文獻回顧

才會被活化（Schwacha et al., 2003）。細菌内毒素是革蘭氏陰性菌

(Gram-negative bacteria) 細胞壁的脂多醣結構，當細胞被分解與複製的時 候，就會被釋放出來。內毒素可存於自然環境中。其主要結構可分為兩部 分，分別為 Lipid A 與polysaccharides。Lipid A 則是使其具有毒性的結 構。研究發現 Lipid A 都可誘導宿主發炎反應（Glauser et al., 1994）。

Lipopolysaccharide-binding protein（LBP）為巨噬細胞表面的 receptor 其成 分為一種膜醣蛋白。當 LPS 與 LBP 結合後如再與另一膜蛋白 CD14 結 合，將可活化免疫細胞（Hailman et al., 1996），而後活化酪胺酸激酶（tyrosine kinase）、蛋白質激酶（protein kinase C）以及轉錄因子 NF-κB 與 MAPKs

（Sweet et al., 1996）的活化。當巨噬細胞被活化時會產生吞噬作用，伴隨 吞噬作用的進行而製造出含氮或含氧的毒性物質，如 NO、超氧自由基

（superoxideradical）、peroxylnitrite、過氧化氫（H2O2）、氫氣自由基（hydorxyl radical）及 HOCl 等，來幫助消滅病原菌。受到 LPS 刺激的巨噬細胞亦

能分泌許多發炎相關物質，包括 TNF-α、IL-1、IL-6、NO 和 PGE2，導致 人體發生敗血症（sepsis）、敗血性休克（sepsis shock）及全身性發炎等症 狀（systemic inflammatory response syndrome）（Guha and Mackman, 2001）。

不少研究已證實，在慢性發炎及感染之細胞組織，會有一系列 cytokines

（IL-1、TNF-α、IFN-γ）（Hanada et al., 2002）、酵素及訊息蛋白（signal protein）

生成。iNOS 及 COX-2 分別可催化 NO 及 PGs 大量產生，不但造成組 織發炎及併發敗血性休克，也使得慢性傳染病（例如：肺結核）及自體免 疫性疾病（例如：風濕性關節炎）等疾病症狀更加惡化（Nussler and Billiar, 1993; reviewed in Sautebin, 2000）。

二、一氧化氮及一氧化氮合成酶

慢性發炎的發生等（Hibbs et al., 1987; Moncada et al., 1991; Salerno et al., 2002）。但是當一氧化氮濃度過高，則會產生過氧化的自由基，而造成細 胞毒性、發炎反應等負面影響（MacMicking et al., 1997; Liaudet et al., 2000）。另外，一氧化氮的過量產生，和敗血性休克及糖尿病有關

（Christopherson and Bredt, 1997; Harrison, 1997）。一氧化氮與超氧自由基 作用，生成強氧化劑 peroxynitrite 而對組織細胞產生傷害（Higgs et al., 1991; Ohshima and Bartsch, 1994）。空氣中的一氧化氮與氧氣作用而產生二

氧化氮（NO2），在水溶液中則可轉變成 nitrite 與 nitrate。nitrate 可經 由 nitrate reductase 作用轉變成 nitrite，因此一般使用 Griess reagent 測量 NO 穩定的產物 nitrite（Privat et al., 1997）。NO 是體內 L-arginine 在 NADPH 與 O2 輔助下，經由一氧化氮合成酶作用產生 L-citrullin 和 NO

（Konwles and Moncada., 1994）。而這些 NOS 依其功能性的不同分為三 種 isoform 表現: 第一種存在於 endothelial cells、epithelial cells 及 cardiac myocytes 的 endothelial NOS（eNOS）。第二種主要存在於 neuronal cells 及 skeletal muscle cells 的 neuronal NOS （nNOS）。第三種存在於巨噬細胞 macrophages、hepatocytes、smooth muscle cells，經由誘導才能產生的 菌的 LPS 或 cytokines 刺激，會促使細胞產生 iNOS（Fang, 1997）。當 細胞持續增加 iNOS 的生成，一氧化氮被大量產生時，如無適當的藥物將 其抑制，則會引起細胞毒性及低血壓休克等現象（Beutler et al., 1989; Nathan et al., 1997）。許多的研究認為，會造成低血壓休克或是敗血症的一氧化氮 合成酶與發炎症狀的產生具有極大的關係（Laskin and Pendino, 1995;

