2-1 實驗材料
2-1-1 化學藥品與材料
Alpha Biosciences, Inc Trypto Soy Broth (TSB)
Amersham Biosciences 40%Arcrylamide
ECLTM Western Blotting Detection Reagents HRP/anti-M13 monoclonal conjugate
PVDF transfer membrane
Amresco®
Sodium Chloride
BDH Glycerol
DIFCO BactoTM Agar Tryptone Peptone Yeast Extract
Digital Gene
多胜肽序列的合成
GeneMark
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- ß-D-Galactoside (X-Gal) Isopropyl ß-D-Thiogalactoside (IPTG)
Gibco BRL
Ammonium Persulfate (APS) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Merck
Dimethyl formamide Glycine
Isobutanol
ß-Mercaptoethanol
Magnesium Chloride Hexohydrate Methanol
Phenol chloroform Sodium Azide
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Sodium Hydrogen Carbonate
di-Sodium Hydrogen Phosphate dehydrate Tween-20
New England BioLabs Inc.
Ph.D.-C7CTM Phage Display Peptide Library Kit
PIERCE
ImmunoPure® TMB Substrate Kit
Sigma Acetic Acid
Albumin from bovine serum (BSA) Bromophenol Blue
Diaminobensidine (DAB)
N,N’-Methylene-bis-acrylamide Tetracycline
USB Tris
台灣菸酒股份有限公司 95 % Ethanol
2-1-2 溶液與緩衝液
Isopropyl ß-D-Thiogalactoside / 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- ß-D-Galactoside (IPTG / X-Gal)：
取1.25 g IPTG 和 1 g Xgal 溶於 25 ml 的 Dimethyl formamide 中，儲存 於-20 ℃中，避光。
Tetracycline Stock：
取Tetracycline 溶於 ethanol 中，使其最後濃度為 20 mg/ml。
TBS Buffer：
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，經高壓滅菌後儲存於室溫中。
TBS+0.1 % Tween-20：
取經高壓滅菌的TBS，加入 0.1 % Tween-20。
TBS+0.5 % Tween-20：
取經高壓滅菌的TBS，加入 0.5 % Tween-20。
Blocking Buffer：
取BSA 加入 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) 中，使其最後濃度為 5 mg/ml，
再加入0.02 % NaN3，之後用 0.2 µm 的濾膜過濾，使其呈無菌狀態，
儲存於4 ℃中。
Elution Buffer：
取BSA 溶於 0.2 M Glycine 中，使其最後濃度為 1 mg/ml，pH 2.2，
再用0.2 µm 的濾膜過濾，使其呈無菌狀態，儲存於 4 ℃中。
1 M Tris (pH 9.1) PEG/NaCl：
20 % polyethylene glycol-8000，2.5 M NaCl，經高壓滅菌後，儲存於 室溫中。
TBS+0.02 % NaN3：
取TBS 加入 0.02 % NaN3，經高壓滅菌後，儲存於室溫中。
30 % Polyacrylamide/1 % Bisacrylamide：
