結果與討論

3-1 以 Ph.D.-C7C 作為多胜肽庫來源，篩選對 Vibrio harveyi 具親合力之多胜肽

目前為止，噬菌體展示系統已被廣泛的應用於各領域之中，但至 今以此系統針對 V. harveyi 進行篩選之相關文獻尚未被發表，而本研 究目的是為篩選出和 V. harveyi 結合之多胜肽，因此在選擇篩選的目 標蛋白質時，首先考慮的是 V. harveyi 中重要的毒性因子，由於溶血 素為 V. harveyi 致病的決定因素 [50]，因此以實驗室已合成好的 V.

harveyi 溶血素多胜肽作為篩選目標，此段序列為 V. harveyi 溶血素 N 端前 25 個胺基酸所組成且其具有高特異性，除此之外，在本實驗中 另外還採用 V. harveyi 之菌體及經過超音波細胞震碎機打破之 V.

harveyi 培養液當做篩選的目標蛋白質。

3-1-1 以合成的 Vibrio harveyi 溶血素多胜肽序列當做篩選目標

在本實驗中，首先採用合成的 V. harveyi 溶血素多胜肽序列當做 篩選的目標，在經過五次負向選擇、正向選擇及噬菌體放大的循環後，以墨點法 (Dot Blotting) 來確認所篩出的噬菌體中是否具有多胜 肽是可以和合成的 V. harveyi 溶血素多胜肽序列、去除菌體的 V.

harveyi 培養液以及 V. harveyi 培養液結合，並以噬菌體當作正向控制 組及3 % BSA 當作負向控制組，將經過親合性選擇的噬菌體當作一抗，而二抗使用anti-M13 conjugated-HRP antibody，結果如圖 3-1 所示，總共篩選出三個樣本 (s5-c7c-e1-1、s5-c7c-e1-2 及 s5-c7c-e1-3)，

此三個樣本皆明顯地和合成的 V. harveyi 溶血素多胜肽序列結合，由 於溶血素在 V. harveyi 中是分泌至細胞外之蛋白質，但結果中卻無法 觀察到篩選出的多胜肽會和 V. harveyi 培養液以及去除菌體之 V.

harveyi 培養液結合。如此之結果並不利於將其應用至 V. harveyi 的檢 測上，推測此結果的原因可能為合成的溶血素多胜肽在完整的蛋白質

1. s5-c7c-e1-1 2. s5-c7c-e1-2 3. s5-c7c-e1-3

3-1-2 以打破的 Vibrio harveyi 培養液作為篩選的目標蛋白

由於以合成的 V. harveyi 溶血素多胜肽作為篩選的目標蛋白質之 策略失敗，因此改以 V. harveyi 之菌體做為篩選目標，期能從中篩選 出和 V. harveyi 菌體表面物質具結合能力之多胜肽。依之前所述的方 式，噬菌體多胜肽庫在經過五次的負向選擇、正向選擇及噬菌體放大 後以墨點法來觀察其與 V. harveyi 結合之情形。結果發現所篩選出的 多胜肽雖然會與 V. harveyi 菌體表面物質結合，但結合能力似乎不好 以致於結果的訊號很微弱 (未顯示數據)，如此一來將不適合於之後作為檢測的應用，因此之後直接使用V. harveyi 培養液 (包含菌體及釋放至培養液之胞外物質)將其以超音波細胞震碎機打破菌體後作為篩選目標，以期從中篩選出具結合能力之多胜肽。

