的睪丸中皆有表現 IGF-1 mRNA (V. Rouiller-Fabre et al., 1998, F. Beck et al., 1987)，因此我想進一步檢視 IGF-1 在公鼠及母鼠生殖系統中各器官的表現的情 討其功能，例如儲精囊自體免疫蛋白 (seminal vesicle autoantigen ，SVA) （Yu et al.,1993） 可以對精子進行去獲能反應 (decapacitation) （Huang et al.,
1999,2000），防止精子過早活化。SVS VII 蛋白能在不誘發頂體反應之下增加精 子的游動力 （Luo et al,2001）。
於 2007 年有學者研究指出 (Fernando U et al., 2007)，人類儲精囊分泌液中 具有 IGF-1，其含量可達 300ng/mL，因此我進一步利用包夾式酵素免疫分析 (sandwich ELISA) 檢查公鼠儲精囊分泌液是否和人類相同具有 IGF-1。由圖 3-2 顯示，在不同週數公鼠的儲精囊分泌液中皆可鑑定出 IGF-1，尤其以 13 週的含
量最高，可達 12.45 ng/mL。
III-3 Localization of the IGF-1 receptor on mouse sperm
已有研究證實，在人類 (R. K. Naz and P. Padman, 1999) ，牛 (Donald M.
Henricks et al., 1998) 及兔子 (Minelli et al., 2001) 的精子頭部皆有 IGF-1 receptor。我利用 IGF-1 receptor 的抗體運用間接螢光技術 (indirect florescence technique) 觀察小白鼠精細胞是否含有 IGF-1 receptor。其控制組為直接加入 FITC 標定的二級抗體，無任何螢光反應 (圖 III-3a)，而由圖 III-3b 可看出精子頭部具 有螢光反應，證實 IGF-1 receptor 位於精子頭部。
IGF-IR receptor 由 2 條α-subunit (135 KD)及 2 條β-subunit (90 KD)所組成，
由雙硫鍵共同連接，α-subunit 包含細胞外配位體 (extracellular ligand)，而β -subunit 具有跨膜蛋白 (transmembrance domain) 及酪胺酸蛋白自發性磷酸化位 置 (tyrosine autophosphorylation site)。我以 IGF-IRβ(cell signal) 及 IGF-IR α (santa) 抗體，運用西方墨點分析法 (western blot analysis) 檢視由精子抽取的蛋 白物。由圖 III-4 顯示，IGF-IRβ抗體可和 72 及 55KDa 的兩條蛋白帶產生免疫 反應 (Immuno reaction)，而 IGF-IR α則可和 135 及 55KDa 的兩條蛋白帶產生免 疫反應 (Immuno reaction)，此結果和他以 IGF-IRα-subunit 抗體去辨認人類精細 胞 IGF-IR 所得實驗結果類似 (P. Padman and R. K. Naz, 1999)。
進精子獲能作用。
III-5. 獲能效應誘發精子上
獲能效應誘發精子上獲能效應誘發精子上獲能效應誘發精子上 IGF-IR 的激酶活性的激酶活性的激酶活性的激酶活性Tyrphostins 為 tyrosine kinase 的抑制劑，可抑制受體 IGF-IR 磷酸化反應 (Levitzki A. and Gazit A, 1995 )，目前已發展為抗癌藥物。利用 AG538 Tyrphostin 和精子共同培養，進一步檢視精子蛋白酪胺酸磷酸化的程度。由圖 III-6 可得知，
在含有 IGF-I 情況下，IGF-IR 會被活化，但若加入 AG538，IGF-IR 磷酸化的程 度會下降，利用 BSA 誘發精子獲能作用亦可得到相同的實驗結果。接著觀察整 體磷酸化的情形，圖 III-7 顯示，lane 1 為加入 IGF-I 組，lane 2 為 IGF-I+AG538 組，lane 3 為 BSA 組，lane 4 為 BSA+AG538 組，當加入 AG538 5μl 後，整體 磷酸化程度皆會下降，因此推論獲能效應伴隨 IGF-IR 激酶活化。抑制 IGF-IR 的活性可降低精子蛋白因獲能效應而發生的酪胺酸磷酸化。
Fig III-1.IGF-1 在各個生殖系統中之表現
取出公鼠及母鼠生殖系統之各器官 total RNA 後，以 reverse transcriptase 轉成 cDNA 後，再以設計好之 IGF-1 forward primer: ACCAGAGACCCTTTGCGGG GCT; reverse primer: AAGTGTACTTCCTTCTGAGTCT 進行 PCR 反應，primer 濃 度為 0.1Μm。GAPDH PCR 條件為 94℃ (denaturation 溫度) 15 秒, 23℃ (annealing 溫度) 15 秒, 72℃(DNA synthesis) 15 秒,一共 23 cycle,而 IGF-1 PCR 條件為 94℃
(denaturation 溫度) 15 秒, 58℃ (annealing 溫度) 15 秒, 72℃(DNA synthesis) 15 秒, 一共 35 cycle, 最終以 2% agarose 電泳鑑定 IGF-1 和 GAPDH (控制組)的
mRNA：lane1; ovary 卵巢; lane2; oviduct 輸卵管; lane3; uterus 子宮; lane4;
vagina 陰道;
lane5; prostate 前列腺; lane6; coagulating gland 凝固腺; lane7; seminal vesicle 儲 精囊; lane8; epididymis 副睪; lane9; testis 睪丸;
IGF-1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
GAPDH
