實驗材料

本研究的草莓葉片，是由國立台灣大學植物病理與微生物學系 鍾嘉綾 助理 教授實驗室幫忙種植並接種草莓炭疽病病原菌

3.1.1 植物栽培

本研究所用的草莓品種為桃園三號，是由日本引進“豐香”育種為桃園一號 後，經自然雜交實生後代中產生 (李窓明，2014)。草莓栽培於室內的植物生長箱當 中，草莓母株種植於裝有培養土的塑膠盆中 (直徑 9 cm) 。用於種植草莓的培養土 成分為泥炭土 (Peat)、珍珠岩 (Perlite) 與蛭石 (Vermiculite)，混合的體積比為 1：1：1，環境溫度為 25 ℃，60~70%的濕度，光週期為每天 24 小時當中，16 小 時的光照。施肥方法為每天稀釋 3000 倍的花寶 2 號。子株分離自母株的匍匐莖，

子株種植環境為攝氏 25 度，相對溼度 60%的環境，光週期為 8 小時。經過 12~13 天後，每株植物會有 4 到 5 片葉子，而摘取第二與第三位置的葉片以進行後續的 實驗，整個種植實驗的流程所需天數為 30 天。

3.1.2 葉片前處理及固定

因為目前的實驗需要固定的樣本，並且能夠預測葉片在不同時期的發病情形，

因此我們將葉片剪下來，放入直徑 15 公分的無菌培養皿，底部平舖三層已滅菌的 擦手紙，利用 pipet 滴入 7 mL 的無菌水保濕。最後將草莓葉片平鋪於培養皿中。

為了延緩葉片的枯萎速度，葉片下方莖部的切口以無菌濕潤擦手紙包覆保濕，如圖 3-1。

圖 3-1 葉片放置方式

另外，因葉片會有捲曲的現象，我們製作一黑色固定環圈，其環圈的材質是以 黑色霧面壓克力所製成，環圈的厚度為 5 mm，外徑直徑 138 mm，內徑直徑 130 mm，詳細尺寸如圖 3-2 所示。並使用線徑 0.2 mm 透明釣魚線綁在環圈內側的凸 型槽上，固定環完成後，為避免透明釣魚線會造成反光，我們將釣魚線以鐵樂士 109 黑色系列的噴漆噴黑，盡量減少光照造成的反光，為了避免掉漆，我們一共噴漆兩 次，繼第一次噴完漆後，等漆全乾後，再噴第二次漆。最後整個固定環消毒後，方 在壓在葉片上方，以利利用釣魚線將葉片壓平。

圖 3-2 固定環尺寸

3.1.3 接種處理

病原接種的方式有二：一為噴霧式接種法 (Spray inoculation)，過將製備好的 孢子懸浮液，以 10~15 psi (1 atm = 14.7 psi) 之強度進行每一葉面的噴灑；對照組 則以 0.02% Tween 20 的無菌水依實驗組同樣的方式進行噴灑處理。另一種接種方 式則為點接方式 (Spot inoculation)，在無菌操作台環境下，切取病原菌產孢之菌塊，

平貼於植物葉面上，對照組則切取無菌之馬鈴薯瓊脂洋菜膠塊，同樣平貼於葉片表

圖 3-3 接種流程圖

3.1.4 後續保濕作業

隨著拍攝的時間拉長，擦手紙會沒有濕度，如果不繼續加水，葉片會乾掉，因 此我們會定期 (每日乙次) 幫擦手紙加水，加水的方式為對每一個樣本分別加些許 水，使用 Pipet 吸取 800 μl 的二次水，分散在樣本的四周跟包覆莖部的擦手紙，

不滴水在葉片上。