首先將 V. alginolyticus、V. anguillarum、V. damsela、V. furnissii、

V. hollisae、V. ordalli、V. parahaemolyticus、V. salmonicida 和 V. vulnificus 分別以超音波細胞震碎機打破，並依照之前所述的負向選擇方法，將 Ph.D.-C7C 噬菌體逢機胜肽庫先進行負向選擇，之後再以打破的 Vibrio harveyi 培養液作為篩選目標物進行正向選擇，最後再將親合性 選擇後的噬菌體予以放大，如此的步驟循環五次後，以墨點法來初步確認篩選的結果 (圖 3-2)，總共篩選出三個樣本 (s5-c7c-vh-v、

s5-c7c-vh-1 和 s5-c7c-vh-2)，其結果顯示篩選到的噬菌體中確實具有和 V. harveyi 培養液結合的多胜肽。但由圖 3-2 的 b 和 c 看來似乎大多數 的多胜肽皆和菌體內的物質結合，而造成此結果的可能原因為菌體內的蛋白質多樣性較菌體外高出許多，因此菌體內蛋白質和噬菌體之多

胜肽相逢而結合的機率自然高出許多，反應訊號因此較強烈。初步篩式加入 Agarose Top 中倒在 LB/IPTG/Xgal Plates 上培養 12~16 小時後，由於噬菌體中的M13mp19 載體帶有 lacZ 基因，因此當其感染宿

1: s5-c7c-vh-v 2: s5-c7c-vh-1 3: s5-c7c-vh-2 a: 正向控制組

3-3 噬菌體單股 DNA 模版之純化並定序

將已放大並純化的 31 個單一胜肽噬菌體經加入數次 phenol chloroform (25：24) 並離心去除蛋白質後，以酒精沉澱法萃取出噬菌體之單股DNA，之後將萃取出的單股 DNA 依照 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Seguencing Ready Reaction Kit 之手冊的步驟，以及使用Ph.D.-C7C^TM Phage Display Peptide Library Kit 中所附的-96 定序引子作為定序用的引子，經 PCR 反應處理後送測，定序結果經由比對之後發現其多胜肽序列共有四種，樣本I 至 IV (表 3-1)。其中以樣本I 和 II 所佔數目最多 (93.6%)，而且分析兩者的胺基酸序列可以發現皆為 HXXWLP，因此推測可和此兩者結合之物質在結構上可能是相同或類似的。

Sample Peptide sequence The number of phage particle

I tgtcatcatcctccgtggcttccttgc

C H H P P W L P C 21 II tgtcattttgattggctgccttattgc

C H F D W L P Y C 8 III tgtctgccgcttaataatcggttgtgc

C L P L N N R L C 1 IV tgtaattcgactgctattatgacgtgc

C N S T A I M T C 1

total number 31

表 3-1 31 個單一噬菌體之單股 DNA 的定序結果

3-4 以酵素連結免疫吸附分析法觀察單一胜肽噬菌體和 Vibrio harveyi 結合的情形

將打破之 V. harveyi 培養液以及當做正向控制組的噬菌體與當做 負向控制組的 3 % BSA 加入酵素連結免疫吸附分析盤中，再以 blocking buffer 將未有抗原的地方填滿後，分別以四種多胜肽序列之噬菌體當作一抗，以anti-M13 conjugated-HRP antibody 作為二抗，之後以四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine, TMB）作為基質進行呈色，

再以2 M H₂SO₄終止反應，最後讀取其於波長 450 nm 下之吸光值，

反應結果如圖 3-3，經過與負向控制組比較後發現，所篩選到的四種 多胜肽序列確實皆可與 V. harveyi 結合。另外，序列 I 似乎和 V. harveyi 中的物質結合能力較強，而使得其在酵素連結免疫吸附分析反應中呈現較佳之數值比 (如表 3-2，序列 I 之正向控制組：實驗組=1：1.15；

實驗組：負向控制組=4：1)。有趣的是雖然序列 I 和 II 的序列如此相似，但酵素連結免疫吸附分析結果卻呈現序列I 比序列 II (如表 3-2，

序列II 之正向控制組：實驗組=1.22：1；實驗組：負向控制組=2.28：

1)約有兩倍強的鍵結能力差異，且由表 3-1 中也可看出序列 I 被篩選出的機率似乎比較大，造成此差異的原因目前尚不清楚，不過可能和此兩多胜肽之構形有關，但仍待進一步證明。

Peptide sequence Positive control

sonicated-V.