Fig III-2.以酵素免疫分析法量測 IGF-1 在儲精囊液中的含量
(A) 於 microplate 的盤孔 (microplate 盤孔已結合 IGF-1 的 monoclonal antibody, 見材料與方法 II-10) 加入 mouse IGF-1 (288pg/mL) 及不同體積 mouse IGF-1 標準 溶液，在 25℃培養 2 小時，清除溶液並以 wash buffer 洗滌 5 次，最後加入 100 μl 的 HRP-conjugation anti-mouse IGF-1 (polyclonal)溶液於 25℃培養 2 小時，清 除溶液後再以 wash buffer 洗滌 5 次。於暗處加入 100μl 基質溶液反應 30 分鐘，
最後加入 100μl stop solution 停止反應，於 450nm 測吸光。由此得 IGF-1 之量和 吸光值的線性關係。
(B) 收集 12, 13, 14 週的小鼠的儲精囊液，取代(A)之 IGF-1 標準溶液，依(A)之步 驟得 450nm 的吸光值，對應(A)圖可得儲精囊液 IGF-1 含量。
Mouse IGF-1 standard curve
Fig III-3. 利用間接免疫螢光染色觀察精子上之 IGF-IR
將精子由副睪取出並處理完後，直接塗抺於載玻片上，先以 IGF-1 receptor(1:20) 抗體過夜培養，再以 FITC 結合的二次抗體培養，於螢光顯微鏡下觀察。圖 a 為 控制組 (只加入二抗) 並無任何螢光反應，圖 b 為加了 IGF-1 receptor 抗體後，
發現在精子頭部具有螢光反應，代表精子頭部具有 IGF-1 receptor。
Control
IGF-IR
Fig III-4. 利用西方點墨法(western blot analysis) 觀察精子之 IGF-1 receptor
將精子由副睪中取出，處理完成後直接以 SDS-PAGE 所使用的 sample buffer 萃 取其蛋白質，經 SDS-PAGE (8% polyacrylamide) 解析後，再利用 IGF-1 receptor α及β兩種抗體以 1:1000 的比例檢視 gel 內蛋白帶的免疫活性。IGF-1 receptor β 可專一性辨認兩條 band，分子量分別為約 72 及 55 KD 的位置，而 IGF-1 receptor α所辨認位置為 130 及 55KD。
WB: IGF-I receptor β WB: IGF-I receptor α KDa
55 72
KDa
130
55 The extracted
protein of sperm
The extracted protein of sperm
Fig III-5. IGF-I 對精子獲能效應所引發蛋白酪胺酸磷酸化的影響
將精子由副睪中取出後，調整數目為 106/15μl，與 IGF-I 共同培養 90 分鐘，再 利用 western analysis 觀察整理磷酸化的情形。Lane 1：控制組，不加入 IGF-I; lane 2 及 lane 3 則各加入 5μl 及 10μl 的 IGF-I。由圖可看出加入 IGF-I 之後和控制組 相比，整體磷酸化程度有提高，代表 IGF-I 可促進蛋白酪胺酸磷酸化。IGF-1 stock 濃度為 1.31x10-7μM
KDa
72 95
43 55
34
control IGF-I-a IGF-I-b
WB:p-Tyr
Fig III-6. IGF-IR 的抑制物 AG538 降低精子獲能效應所引發蛋白酪胺酸磷酸化 於 AG538 (5mg/mL) 有無存在的培養液中，精子 (106/15μl) 與 IGF-1 (50μg/ml) 或 BSA (3%) 於 37℃培養 90 分鐘後，再以西方點墨法，利用 phosphor-IGF-I receptor β (cell signal) 抗體檢測 IGF-IR 酪胺酸磷酸化。Lane 1 為控制組，lane 2 為 IGF-I 組，lane 3 為 IGF-I+AG538，lane 4 為 BSA 組，lane 5 為 BSA+AG538，
由結果可知，當加入 IGF-I 及 BSA 時，皆會使 IGF-IR 磷酸化，但若加入 AG538 5μl 後，IGF-IR 磷酸化的程度會便下降。
KDa
72
55
control IGF-1
IGF-1 +
AG538 BSA
BSA + AG538
Fig III-7. AG538 對精子獲能反應之影響
於 AG538 (5mg/mL) 有無存在的培養液中，精子 (106/15μl) 與 IGF-1 (50μg/ml) 或 BSA (3%) 於 37℃培養 90 分鐘後，再以西方點墨法，利用 p-Tyr (santa) 抗體 檢測 IGF-IR 酪胺酸磷酸化。Lane 1 為只加入 IGF-I 與精子共同培養，lane 2 則加 入 IGF-I 及 AG538，lane 3 為 BSA 組，lane 4 為 BSA+AB538 組，由圖可看出，
不論是 IGF-I 或 BSA 組，在加入 AG538 後，其磷酸化程度皆會下降。
KDa
95
72
55
34 43
IGF-I
IGF-I +
AG538 BSA BSA
+ AG538
第四章
體的表現對於精子成形 (spermatogenesis) (Funk et al., 1992, Zhou J and Bondy C, 1993) 和發育(Ovesen et al., 1996)是必需的。在人類的精漿中，亦發現其它生長 因子，EGF 及 TGFα (Yie et al., 1994)，顯示這些生長因子對於精子生理調控也 許有其重要性。在本實驗中，我利用 mouse IGF-1 immunoassay 分析結果顯示，公鼠儲精囊液中含有 IGF-I，且不論公鼠或母鼠的生殖系統皆有 IGF-I mRNA 的 能。精子中磷酸化的修飾作用主要有兩種，Serine / threonine 及 tyrosine 磷酸化，
後者常伴隨獲能效應而發生。目前只有少數幾種產生酪胺酸磷酸化的蛋白於精子
第五章
Baker J, Hardy MP, Zhou J, Bondy C, Luju F, Bellve AR, Efstratiatidis A. 1996.