MacMicking and Nathan, 1997）。究竟 LPS 是經由何種訊息傳遞路徑，將 訊號由細胞膜傳至細胞核來誘導 iNOS 的表現，本論文將使用 RAW 264 巨噬細胞，來探究 LPS 引起的 iNOS 表現的訊號傳遞路徑。

三、IκB kinase （IKK）/NF-κB 途徑

NF-κB 是調節 pro-inflammatory gene expression（TNF-α、IL-1β、IL-6、

IL-8、iNOS 及 COX-2）的重要轉錄因子（Jeon et al., 2000; Xie et al., 1994;

Zhou et al., 2002）。當巨噬細胞上的 receptor 受到適當的刺激後，會活化 細胞內的訊息傳遞，以增加 cytokines 的基因表現（Ghosh et al., 1990;

Zhang and Ghosh, 2001）。此過程會誘導轉錄因子 NF-κB 的活化（Rothwarf and Karin, 1999; Xie et al.,1994）。NF-κB 廣泛的參與發炎反應、免疫反應、

細胞分化和細胞凋亡（Kaltschmidt etal., 1997; MacMicking et al., 1997; Tong and Perez-Polo, 1995）。在未受刺激的細胞中大多數的 NF-κB 會存在細胞 質中與抑制性蛋白 IκB 結合而不具有活性。NF-κB 由 P50、p65 兩個 subunit 與 IκB 所構成，形成不活化的 NF-κB/IκB 複合物（Malek et al., 2001; Tam and Sen, 2001）。一旦細胞接受到刺激後（例如：LPS 造成的敗 血性休克及發炎反應），使得 IKK 活化進而磷酸化 IκB-α，IκB-α 與 p50 和 p65 分離而活化 NF-κB （Xie et al., 1994）。分離的 IκB-α 受到 26 S proteasome 的 ubiquination 作用而分解；NF-κB 則進入細胞核中與特定基 因上 promoter 之 NF-κB binding site 結合，影響下游基因的轉錄作用以調 控發炎或免疫反應 （Brown et al., 1995; Siebenlist et al., 1994）。IκB kinase

（IKK）是一個大的複合物，由 IKK-α、IKK-β 及 IKK-γ dimer 形成以調 控 NF-κB 的活化狀態。（Miller and Zandi, 2001; Xie et al., 1994）。其中 IKK-α 和 IKK-β 為 catalytic subunit，能催化 ATP 上的磷酸根轉位到 IκB-α 上，而 IKK-γ 為 regulatory subunit（Israel et al., 2000; Miller and Zandi, 2001）。當細胞受到 cytokines 或是過度表現的 kinases 刺激時，IKK

便會被活化（Israel et al., 2000）。因此，本論文中將探討 IκB kinase （IKK）

/NF-κB 在 LPS 誘導 RAW 264 巨噬細胞引發 NO 產生及 iNOS 表現的 訊號傳遞路徑中是否也扮演重要的調節角色。

四、Mitogen Activated Protein Kinases（MAPK）途徑

當巨噬細胞受到 LPS 刺激時，細胞內訊息傳導路徑誘發 iNOS 表現 的過程中，有許多訊息傳遞因子的參與。整個訊息的傳導，從細胞膜經過 細胞質，一直傳到細胞核中，其中最主要的就是 MAPK 路徑 （Shapira et al, 1994）。MAPK 是 serine-threonine 的 protein kinases，可以調節許多生 理反應，並具有受外界刺激而活化的功能。經由 LPS 活化的 MAPK 路徑 主要以 p38、extracellular signal-regulated kinase（ERK）及 c-jun N-terminal kinase（JNK）（Schumann et al., 1996; Sweet et al., 1996）三種 MAPK 都 能磷酸化並活化下游的轉錄因子。研究報告指出，ERK1/2 其可受MAPKK