5 g N,N’-Methylene-bis-acrylamide 加入 375 ml 40 %Arcrylamide，125 ml 一次去離子水混合均勻。
20 % SDS Solution
取10 g Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)，加入去離子水至 50 ml。
1.5 M Tris (pH 8.8)
取91 g 的 Tris 加入去離子水至 500 ml，調整 pH 值至 8.8。
1 M Tris (pH 6.8)
取61g 的 Tris 加入去離子水至 500 ml，調整 pH 值至 6.8。
10 % APS
取1 g Ammonium Persulfate，加入去離子水至 10 ml。
5X Sample Buffer：
取0.5 ml 1 M Tris (pH 6.8)，0.8 ml Glycerol，0.8 ml 20 % SDS
solution，0.4 ml ß-Mercaptoethanol，0.2 ml 0.05 % Bromophenol Blue 加入去離子水至10 ml。
SDS Running Buffer：
14.4 g Glycine，3 g Tris，1 g SDS 加入去離子水至 1 L。
Gel Stain Buffer：
1 g Coomassie Brilliant blue R250，100 ml Acetic Acid，400 ml
Methanol，加入去離子水至 1 L，再用 0.2 µm 的濾膜過濾，以去除不 溶的物質，儲存於室溫中。
Gel Destain Buffer I：
400 ml Methanol，100 ml Acetic Acid，加入去離子水至 1 L，儲存於 室溫中。
Gel Destain Buffer II：
50 ml Methanol，70 ml Acetic Acid，加入去離子水至 1 L，儲存於室 溫中。
PBS：
1.37 g Na2HPO4，0.35 g NaH2PO4，8.77 g NaCl，加入去離子水至 1 L，調整 pH 值至 7.4，儲存於室溫中。
PBS+0.1 % Tween-20
取1 ml Tween-20，加入 1 L 的 PBS 中。
Transfer Buffer：
5 mM Tris-base，192 mM Glycine 中加入 SDS，使其最後濃度為 1 g/L，
pH 8.3，儲存於 4 ℃中。
Diaminobensidine (DAB) 呈色劑：
取1.25mg DAB，50µl DMSO，2.95ml 0.1M 的 PBS 混合均勻，要進 行呈色時再加入5µl 30 ％ H2O2。
2-1-3 菌株
Vibrio alginolyticus (ATCC 17749) Vibrio anguillarum (ATCC 19264) Vibrio damsela (ATCC 33539) Vibrio furnissii (ATCC 35016) Vibrio harveyi (ATCC 14126)
Vibrio hollisae (ATCC 33564) Vibrio ordalli
Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802) Vibrio salmonicida (ATCC 43839) Vibrio vulnificus (ATCC 27562)
以上購自於財團法人食品工業發展研究所
E. coli ER2738：
用來作為噬菌體感染的宿主，為 F＋的菌株，帶有一個含有抗 tetracycline 基因的 mini-transposon，所以有 F＋的菌株可以用含有 tetracycline 的 LB Plates 篩選出，將購自 New England BioLabs 的 phage display peptide library kit 中所附的 E. coli ER2738 塗盤培養於 LB-Tet Plates 上，37 ℃ 隔夜培養，之後放於4 ℃作為儲存。
2-1-4 培養基
Trypto Soy Broth (TSB) + 1.5 % NaCl
30 g TSB，15 g NaCl 加入去離子水至 1 L，經高壓滅菌後，儲存於 4 ℃ 中。
LB Medium
10 g Tryptone Peptone，5 g Yeast Extract，5 g NaCl 加入去離子水至 1 L，經高壓滅菌後，儲存於 4 ℃。
