實驗材料與方法

(1) 葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase；GOx) , EC 1.1.3.4 (Fluca) (2) 葡萄糖 (Glucose anhydrous) (Sigma)

(3) 抗壞血酸(L (+)-Ascorbic acid) (Sigma) (4) 乙醇 (Alcohol) (Sigma)

(5) 過氧化氫 (Hydrogen peroxide) ( Showa)

(6) 磷酸氫二鈉 (Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate) (Showa) (7) 磷酸二氫鉀 (Potasium dihydrogenphosphate) ( Showa)

(8) 氯化鈉 (Sodium chloride) ( Amresco) (9) 氯化鉀 (Potasium chloride) ( ICN)

(10) Nafion (perfluorinated ion-exchange resin, 5% w/v solution in lower alcohol/water) ( Aldrich Steinheim Germany)

(11) Triton X-100 (Biobasic INC) (12) Tween 20 (Biomedical)

(13) SWNT (Conyuan Biochemical technology Co. Ltd) (14) SPCE (ApexBio from Hsinchu Taiwan)

(15) 聚乙烯醇光聚合物 (pyridinium methyl sulfate：PVA-SbQ)( Toyo Gosei Kogyo Co. Ltd., Japan.)

2-2 實驗儀器與設備

所有電化學實驗均使用型號CHI 440 (CH Instruments) 之儀器來進行檢測，並連接至電腦上進行訊號判讀。而電化學系統是利用標準三電極系統 (Standard three-electrode system)，將純金電極當作對極，Ag/AgCl 當作參考電極，SPCE 當作工作電極，並將三極浸泡於 10 ml 的燒杯中，並在磁石穩定攪拌的環境中進行電化學檢測【附錄二】。光學顯微鏡照是利用 Olympus BX51 光學反射式顯微鏡並利用 DP12 數位照相機來讀取訊號。而電子顯微鏡照是由清華大學化學工程學系電子顯微鏡所拍得。

2-3 實驗步驟

過氧化氫之電流式檢測

調配新的 1 M H2O2 放置於冰上使其不易產生反應因而濃度降低，並在小燒杯中注入10 mL 1X PBS 當作反應槽中之電解緩衝液，並在反應槽內放置一小磁石，固定速度攪拌使其能均勻反應。並將對極之金電極、參考電極之 Ag/AgCl 與工作電極之 SPCE 浸於反應槽中。將工作電壓相對參考電極設定於0.7 V。當背景電流值得到一穩定平衡狀態時，再添加 10 μL, 1 M H2O2 於反應槽內。因為所添加的H2O2 體積相對於反應槽內的 PBS 相比小於 0.1%，所以其濃度誤差可以忽略不記，可視為添加濃度為 1 mM H2O2。而當添加H2O2 完後，待反應達到穩定平衡狀態時，則將其

氧化電流減掉背景電流 (background current)，則為我們所求得之反應電流值 (response current)。而其反應時間 (response time) 為當添加 H2O2 完後，待電流由背景電流值上升至 95%反應電流值之時間 [69]，其為電流反應時間【附圖七】。

附圖七、電流反應時間示意圖

表面修飾 SPCE

(1) 利用循環伏安法清潔修飾：

利用預先調配好濃度之各類溶液 (0.1% HCl, 飽和 KCl, 0.05 M phosphate buffer, 1 M NaHCO3, 飽和 Na₂CO₃)，將各類溶液當作電化學系統中之電解緩衝液，並進行循環伏安法來做為電極表面清潔，

起始電壓設定為0.0 ~ 2.0 V 或 1.0 ~ 2.0 V，以 0.1 V/s 速度改變電位，

並設定循環圈數分別為 5 圈，10 圈或者 15 圈，待系統反應結束，

利用二次去離子水洗淨之後，即可將SPCE 置於室溫下保存。

H2O2

95% response current

Response time

(2) 利用奈米碳管修飾：

利用 99.5%乙醇稀釋 5% Nafion 於所需濃度。同樣利用乙醇稀釋 Triton X-100 與 Tween 20 於所需濃度 (0.5 ~ 10%)。並將 SWNT 利用超音波震盪器，使其均勻溶於不同濃度之 Nafion，Triton X-100 與 Tween 20 溶液中，調配為 2 mg/ml 濃度，並取 1.5 μL 體積，利用微量吸管，均勻塗布在 SPCE 活性區域上。置於抽氣櫃中於室溫下 24 小時後，則置於室溫保存。

(3) 利用非離子型界面活性劑修飾：

利用99.5%乙醇稀釋非離子型界面活性劑 (Triton X-100, Tween 20) 於所需濃度 (0.5%~10%)，並將其取 2 μL 體積，利用微量吸管，

