液，離心下來之細胞溶於 40%之 Percoll 層析液中，並緩緩加入到 70%之 Percoll 層析液上方，之後以 1200xg 在 25 度環境下 25 分鐘離心，肝內淋巴細胞在離心 完之後會在 40%/70%的 Percoll 層析液界面上，吸取之後加入 10c.c.的 HBSS 清洗 以 4 度離心 400xg 10 分鐘，取出細胞沉澱供分析或培養使用。
4. 流式細胞儀
小鼠細胞表面受體以 BV421-conjugated mouse CD3, BV510-conjugated anti-mouse CD8, PE-conjugated anti-anti-mouse PD-1, PE-Cy7-conjugated anti-anti-mouse Tim-3, APC-conjugated anti-mouse Tim-3, PE-Cy7-conjugated anti-mouse PD-1 染色；細胞 激素以 PE-conjugated anti-mouse IFNγ 染色。細胞表面受體染劑以 1:500 稀釋並於 含有 2% FBS 之 DPBS 細胞懸浮溶液當中染色 30 分鐘，細胞激素的染色在細胞表 面受體染色結束後以eBioscience™ Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set 固定並且打破細胞進行細胞內染 IFNγ，染色結束分析細胞表面受體、細胞激 素之表現情形，以 FlowJo 軟體分析所得到之流式細胞儀檔案。
5. T 細胞醣類攝取效率測定、粒線體膜電位、超氧化物測定
實驗鼠肝內淋巴細胞、脾臟細胞在 37 度環境中 DPBS 溶液內加入
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG) 20μM 培養 30 分 鐘，流式細胞儀偵測同時間內細胞攝取之 2-NBDG 螢光強度分析細胞從外界攝取 醣類之相對效率；肝內淋巴細胞在 37 度環境中含 2% FBS 之 DPBS 溶液內以 JC-1 線粒體膜電位探針 20μM、tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE)試劑 200nM 或MitoTracker™ Deep Red FM 粒線體深紅色螢光探針 100nM 染色 30 分鐘並以流 式細胞儀偵測整體螢光強度分析粒腺體膜電位變化。
6. T 細胞共抑制受體配體體外處理、粒線體抗氧化劑處理以及細胞激素產生測 定
實驗鼠脾臟淋巴細胞以 Biolegend MojoSortTM Mouse CD8 T Cell Isolation Kit 分離 出 CD8+ T 細胞，並於 37 度環境中含有培養於 10% FBS、外加 glutamax 1mM、
sodium pyruvate 1mM、IL-2 之 RPMI1640 於 CD3 抗體 Pre-coated 的 96 孔盤中 48 小時，之後置換於 CD3 抗體、PD-L1 或 Ceacam-1(10μg/ml) Pre-coated 的 96 孔盤
中 48 小時，經過抗 PD-1、抗 Tim-3 抗體(10μg/ml)或粒腺體抗氧化劑 10 μM 之處 理，以流式細胞儀測定粒線體膜電位、T 細胞 IFNγ 產生之比例。
7. 海馬微量細胞代謝分析儀
實驗鼠脾臟淋巴細胞以 Biolegend MojoSortTM Mouse CD8 T Cell Isolation Kit 分離 出 CD8+ T 細胞，於 37 度培養於含有 10% FBS、外加 glutamax 1mM、sodium pyruvate 1mM 之 RPMI1640，實驗處理之後轉移至 96-well polystyrene Seahorse plates 於 RPMI1640(不含 FBS)並以 Seahorse XFp Analyzer 機台處理 Mito Stress kit 試劑並偵測在 oligomycin (1 mM), FCCP (1.5mM) and antimycin A/rotenone (1 mM/0.1mM)處理之下細胞的氧消耗速率(OCR)變化圖。
8. 細胞免疫斑點法(ELISpot)
實驗小鼠肝內淋巴細胞加入 ELISpot 白色盤中，以 CTL 無血清培養基加入 glutamax 1mM、sodium pyruvate 1mM、IL-2 培養並以 B 型肝炎核心蛋白胜肽再 刺激以及抗氧化劑 MitoTEMPO、共抑制受體抗體 anti-PD-1, anti-Tim-3 處理 37 度 24 小時，之後以 ImmunoSpot® Kits Mouse IFN-γ Single-Color ELISPOT 進行偵測 IFN-γ 產生之班點數，以細胞免疫斑點影像分析儀計算 ELISpot 白色盤每格斑點 形成之數目。
實驗材料：
Glutamax Gibco, USA
Sodium pyruvate Sigma, St.Louis, USA
ImmunoSpot® Kits Mouse IFN-γ Cellular Technology Limited (CTL), Single-Color ELISPOT Cleveland, USA