩張 3M paper 放入 transfer buffer 中浸濕。操作時，重疊的順序由下往上依序為 3M paper﹐NC
anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase 或 anti-rabbite IgG
conjugated alkaline phosphatase 作用 1.5 小時，以 TBST wash 三次後，用 ECL 呈色。於暗房以 X-ray film 感光顯影，再以自動洗片機洗片。 mRNA spin min Kit 萃取 RNA。之後將萃取出的 iNOS mRNA sample，以 分光光度計於 260 nm 下測定吸光值來計算產物濃度。RNA 濃度計算公式
首先取 PCR 專用的試管（200 μl eppendoft）加入 2× Reaction Mix（25 μl）、Template RNA（1 μl）、10 μM Sense Primer（1 μl）、10 μM Anti- Sense Primer（1 μl）、RT/Platinum Tag Mix（1 μl）並加入 0.1 ％ DEPC 水使其 總體積為 50 μl，將試管置於自動溫度梯度調控機進行聚合反應，反應條件 壓條件下，跑 25 分鐘後，再以 Ethdium bromide（0.5 mg/ml）染液染 20 分鐘取出膠片，使用去離子水退染，於紫外光燈箱觀察 mRNA 與 marker 之相對位置，最後將此膠片以影像分析儀比較每一電泳條帶之亮度並將其 數值化。
七、測量 mRNA 的穩定性
RAW 264 細胞培養在 25 T 培養瓶中，待細胞長至八分滿時，加入 LPS（1 μg/ml）刺激細胞 5 小時，同時加入 actinomycin-D（0.1 μg/ml）
以及 miyabenol A（10 μM），作用 0、2、4、8 小時後取下細胞，於 4 ℃ 下 以 2700 rpm 離心 10 分鐘，使用 GE Healthcare mRNA spin min Kit 萃取 RNA，再進行 RT-PCR 分析。
八、統計分析
實驗數據以測量之平均值±平均值標準誤差（meam ± SE）表示。實驗 數據利用 Sigmaplot 10.0 統計軟體，進行無母數分析獨立樣本
Mann-Whitney test 進行之差異檢定。P < 0.05 視為有統計意義之差異。