第四章 實驗裝置、藥品與步驟
4.3 實驗步驟
本次實驗之基材為聚丙烯薄膜，樣本大小依分析方法而有所不 同，對照組為 1.5cm X 1.5cm，水濕性梯度組為 1cm X 7cm。切割完 成的聚丙烯薄膜製入培養皿中，利用 95%乙醇沖洗數次。清洗數次 後，將經過震盪清洗的聚丙烯薄膜放入無菌通風櫥中，並且置於無菌 紙上方，以抽氣方式讓乙醇加速揮發，待其乾燥後置入無菌培養皿 中。本次實驗會在經過電漿處理的聚丙烯薄膜上培養細胞，因此需使 用無菌通風櫥以及無菌培養皿。
將已乾燥的聚丙烯薄膜兩端以雙面膠貼附於 1.2cm X 7.5cm 之 玻片上，如圖 4.1 所示，並於玻片背面畫上分隔線並作上記號，以利 接觸角之量測。
圖 4.1 水濕性梯度組之聚丙烯樣品示意圖
4.3.2 腔體清潔
為確保電漿腔體內部並無殘留之物質，可能會污染樣本。所以 在處理樣本之前，必須先利用氬氣加氧氣電漿去除腔體壁之殘留物 質，電漿參數如下：
電漿參數：氬氣：10 sccm；氧氣：50sccm；壓力：100mtorr；功率 100W；時間：30mins
若腔體原為電漿聚合之用，氬氣加氧氣之電漿可能無法完全除 去殘留餘腔體壁上電漿高分子，此時必須使用型號 200 的砂紙，對腔 體內部進行刷磨，並使用乙醇(Ethanol)或丙酮(Acetone)擦拭腔體內 部，再用以上條件進行一次電漿處理以清潔腔體。
4.3.3 對照組
過去已有研究發現，若以含氟原子之氣體電漿，對聚合物進行 表面處理，會在聚合物表面產生含氟官能基，使聚合物表面改質較為 疏水[7, 8]。本次實驗對照組使用之含氟原子之氣體為四氟化碳氣體。
根據本實驗室先前實驗結果可知，以氧氣電漿處理聚合物表 面，加上含氟原子之氣體電漿改質，相較於只用相同條件含氟原子分 子之氣體電漿改質會得到更疏水之表面。接觸角測量應於電漿處理結 束後一小時內測量，以避免與空氣中之分子反應，或是由於空氣中雜
質附著於待測物表面，導致接觸角測量之誤差。
對照組目的有二：第一，探討相同條件之下，經氧前處理的效 益；第二，探討製備水濕性梯度時最適當的電漿處理條件。本次實驗 四組對照組之電漿參數如表 4.1 所示。
第一組為比較氧前處理的效益，將利用氧進行前處理，另一組 則不經氧前處理，但以同樣的四氟化碳電漿條件進行實驗，以了解氧 前處理對聚丙烯表面之影響。其中將改變四氟化碳電漿處理時間，以 探討不同電漿處理時間對改質聚丙烯表面之影響。第二組是以調整氧 氣電漿功率為 100W，研究較高瓦數前處理對聚丙烯表面之影響。第 三組則是調整氧氣電漿功率為 200W，同時減少氧氣電漿處理時間，
探討短時間高瓦數氧前處理之效應。第四組是改變四氟化碳電漿功率 為 60W，討論以較高瓦數之四氟化碳電漿處理對聚丙烯表面之影響。
以上四組電漿參數所獲得之結果，將用以決定製備水濕性梯度之最佳 參數組合。
表 4.1 四組對照組之電漿參數
圖 4.2 製備具水濕性梯度聚丙烯之擺置(a)，俯視示意圖(b) 為製備具最大範圍之水濕性梯度，經過測量對照組之接觸角 後，決定使用以下兩組之電漿參數製備具水濕性梯度之聚丙烯，兩組 都經由氧氣電漿進行前處理。第一組：利用四氟化碳電漿，處理時間 分別為 5、10、15 分鐘；第二組利用六氟化硫電漿處理，處理時間分 別為 5、10、15 分鐘。詳細電漿參數如表 4.2 所示：
表 4.2 製備水濕性梯度之電漿參數
氣體 有無氧前處理 流量(sccm) 壓力(mtorr) 功率(W) 時間(mins)
O2(pretreatment) - 10 100 80 10
(a) CF4 yes 10 100 20 5、10、15
(b) SF6 yes 10 100 20 5、10、15
(c) SF6 yes 10 60、100 20 5
4.3.5 細胞培養
將具有水濕性梯度的聚丙烯樣本切割成 1cm X 1cm 大小，並使
用滅菌矽膠將樣本貼附於 12well 培養盤裡，進行 L929-纖維母細胞之 培養。本次實驗進行 48 小時之細胞培養，並以掃描式電子顯微鏡(SEM) 觀察細胞於不同水濕性梯度表面附著之情形。