LB/IPTG/Xgal Plates
取10 g Tryptone Peptone，5 g Yeast Extract，5 g NaCl，15 g Bacto Agar 加入去離子水至1 L，經高壓滅菌後，待其冷卻至 70 ℃以下再加入 1 ml IPTG/Xgal，儲存於 4 ℃中，避光。
Agarose Top
取10 g Tryptone Peptone，5 g Yeast Extract，5 g NaCl，7 g Bacto Agar，
1 g MgCl2˙6H2O 加入去離子水至 1 L，經高壓滅菌後，儲存於室溫中，
每次使用前以微波爐微波2 分鐘使其熔化。
LB/Tet Plates
取10 g Tryptone Peptone，5 g Yeast Extract，5 g NaCl，15 g Bacto Agar 加入去離子水至1 L，經高壓滅菌後，待其冷卻至 70 ℃以下後加入 1 ml Tetracycline Stock，儲存於 4 ℃中。
2-1-5 儀器
迴轉式震盪恆溫培養箱 (Firstek Scientific, orbital shaking incubator Model-S300R)
紫外光/可見光分光光譜儀 (Amersham Pharmacia Biotech, ultrospec 3100 pro)
高速離心機 (Beckman, Allegra 21 Series) 電泳槽 (Mightly Small II SE250/SE260)
DNA 定序儀 (Perkin Elmer, ABI Prism 377 DNA Sequencer)
半乾式轉漬槽 (Amersham Biosciences semi-dry transfer unit Hoffer TE 70)
震盪器 (LAB-LINE, orbit shaker)
PCR (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 9700) 超音波細胞震碎機
微量旋轉式真空濃縮機 (EYELA, rotary vaccum evaporator N-N series)
2-2-1 以 Ph.D.-C7C 作為胜肽來源，篩選對 Vibrio harvey 具親和力之系統
Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library 從 New England BioLab 所購入 (NEB Cat. No. #E8120S)。其主要是將隨機合成的 DNA 序列 插入噬菌體M13mp19 的 gIII 前端產生噬菌體隨機胜肽庫，其涵蓋了 207 (約 1.2×109) 種不同的多胜肽序列，並且在這段隨機多胜肽序列的 前後各有一個半胱胺酸，這兩個半胱胺酸會自動形成雙硫鍵，使得噬 菌體所表現出來的逢機多胜肽具有環狀的構形；而在第一個半胱胺酸 前有一個丙胺酸，在第二個半胱胺酸之後則有一段 Gly-Gly-Gly-Ser 的序列，在此之後才是野生型的 pIII 序列，在購回的 Ph.D.-C7C 噬 菌體逢機胜肽庫中，每一種多胜肽序列的濃度為~200 copies/10 µl，
而總濃度為2×1013 pfu/ml。
2-2-1-1 合成的 Vibrio harvey haemolysin 之製備
根據 V. harveyi 的溶血素經由電腦進行比對後，選擇較具特異性 的第6 至第 26 個胺基酸交由 Digital Gene 公司進行合成，合成的 Vibrio harveyi 溶血素多胜肽序列如下：
[(H2N-TLLSALLLPLSFAHAAEPTL)2-Lys]4-Lys2-Lys-βAla-OH 溶於一次去離子水中，使其最後濃度為100 µg/ml。
2-2-1-2 弧菌的培養及目標蛋白質的製備
所有的弧菌皆培養於 TSB 含 1.5 % NaCl 中，在做親和性篩選的
前一天從-20 ℃中取出各菌株的 stock，分別接種於 3 ml 的 TSB 含 1.5
% NaCl 培養液中，經隔夜 37 ℃的培養後使其 OD600＞1，再以超音 波細胞震碎機 (Sonicator) 分別將各個培養液內之菌體打破備用。
2-2-1-3 生物親和性選擇 (Bio-panning)
y 第一次的負向選擇 (Negative Selection)
將除了 Vibrio harveyi 外其他經超音波細胞震碎機打破的弧菌培 養液，取200 µl 分別加入 ELISA plate 的反應槽中，於室溫中放置一 小時，再以TBS 溶液洗 3 次，之後用 400 µl 封閉緩衝液 (blocking buffer) 將孔洞中未被抗原覆蓋的地方填滿，放於室溫中一小時，以TBS＋0.1
