吸收不良，降解速率快及高代謝率造成為，故為了增加薑黃素的利用率，於是開 發了一種奈米型藥物載體，如微脂粒(liposomes)[22]、微胞(micelles)、奈米微粒 (nanoparticle)、水膠 (hydrogel) 等藥物輸送系統。在此類的藥物輸送系統中發現 能增加薑黃素的溶解性，也提高了穩定性與生物利用度，而也改善細胞的攝取，
提高癌細胞的治療結果。
第三章 實驗材料與方法
3-1 實驗材料
(1) 1,6-diisocyanatohexane ; Sigma-Aldrich (2) Triethanolamine,98% ;Panreac
(3) N,N-dimethylformamide(DMF) ; J.T.Baker (4) Ethyl ether,99.7% ;J.TBaker
(5) Thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT) ; Alfa (6) Ethyl isocyanatoacetate,98% ; Arcros Organics (7) Chlorform ; Sigma
(8) 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimide(EDC) ; Alfa aesar (9) N-Hydroxysuccinimide(NHS) ; Alfa aesar
(10) Polylactide-co-glycolide(PLGA) ; Sigma (11) Dimethyl sulfoxide(DMSO) ; Sigma (12) Dialysis membranes,3500MWCO ; (13) Dichloromethane ; J.T.Baker
(14) n-Hexane ; Macron-Chemical 3-2 實驗器材
(1) 電磁加熱攪拌器; Heidolph,MR-Hei-Standard,Germany (2) 微量電子天平;Sartorius,TE214S,Germany
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(3) 離心機; HSIANGTAI
(4) 超音波震盪器;Prema,DC-400,Germany (5) 傅利葉紅外線光譜儀; PERKIN-ELMER-824 (6) 核磁共振光譜儀; Bruker 200 MHz NMR (7) 雙光束分光光譜儀; HITACHI U-2900 (8) 冷凍乾燥機; KINGMECH-FD2-6P (9) 透析膜; Cellu Sep
(10) 迴轉濃縮機; Buchi Rotavapor RE111,Switerland (11) 均質機; CHEMIST SCIENTIFIC CORP
3-3 實驗流程
合成 PUAD 合成 PUAD-PLGA
PEOH-FOL
偵測 PUAD-PLGA 結構：
a. IR b. NMR
PUAD-PLGA 包覆薑黃素能力測試：
細胞毒性測試-MTT 分析
PUAD-PLGA 包覆薑黃素 使用 UV 測其包覆率及包覆量
6
3-4 兩性共聚物合成
3-4.1 製備樹枝狀聚胺基甲酸酯 (PUAD) 高分子
第一步將反應物 Triethanolaminec 和 1,6-diisocyanatohexane 以莫耳數比 1：
8 及適量的 DMF 加入雙口反應瓶內，並通入氮氣，加熱到 60℃(±3℃)、250rpm 攪拌，反應時間為三小時，待反應時間到後，反應物由正己烷進行離心純化，分 離出透明的沉澱物為 G 0.5 。取樣測 FT-IR 確認產物是否已反應成功，再進行 下一個合成步驟。
N U
U U
NCO
NCO OCN
N
HO OH
HO
Triethanolamine
N N
O C
C O
1,6-Diisocyanatohexane
stirring for ３hrs at 60℃
Ｕ:Urethane group
R N H
C O
O R : -(CH2)2 -:-(CH2)6
-G0.5
圖 1、G0.5 PUAD 合成流程圖
7
第二步將反應物 G 0.5 及 Triethanolamine 以莫耳數比 1：8 及適量的 DMF 加入雙口反應瓶內，並通入氮氣，加熱到 60℃(±3℃)、250rpm 攪拌，反應時間 為三小時，待反應時間到後，反應物由乙醚進行離心純化，分離出透明的 G1.0 沉 澱物。取樣測 FT-IR 確認產物是否已反應成功，再進行下一個合成步驟。
N U
U U
NCO
NCO OCN
N
HO OH
HO
Triethanolamine G0.5
stirring for ３hrs at 60℃
N Ud
Ud Ud
N N
N
OH
OH
HO OH
HO
OH
Ｕ:Urethane group
R N H
C O
O R
Ud :U-(CH2)6-U : -(CH2)2
-G1.0