本次實驗使用 L929-纖維母細胞，培養液為 DMEM(dulbecco’s modified Eagle’s medium)含有 10%的胎牛血清蛋白(BSA)，FBS 與 1%
的三合一抗生素(penicillin-streptomycin-amphotericin solutions)等，並 於 5%二氧化碳濃度、37oC 條件之培養箱進行細胞培養。
經由 trypsination 步驟後，利用血球計(hemacytometer)計算細胞 數量，控制每個 well 的細胞濃度為 80000cells/mL，再將細胞加入已 貼附聚丙烯的 12well 培養盤中，進行 48 小時細胞培養。48 小時後，
先將 well 中舊的 medium 吸掉，再利用磷酸鹽緩衝溶液(PBS)潤洗 well，即進行細胞固定步驟。
細胞固定的步驟為，於各 well 中分別加入 0.2%(15 分鐘，4oC)、
2.5%(60 分鐘，4oC，兩次)的戊二醛溶液，固定細胞，並利用磷酸鹽 緩衝溶液潤洗(15 分鐘，4oC，三次)，將未反應之戊二醛移除。依序 利用 30%、50%、70%、80%、90%、99%等濃度之乙醇清洗細胞表 面並進行表面脫水，並使用臨界點乾燥機進行乾燥步驟。再以掃描式 電子顯微鏡觀察細胞於聚丙烯表面附著之情形。
4.3.6 細胞活性測試
為量化水濕性梯度對細胞之影響，本次實驗使用 MTT 實驗以定 量細胞活性。MTT 實驗是利用(3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl Tetrazolium Bromide)與細胞中之粒腺體的脫氫酵素(dehydrogenase)反 應，產生紫色 formazan 結晶產物的特性。若細胞活性高，粒腺體中 將含有更多量的脫氫酵素，表示有更多的脫氫酵素會與 MTT 反應產 生紫色產物。利用紫外光-可見光光譜分析儀(UV-Visible)，可分析紫 色結晶物於溶液中之吸收值，溶液的濃度越高，其吸收值也會越高。
因此利用吸收值之測定即可決定細胞之活性。
MTT 試驗的方法為：將細胞(80000cells/mL)加入已貼附聚丙烯 的 12well 培養盤中，經過 24 小時細胞培養。24 小時後，先將 well 中舊的 medium 吸掉，再利用磷酸鹽緩衝溶液(PBS)潤洗 well，即進 行 MTT 活性測試。
使用0.5mg/mL溶液與細胞反應4-6小時產生紫色晶體formazan，
再利用二甲亞碸(DMSO)將formazan溶解，並稀釋10倍，將此溶液利 用紫外光-可見光光譜分析儀在554nm波長位置測量其吸收值(optical density-OD)。
4.3.7 蛋白質吸附測試
本次實驗利用 BSA 螢光蛋白質進行蛋白質吸附測試，以了解不 同水濕性表面對 BSA 蛋白質吸附之影響。
將具有水濕性梯度的聚丙烯樣本切割成 1cm X 1cm 大小，並使 用矽膠將樣本貼附於 12well 培養盤裡。以磷酸鹽緩衝溶液當溶劑配 製 1mg-BSA/1mL-PBS 之蛋白質溶液，並於已貼附聚丙烯的 well 中加 入 1mL 蛋白質溶劑，放入培養箱中靜待 4-6 小時。4 小時後取出培養 盤，將各個 well 中的蛋白質溶液取出，並利用紫外光-可見光光譜分 析儀在波長 510nm 位置測量其吸收值。以紫外光-可見光光譜分析儀 測量出之吸收值為未被聚丙烯吸附之蛋白質之值，並非被聚丙烯吸附 之蛋白質之值。所以量化聚丙烯所吸附蛋白質之量時，必須先用 1mg-BSA/1mL-PBS 之吸收值扣除測量出的吸收值，再將此值對照校 正曲線，求得相對之濃度，即可了解被聚丙烯吸附之蛋白質總量。
校正曲線是利用已知濃度的 BSA 溶液，以紫外光-可見光光譜分 析儀測量其吸收值後，所作之濃度對吸收值之關係圖。以 PBS 為溶 劑配製濃度為 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 與 0.05mg/mL 之 BSA 溶液，
測量其吸收值後，作出濃度對吸收值之關係圖，再以線性迴歸方法求 出其校正曲線。