% Tween-20 緩衝液洗 6 次後加入 10 µl Ph.D.-C7C phage display peptide library，加上 100 µl TBS＋0.1 % Tween-20 緩衝液使其最後噬 菌體的量為2×1011，放於室溫中震盪一小時，然後把未和非目標抗原 結合的噬菌體移到下一個well 中，放於室溫中震盪一小時，如圖 2-2 所示，重覆相同的動作直到噬菌體對九株弧菌皆進行過負向選擇後，
將這些經過負向選擇的噬菌體取出，準備進行正向選擇。
圖2-2 負向選擇的示意圖
y 第一次的正向選擇 (Positive Selection)
將合成的 Vibrio harveyi 溶血素多胜肽及經過超音波細胞震碎機 處理過的 Vibrio harveyi 培養液取 200 μl/well 分別加入 ELISA plate 中，放於室溫中一小時，以TBS 緩衝液洗 3 次，之後用 400 µl 封閉 緩衝液 (blocking buffer) 將未被抗原覆蓋的地方填滿，放於室溫中一 小時，再以TBS＋0.1 % Tween-20 緩衝液洗 6 次，之後加入經過負向 選擇後的噬菌體，置於室溫中震盪一小時後，以TBS+0.1 % Tween-20 緩衝液洗20 次，接下來以 100 μl/well 沖提緩衝液 (elution buffer) 放 於室溫中震盪 10 分鐘，再以微量吸管劇烈沖吸將和抗原結合的噬菌 體沖提出，最後將沖提出的噬菌體以15 µl 1 M Tris (pH 9.1) 中和，準 備進行噬菌體的放大以及噬菌體效價的測定。
V. ang V. alg V. dam V. fur V. hol V. ord V. par V. sal V. vul 10 µl Ph.D.-C7C phage display peptide
library 加上 100 µl TBS+0.1% Tween-20 加入
y 噬菌體的放大
於前一天自 LB-Tet plate 中挑出單一菌落的 E.coli ER2738，養於 3 ml LB Midium 中，置於 37 ℃隔夜培養，之後將 E.coli ER2738 和 LB Midium 以 1:100 的比例稀釋成 20 ml（OD600約為0.1~0.3），然後 把經過正向選擇後的噬菌體加入，放於 37 ℃培養箱中培養 4.5 個小 時，再以10,000 rpm 在 4 ℃下離心 15 分鐘，取上清液加入 1/6 倍總 體積的PEG/NaCl，混合均勻後置於 4 ℃中隔夜，之後用 10,000 rpm 的轉速於4 ℃下離心 20 分鐘，將上清液倒掉，以 1 ml TBS 將沉澱的 細胞懸浮起來，再用10,000rpm 的轉速於 4 ℃下離心 5 分鐘，取上清 液加入 1/6 倍總體積的 PEG/NaCl 放置於冰上 1 個小時，之後以 10,000rpm 的轉速於 4 ℃下離心 20 分鐘，將上清液倒掉後再以同樣的 轉速離心2 分鐘，使用微量吸管確實將剩餘的液體去除，再用 200 µl TBS＋0.02 % NaN3緩衝液把沉澱的細胞懸浮起來，最後以10,000 rpm 離心1 分鐘以去除不溶的雜質，將上清液取至新的微量試管中存於 4
℃中備用。
2-2-2 噬菌體效價的測定
y 放大前的噬菌體效價測定
在前一天自 LB-Tet plate 中挑出單一菌落的 E.coli ER2738，養於 3 ml LB Medium 中在 37 ℃下隔夜培養，從其中取出 10 µl 的加入 3 ml LB Medium 中於 37 ℃培養至 OD600約為0.5，同時把 Agarose Top 用 微波爐加熱，以3 ml/tube 加於試管中，放於 50 ℃水浴槽中待用，而
經過正向選擇後的噬菌體以LB Medium 用十倍稀釋法稀釋至 105，之 後取稀釋101~105倍的噬菌體感染200 µl 的 E.coli ER2738，靜置 5 分 鐘後加入3 ml Agarose Top 中混合均勻，再把其倒入 LB/IPTG/Xgal Plates 中搖晃均勻，待其凝固後放於 37 ℃培養箱隔夜培養。
y 放大後的噬菌體效價測定