均勻塗布在SPCE 活性區域上，置於烘箱內以 37℃烘乾 1 小時後，

則置於室溫保存。

葡萄糖感測器

葡萄糖感測晶片是利用 PVA-SbQ 材質將葡萄糖氧化酶進行膠體包埋使其固定化在電極之上。利用PVA-SbQ 光聚合反應將酵素包埋的方法，

已經在許多文獻 [69, 70] 進行過探討。而在此之實驗程序，是依循之前本實驗室研究成果，所測試出最適合的膠體包埋條件進行。酵素溶液的調配是將可溶的葡萄糖氧化酶粉末與二次去離子水以1：12 (w/w) 的比例均

勻混合。並且將 PVA-SbQ 與二次去離子水以 1：1 (w/w) 稀釋。接下來將已調配之酵素溶液 (13 U/μL) 以及稀釋之 PVA-SbQ 再以 1：1 (v/v) 充分的均勻混合。之後再塗布1.5 μL GOD/PVA-SbQ 溶液於 SPCE 之工作區域上，置於冰上照光2 小時進行光交聯反應，待反應完畢即將此酵素電極置於4℃冰箱 24 小時後，即可進行偵測。

在進行電化學檢測時，預先調配好 1 M 與 100 mM 濃度的葡萄糖溶液，在進行葡萄糖檢測時，利用三極系統進行偵測，並將工作電位設定在 0.7 V (vs. Ag/AgCl)，而再添加所需之葡萄糖溶液濃度，而獲得電流反應值之方法，與在偵測H2O2所進行之程序相同。

接觸角 (Contact angle) 量測

利用微量吸管滴落 1 μL 二次去離子水於 SPCE 表面上，利用電腦判讀角度擷取圖形。

2-4 實驗原理與方法

電化學原理與方法 [71]

電化學為研究電能與化學能之間，其能量和質量轉換的學問，主要是探討反應物質在化學反應中與電荷的關係【附圖八】。電荷的輸送發生於電極表面和電解質之間。在電解質中可利用離子的移動輸送電荷。當施加

電壓於電極時，電極表面會產生一層離子，然後鄰近表面電解液中，再散佈一層帶異性電之離子，形成電雙層。對某一特定物種 (標準電位, E0) 而言，當電極處於較大的電位時 ( E＜E0 )，電子的能量提升，使電子由電極表面流向電解液，此時稱為還原電流 (Reduction current )。而當電解液處於較大的電位時 ( E＞E0 )，將使電極偏向正電位，電子由電解液流通過電雙層到電極表面發生氧化反應，此時稱為氧化電流 ( Oxidation current )。

而電極的反應電流大小除了與施加電位有關，與質量傳送的速率也有著絕對關係。因為反應物必須先由電解溶液中傳達至電極表面才能完成氧化還原反應發生電子傳遞現象。而質傳機制有三類，分別為擴散 (Diffusion)、遷移 ( Migration ) 及對流 ( Convection )。

擴散為當電極發生反應後，電極表面反應物濃度下降，使電解液和電極表面之間形成濃度差，則反應物會從高濃度擴散到低濃度，此現象稱為擴散，其速度與濃度差成正比。遷移為在電極施加電位時，會形成電場，

而電子或離子在電場的作用下，使帶有電性的電子或離子往相對電場電性的方向移動，此現象稱為遷移。其遷移速度與離子濃度、電荷價數和電場強度成正比。對流為在電解槽中，電解液中物質因電極和電解液之間進行攪拌或旋轉電極等機械性運動或是溫度的變化而傳送到電極表面的現象稱為對流。其所造成的反應物流速與物質的濃度、攪拌速度、旋轉速度和

溫差成正比。而在一般電化學實驗會添加大量電解質，提供足夠的離子強度，在此情況可以忽略遷移現象。而一般若仔細操作，對流現象也可以控制在相同狀態。所以一般只需考慮到擴散現象。

附圖八、反應物質傳送至電極表面反應機制圖 [72]

循環伏安法

循環伏安法為一種廣泛應用於伏特安培法 (Voltammetry) 之技術，常用來研究電極表面行氧化還原反應現象如電子傳遞動力學。對於電極提供外加電壓，其為隨時間而變之固定掃瞄速率之三角波【附圖九(A)】，並且有前掃瞄 (forward scan)，如【附圖九(B)】由 V₁ 至 V₂，或逆掃描 (reverse scan)，由 V₂至 V₁。藉由所得到之電流—電位曲線，則可獲得反應物於電極表面進行氧化還原之相關資訊。