（MEK）、MAPKKK（Raf, MEKK1）磷酸化（Gonzalez et al., 1992）；p46/54 JNK 會被 MAPK kinase 4 （MKK4/SEK-1）和 MKK7 活化；而 p38 則 經由 MKK3 及 MKK6 來活化（Gonzalez et al., 1992; Roger et al., 1993）。

受到磷酸化的 MAPK 則會分別活化其下游的 protein kinases 及 transcription factor。磷酸化的 ERK 會作用到 Elk-1 與 SRF（serum response factor），結合於 SRE （serum response element）binding site 加 速基因的轉錄（Watson et al., 1997）；JNK MAPK 會磷酸化 c-Jun、Elk-1、

activating transcription factor（ATF-2）等轉錄因子調控發炎基因（Su and Karin, 1996）；而 p38 MAPK 除了會活化 ATF-2 （Chen et al., 1998）、

EIk-1 （Raingeaud et al., 1996）之外，也會經由活化下游的 MSK1 （mitogen and stress activated protein kinase-1）來磷酸化 CREB（cyclic AMP responsive element-binding protein）轉錄因子，促使基因的表達。

五、AP-1（activating protein-1）途徑

AP-1（activating protein-1）是 iNOS promoter 上的轉錄因子，其組成 主要是由 homodimers（c-Jun 和 c-Jun）及 hetrodimers（c-Jun 和 c-Fos）

等形式組成。目前至少有三種 Jun 蛋白質（c-Jun、Jun B 和 Jun D），四種 Fos 蛋白質（c-Fos、Fra-1、Fra-2、Fos B）（Karin, 1997）。當巨噬細胞受 到 LPS 或 cytokines 刺激而活化，MAPKs 中 JNK 磷酸化而活化下游的 c-Jun 轉錄因子進而調控 iNOS mRNA 表現。

六、Phosphatidylinositol 3-kinase

PI3K

途徑

PI3K 屬於 lipid kinase 的一種，其為一 heterodimer 分為 p85及 p110 兩個 subunit，p85 subunit 稱為 regulatory subunit，p110 subunit 稱為 catalytic subunit，當 p85 磷酸化時會與 p110 相結合使得 PI3K 具有活性

（Okkenhaug and Vanhaesebroeck, 2001）。活化的 PI3K 可以調控許多細 胞內的反應。有報告證實 PI3K 的活化可引發 p44/42 MAPK 路徑的活化

（Eder et al., 1998; Xie et al., 2000）以及 PI3K 下游的 Akt 磷酸化 （Jiang and Zhang, 2002）進而影響 NF-κB 轉錄因子的活化達到調控 iNOS protein 的生成（Lee et al., 2008）。

七、環氧酵素（

）

Cyclooxygenase（COX）擁有三種異構物，分別為環氧酵素-1

（Cyclooxygenase-1, COX-1）、環氧酵素-2 （Cyclooxygenase-2, COX-2）

和環氧酵素-3（Cyclooxygenase-3, COX-3）。COX-1 主要功能在於調節一 般正常的生理作用。細胞給予一些生長因子、內毒素（Lee et al., 1992）或 細胞激素（Maier et al., 1990）的刺激後，COX-2 會大量的被誘導表現。

COX-2 基因包含了 SP-1、CRE、AP-2 和 NF-κB 等轉錄因子 binding site

（Kosaka et al., 1994; Sirois et al., 1993），而 LPS 刺激巨噬細胞表現 COX-2 的訊息傳遞途徑，透過 MAPKs 活化 transcription factor，進而促 使 COX-2 基因表現。在 2002 年 Chandrasekharan 於心臟以及主動脈發 現一種新的環氧酵素稱作 COX-3 （Chandrasekharan et al., 2002）。