由於噬菌體在由UV 波長 240 nm 至 320 nm 間在 269 nm 有一個比較 大的吸收值，並且會隨著噬菌體濃度的改變而改變，可以由此波長下 的吸收值帶入公式換算出實際上噬菌體的數目，因此我們使用紫外光 /可見光分光光譜儀來測定放大後的噬菌體在波長 269 nm 下的吸收 值。首先取60 µl 放大後的噬菌體以 TBS 含 0.02 % NaN3緩衝液稀釋 為600 µl，並以 TBS 含 0.02 % NaN3緩衝液來歸零，最後將在波長269 nm 下所測得的吸收值帶入以下公式，再換算回稀釋前的濃度，便可 測定噬菌體的效價。
2-2-3 單一胜肽噬菌體的放大製備
於前一天自 LB-Tet plate 中挑出單一菌落的 E.coli ER2738，養於 3 ml LB Medium 中，置於 37 ℃隔夜培養，之後將 E.coli ER2738 和 LB Medium 以 1:100 的比例稀釋成 1 ml（OD600約為 0.1~0.3），再把 經過正向選擇的噬菌體，以和噬菌體效價測定相同的方法塗盤，37 ℃ 隔夜培養 12~16 個小時後挑單一噬菌斑，放於 37 ℃培養 4.5 小時，
噬菌體數目=
6407 A269× (6×1016)
再以10,000 rpm 在 4 ℃下離心 30 秒取上清液，儲存在 4 ℃中，準備 用作DNA 定序以及噬菌體的放大。
取 10 µl 離心後的上清液加入隔夜培養後經 LB Medium 以 1:100 的比例稀釋的20 ml E.coli ER2738 中，以之前所述的噬菌體放大步驟 進行放大。
2-2-4 墨點法 (Dot Blotting)
如圖 2-3 所示，PVDF 轉漬膜先以 100 % 甲醇活化 20 秒後，以 去離子水洗三次，再把合成的 Vibrio harveyi 溶血素多胜肽、經超音 波細胞震碎機打破的菌液或未被打破的菌液以 tip 點在膜上，其中以 噬菌體做為positive control，以 3 % BSA 作為 negative control，之後 以3 %溶於 PBS 緩衝液的脫脂奶粉將膜上未覆蓋抗原的位置填滿，放 於室溫中震盪一小時，以PBS + 0.1 % Tween-20 緩衝液洗 3 次，每次 5 分鐘，接著加入 10 µl phage 與 500 µl 0.1 % TBST，置於室溫中震 盪一小時，再以 PBS + 0.1 % Tween-20 洗 5 次，每次 5 分鐘，然後加 入稀釋5000 倍抗體 (anti-M13 conjugated-HRP antibody)，放於室溫中 震盪一小時，以 PBS + 0.1 % Tween-20 洗 6 次，每次 5 分鐘，最後以 Diaminobensidine (DAB) 呈色劑進行呈色，待反應適當時間後，以一 次去離子水將轉漬膜洗數次以終止反應。
圖2-3 點墨法的流程示意圖
2-2-5 酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA)
先將 200 µl 經超音波細胞震碎機打破的菌液以及分別當作正向 控制組 (positive control) 的噬菌體和負向控制組 (negative control) 的3 % BSA 加進 ELISA plate 中，放於室溫一小時，之後將菌液回收 後，接著以PBS 洗 3 次並拍乾，再以 400 µl 溶於 PBS 緩衝液中的 3 % 脫脂奶粉將未被抗原覆蓋的地方填滿，置於室溫中一小時，接著以 PBS+0.1 % Tween-20 洗 3 次並拍乾，再加入 100 µl 的噬菌體 (噬菌
Blocking with 3 % milk
Add 10 μl phage + 500 μl 0.1 % TBST
Add 5000x anti-M13 conjugated-HRP Ab
Add DAB as substrate to show the color
Spot sample on PVDF membrane
E
E
Wash with 0.1 %PBST, 3 times
Wash with 0.1 %PBST, 5 times
Wash with 0.1 %PBST, 6 times
體：TBS+0.1 % Tween-20=1：10)，放於室溫中一小時，接著以 PBS+0.1
% Tween-20 洗 6 次並拍乾，再加入 100 µl 稀釋 5000 倍的抗體 (anti-M13 conjugated-HRP antibody)，置於室溫中一小時，接著以
% Tween-20 洗 6 次並拍乾，再加入 100 µl 稀釋 5000 倍的抗體 (anti-M13 conjugated-HRP antibody)，置於室溫中一小時，接著以