圖 2、G1.0 PUAD 合成流程圖
8
stirring for ３hrs at 60℃
Ｕ:Urethane group
R N OCN NCO
NCO
NCO NCO
OCN Ud :U-(CH2)6-U
圖 3 、G1.5 PUAD 合成流程圖
9
第四步將反應物 G 1.5 和 Triethanolamine 以莫耳數比 1：10 及適量的 DMF 加入雙口反應瓶內，並通入氮氣，加熱到 60℃(±3℃)、250rpm 攪拌，反應時間 為三小時，待反應時間到後，反應物由乙醚進行離心純化，分離出透明的 G 2.0 沉澱物。取樣測 FT-IR 確認產物是否已反應成功，再進行下一個合成步驟。
圖 4、G2.0 PUAD 流程圖
10
Ｕ:Urethane group
R N
stirring for ３hrs at 60℃
N NCO NCO
OCN
11
第六步將反應物 G 2.5 和 Triethanolamine 以莫耳數比 1：50 及適量的 DMF 加入雙口反應瓶內，並通入氮氣，加熱到 60℃(±3℃)、250rpm 攪拌，反應 時間為三小時，待反應時間到後，反應物由乙醚進行離心純化，分離出透明的 G 3.0 沉澱物。取樣測 FT-IR 確認產物是否已反應成功，再進行下一個合成步驟。
圖 6、G3.0 PUAD 合成流程圖
12
Ｕ:Urethane group
R N
stirring for ３hrs at 45℃
N
Ethyl isocyanatocetate
C
13
Ｕ:Urethane group
R N
stirring for 5hrs at 60℃
N
G3.0-NH2 N
14
於室溫下反應 24 小時，攪拌速度設 300 rpm ，使得 PLGA 之羧基脫去其 OH 基，PLGA 之 NH 基脫去一個 H 原子，使兩者結合形成醯胺鍵，後以透析的 方式將產物純化，使用透析膜 (MWCO：12000-14000) 透析 24 小時，將上清 液冷凍乾燥後，可得到最終產物 G 3.0 PUAD-PLGA 。
圖 9、PUAD-PLGA 合成示意圖 3.4-3 微胞的製備溶劑蒸發法
利用溶劑蒸發法來探討微胞對於 curcumin 包覆效率之研究。秤取不同比例 之材料 (mg) 與不同比例之 curcumin (mg) ，依序為 10 比 5、10 比 10、10 比 20 分別置於 20 mL 的樣品瓶內，共同溶於 1 ml 丙酮中，並震盪、攪拌至隔夜，
再緩慢滴入 5 倍 DI water ( MQ 水)中，於室溫緩慢攪拌六小時，並打開瓶蓋讓 丙酮揮發，再以迴轉濃縮儀抽三十分鐘左右，抽取剩下殘餘的丙酮溶劑，將樣品 移置到微量離心管中進行 9000rpm、十分鐘離心後，將上清液取 100μl 至樣品 瓶加入 900 μl 丙酮，稀釋 10 倍後，以 UV 測定未包覆的藥物濃度含量，設 426 nm 對樣品進行光吸收密度測量，數值對照標準曲線後，可得知未被包覆的 curcumin 藥物濃度，並探討在何種比例下材料包覆藥物的能力最佳。
Polymeric micelle PLGA-COOH
(Hydrophobic)
EDC/NHS
PUAD (Hydrophilic)
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圖 10、薑黃素的標準曲線 利用以下兩個公式來測得藥物包覆效率與包覆藥物含量：
Eneapsulation rate (%) =
x 100%
Loading capacity (mg/mg) =
× 100%
3-4-4 FT-IR 結構分析
紅外線光譜儀的原理是分子中的官能基產生分子間振動或轉動時，會吸收適 當的紅外光能量而得到的光譜， FT-IR 的原理是利用干涉儀產生干涉光譜經傅 利葉轉換成 IR 的光譜。由 IR 光譜中可以得到共聚物官能基的振動光譜及定量 的分析。
紅外光運用在化學分析的領域上時，如將設定某一頻率範圍（通常在 4000 – 400 cm-1 之間）的紅外光通過代測樣品，偵測被吸收掉的紅外光頻率，來推測產 物的官能基是否正確。
偵測前會先將樣品溶於氯仿溶劑中，適當滴在 KBr 鹽片上，溶劑揮發後掃 瞄，判斷官能基的位置。
3-4-5 核磁共振光譜儀 (1H-NMR) 分析
觀測原子的方法是利用氫原子核磁共振光譜儀 (1H-NMR) ，來鑑定兩團聯 共聚物之化學結構。核自旋本身的磁場，在外加磁場下大多數核自旋會處於低能
y = 0.1488x - 0.0587 R² = 0.9994
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 10 20 30 40 50 60
O.D.426
curcumin 濃度(µg/ml)