harveyi culture medium

選到和這四種序列結合的物質機率較大，所以反應較強。此外序列 I

I HHPPWLP 10.11737 10.73474 3.429577 12.49531 II HFDWLPY 4.506809 4.298638 3.021401 4.484436 III LPLNNRL 5.709122 4.703959 2.39759 5.802065 IV NSTAIMT 4.271795 3.571282 1.832821 4.110769 表3-4 四種多胜肽與各部份 V. harveyi 培養液的 ELISA 反應吸收值對

負向控制組之比值

將 V. alginolyticus、V. anguillarum、V. damsela、V. furnissii、V.

hollisae、V. ordalli、V. parahaemolyticus、V. salmonicida、V. vulnificus 和 V. harveyi 分別以超音波細胞震碎機打破，之後打破之培養液依之 前所述的方法進行 SDS-PAGE 電泳，然後經由半乾式蛋白質轉漬槽將膠片上之蛋白質轉漬到PVDF 轉漬膜上，以 blocking buffer 將未有蛋白質吸附處填滿，分別使用四種具有單一胜肽的噬菌體作為一抗，

之後以anti-M13 conjugated-HRP antibody 作為二抗，最後於暗房中以 Enhanced chemiluminescence (ECL)呈色並以 X 光底片進行感光反應。西方墨點法結果如圖 3-5、圖 3-6、圖 3-7、圖 3-8 所示，另外十株弧菌破碎培養液之SDS-PAGE 電泳對照圖如圖 3-4 所示。此結果發

現四種多胜肽序列皆會和十株弧菌結合，而且除了 V. salmonicida 外，

四種多胜肽序列和每株菌皆可以結合至少一種蛋白質以上，且訊號皆相當明顯。

首先以序列I 為例，十株弧菌最為明顯之結合蛋白質幾乎皆位於 40 kDa 處，但 V. furnissii、 V. ordalli、 V. salmonicida 卻觀察不到此 蛋白質帶存在。再者雖然序列Ⅱ與序列I 之胺基酸順序非常類似 (皆為HXXWLP) ，理論上所結合之蛋白質樣式 (pattern) 應有其相似性存在，但根據西方墨點法呈色後卻非如此之結果，而是集中於 33 kDa 處，且 V. harveyi、V. ordalli、V. salmonicida 觀察不出此明顯之蛋白質 帶。至於序列III 和 IV，雖然此兩者序列表面上並無關連性存在，但和兩者結合的蛋白質樣式 (pattern) 卻是如此的相似，例如 V.

anguillarum、V. alginolyticus、V. damsela、V. furnissii、V. hollisae 和 V. vulnificus 訊號較強之蛋白質帶 (約位於 24~40 kDa) 分佈皆相同，

這點十分地有趣。因此進一步分析序列III 和 IV 之胺基酸組成，發現到序列III 之多胜肽以非極性胺基酸居多 (L 和 P 共四個胺基酸) ，而序列IV 之多胜肽則以極性胺基酸居多 (N, S, T, M 共五個胺基酸) 。兩序列雖有如此相反特性存在，但進一步計算單純七個胺基酸之等電點 (isoelectric point, pI) 發現皆相同，亦即同樣環境中帶有相等電荷數，或許也因為如此使得弧菌體內帶電荷之蛋白質同樣皆可和序列III 和 IV 相結合，造成如此類似的蛋白質樣式。另外以上四種序列辨識到的重點蛋白質帶與 SDS-PAGE 電泳圖作比較，亦可發現在電泳膠片上相同之位置有非常明顯又廣泛的蛋白質存在。故推測弧菌體內的這些蛋白質扮演重要角色，因此大量存在，這也說明了我們篩選到的此四種單一多胜肽噬菌體可辨識弧菌體內之重要蛋白質。

綜合此四種多胜肽和十株弧菌之結合可知單一多胜肽序列所結 2: V. alginolyticus 3: V. anguillarum 4: V. damsela 5: V. furnissii 6: V. hollisae 7: V. ordalli