M+(n- 1) M⁺ⁿ +e- (1)

上式為由V1至V2循環掃描時，電化學物質之氧化還原反應。由V1至 V2循環掃描時，在電極表面上會在其擴散層，形成一濃度梯度。在V1，t = 0時，在電極表面大部份都是M^+(n-1)反應物，之後隨著電位的提升，其擴

散速率將會逐漸增加，在電極表面上逐漸提升M⁺ⁿ生成物，當到達擴散速率與化學反應平衡時，在電流-電位曲線上會發現一波峰，即為其氧化峰電位 (oxidative peak potential；Epa)，其所對應電流為 Ipa。當波峰點出現後，其擴散層將往外延伸，導致擴散速率不足，進而電流反應值持續但越來越小【附圖九(C)】。而若此電化學反應為可逆，當電壓由V2逆掃描至 V1時，會產生還原峰電位 (reductive peak potential；Epc)，其對應電流為Ipc

【附圖九(D)】。

Distance from electrode x

constant

Distance from electrode x

constant diffusion limited current E_p

(D)

V1 V2

附圖九、(A) CV 電位－時間變化圖。(B) CV 電位－電流變化圖。

(D) 可逆式 CV 電位電位－時間變化圖。

對於受質能傳送控制的可逆性循環伏安法而言，將遵循下列關係式：

Ered = (Epa+ Epc)/2， Ipa= Ipc= (2.69x10⁵) n^3/2ACD^1/2v^1/2，並且 ΔEp = Epa- Epc

= 59 mV/n，其中 n 為電子數，A 為電極表面積，C 為反應物在溶液中濃度，D 為反應物之擴散係數，v 為電位掃描速率。可看出利用循環伏安法將可以用來研究電極電子轉移與化學反應速率。

定電位法 (Constant－Potential method, CP）

定電位法為將外加電壓維持在可以使待測物質反應之常數值。隨著待測物質的加入，其反應量將會表現在電流的變化上。此方法又可稱為電流式檢測法。利用此方法，可以電流值之變化量將會隨待測物質濃度呈現比例關係。而在反應時，需在系統攪拌，使其產生對流，利用此法可以將溶液達均勻狀態。而在利用此法時，通常會選擇在含有電解質溶液當操作環境，而在未添加待測物時，施以一外接工作電壓時，將會發覺起始時會產生極大電流值，之後隨著時間增加，會隨之漸漸降低，最後達一穩定平衡電流，稱之為背景電流值。而其電流隨時間下降速率將可由Cottrell方程式可得知：i vs. t^-1/2之關係。而隨著當穩定產生背景電流值後，此時添加待測物將會改變環境中濃度，記錄其電流－時間曲線 (i-t curve)，當電流值再次反應平衡時，將此電流值扣除背景電流值即為其反應電流值。而再添加待測物時，有時會因待測物在系統環境中，濃度不均造成電流會有瞬間變大現象，此時若系統是穩定且選擇電位為正確的話，等待一段時間，

還是會達一穩定平衡狀態。在計算其反應時間，為當添加待測物後，電流由背景電流值爬升至95%反應電流值所需時間【附圖十】。在此系統中反應物與電流值可用下列方程式表示：I = nFADCbulk/δ，I為反應電流值，n 為電荷數，F為法拉第常數，A為電極表面積，D為物質之擴散係數，δ.

為物質之擴散層厚度，Cbulk為溶液中反應完之氧化還原物質濃度。

附圖十、定電位法之添加待測物於系統中時間－電流曲線

電流式氧化酶感測器【附圖十一】

在酵素感測器上，氧化酶通常伴隨產生 H2O2，而其標準氧化電位可由 (2) 式得知為-0.695 V，

H₂O₂ → O₂ + 2H⁺+ 2e^- E₀ = -0.695V (2)

利用定電位法，設定工作電位約為0.7 V，即可測得 H₂O₂氧化反應電流。

而以葡萄糖氧化酶反應為例，

Glucose＋O₂＋2 H₂O → gluconic acid＋2 H₂O₂(3)

葡萄糖經酵素催化後會產生H₂O₂，偵測H₂O₂濃度可回推得知葡萄糖濃度，可應用於血糖測試用途上。

附圖十一、電流式氧化酶感測器示意圖。

Electr o de

Oxidase

Substrate

Product O

H

₂

O

₂

e -e ^-

Around 0.7V

Detect the redox current

Direct detection

Enzyme free

第三章結果與討論

在文檔中探討表面修飾網版印刷碳膠電極在電化學特性影響 (頁 33-45)