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量。再額外施加電磁場來干涉低能態的核自旋轉向高能態，再回到平衡態，而釋 放出射頻，此射頻波的頻率即兩能階間的差異，這就是 NMR 訊號。利用這樣 的過程，可以進行分析分子結構。將少量樣品放置於直徑 5 mm 的玻璃管柱中，
以各種氘取代氫溶劑溶解後，於核磁共振儀進行氫譜掃描。
3-4-6 粒徑分析
粒徑分析是以 (DTS Malvern Nano-ZS) 使用一 5 Mw 之低功率氦氖雷射光 (波長 633 nm) 做分析。其原理是利用粒子在水中所產生布朗運動，當雷射光打 到粒子時，會造成散射光頻率的改變，此散射光頻率的改變跟粒子的大小有關，
粒子大的運動頻率較粒子小的慢，所引起的波動頻率的改變也因較小的粒子所造 成的變化較小；因此透過偵測光強度波動頻率改變的現象，來判定水溶液中粒子 的粒徑大小，以 Einstein-Stokes 方程式來計算出粒徑大小。
Einstein-Stokes equation：
RH = kT/6πηDAV
RH：水合半徑 η：黏度（poise）
k：波茲曼常數 T：絕對溫度（k）
DAV：Brownian Diffusivity
3-5 細胞試驗
3-5-1 細胞種類
COS-7 細胞株：為一種經 SV40 轉型 (transform) 的非洲綠猴子腎臟表皮 細胞，其為貼覆性細胞，ATCC細胞編號為：CRL-1651。
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3-5-2 培養基配置
將兩瓶各 600 mL MQ 水滅菌備用。先將 DMEM 粉末 (13.4 g )溶於其中一 瓶 600 mL MQ水中，完全溶解後加入 2.2 g NaHCO3，攪拌使溶解。溶解後以 1 N NaOH 或 1 N HCL 調整 pH 值為 7.2 0.1。調整完後將水補至 1000 mL，
並以 0.22 μ 濾膜過濾到滅菌血清瓶中。細胞培養液需含 10% FBS 和 1%
penicillin、streptomycin、 amphotericin 抗生素，並保存於 4℃ 中。
3-5-3 細胞培養與繼代
培養於 flask 之細胞以顯微鏡觀察細胞生長的情況。當 flask 內之細胞達到 8 至 9 成滿，即可進行繼代。將 flask 中舊的培養基完全吸除後，以 5 mL 1X PBS 清洗整個培養區域，沖洗殘餘死去的細胞及廢棄物，再將 PBS 吸除，加入 1 mL Trypsin-EDTA，切起貼覆的細胞，將 flask 置於 37℃ 、5 % CO2 培養箱 5 分鐘，加入 4 mL 培養液終止 Trypsin-EDTA 作用，並和混合切除細胞混合均 勻。將溶液全部吸取放入 15 mL 離心管中，以 2000 rpm 離心 3 分鐘，直接吸 掉上層培養液，加入 5 mL 培養液並以微量吸管以抽取方式將底部的細胞團完 全打散，取 1 mL 細胞液加入 8 mL 新的培養液，放入 37℃、5 % CO2 培養箱 進行細胞培養。
3-6 MTT 分析細胞毒性測試
3-6-1 原理
MTT(3-(4,5-dImethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 分 析 是 一 種生物學上常用以測定細胞存活率或增殖作用的方法；其主要依賴核細胞內粒線 體中的 dehydrogenase 之作用將 MTT 之 tetrazolium 轉為紫色不溶於水的產 物 MTT formazan，結晶於細胞的粒線體中。當加入 DMSO 將其溶解，則可利 用 ELISA reader 測 OD 值 570 有最高的吸收值，藉 OD 值得知細胞還原 MTT 的能力 (formazan 形成量)，此讀值代表了粒線體的活性，亦間接代表活細
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胞的數目，故 MTT assay 可用作細胞存活率的指標[23]。
圖 11、MTT 與 NADH 的反應機制 3-6-2 實驗方法
將 COS-7 細胞種於 96 well 中，5000 顆細胞 / 100μl / well，培養於37℃、
5 % CO2 培養箱內至隔夜。隔天將舊的 medium 抽掉，換上不同濃度裝載藥物 的 Dendrimers 以及 Free 藥物 （1、5、10、25、50 μg/mL），裝載藥物的 Dendrimers 以 medium 當作溶劑配置各濃度，然而，薑黃素較不容於 medium ， 故會由含有 1 % DMSO的 medium 配置，並培養 24、48 小時。時間到後抽掉 含有 Dendrimers 的 medium，用 1X PBS 洗一次。加入含有 0.5 mg/mL MTT 的 medium，培養 2 小時。時間到後抽掉 medium，加入 100 μl DMSO 以 ELISA 測 OD 570 nm。
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