Effects of an Igf I gene null mutation on mouse reproduction. Mol Endocrinol. 10:
903-916.
Breitbart, H. and Z. Naor. 1999. Protein kinases in mammalian sperm capacitation and the acrosome reaction. Rev Reprod. 4: 151-9.
Chen, Y.H., B. T., McLachlan, J. A., and Teng, C.T. 1987. The androgen-dependent mouse seminal vesicle secretory protein IV: characterization and complementary deoxyribonucleic acid cloning. Mol. Endocrinol. 1: 707-716.
Cohen P, Peehl DM, Stamey TA, Wilson KF, Clemmons DR, Rosenfeld RG. 1993.
Elevated levels of insulin-like growth factor-binding protein2 in the serum of prostate cancer patients. J Clin Endocrinol Metab. 76: 1031-1035.
Courot, M. 1981. Transport and maturation of spermatozoa. Prog. Reprod. Biol. 8:
67-79.
Donald M. Henricks, Andrew J, Kouba, Brett R. Lackey William R. Boone, Sandra L.
Gray. 1998. Identification of insulin-like growth factor 1 in bovine seminal plasma and its receptor on spermatozoa: influence on sperm motility. 59: 330-337.
F. Beck, N.J. Samani, J.D.B. Penschow, G.W. Thorley, W.J. Tregear, T. Brammar.
1987. Histochemical localization of IGF-I and IGF-II mRNA in the developing rat embryo. Development. 101: 175-184.
Fernando U. Garcia, Katarzyna Urbanska, Lauren Koltowski, Krzysztof Reiss, Christian Sell. 2007. Insulin-like growth factor-1 produced by seminal vesicles:
relationship to interaepithelial basal cell hyperplasia in the prostate. Clin Cancer Res.
13(11): 3140-46.
Funk B, Kessler U, Eisenmenger W, Hausmann A, Kolb HJ, Hies W. 1992.
Expression of insulin like growth factor II/mannose 6-phosphate receptor in multiple
human tissues during fetal lifer and early infancy. J Cline NDOCRINOL Metab 75:
424-431.
Henricks DM, Kouba AJ, Lackey BR, Boone Wr, Gray SL. 1998. Identification of Insulin-like growth factor I in bovine seminal plasma and its receptor on spermatozoa.
Influence on sperm motility. Biol Reprod 59: 330-337.
Huang, Y.H., Chu, S.T., and Chen, Y.H. 2000. Aseminal vesicle autoantigen of mouse is able to suppress sperm capacitation-related events stimulated by serum albumin.
Biol. Reprod. 63: 1562-1566.
Jansen, M., Van Schaik, F.M.A., Ricker, A.T., Bullock, B., Woods, D.E., Gabbay, K.H., Nussbaum, A.L., 1983. Sequence of cDNA encoding human insulin-like growth factor-1 precursor. Nature 306: 609-611.
Jha, K. N., D. B. Kameshwari, et al. 2003. Role of signaling pathways in regulating the capacitation of mammalian spermatozoa. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49:
329-40.
Jones J, Clemmons DR. 1995. Insulin-like growth factors and their binding proteins:
biological actions. Endocr Rev. 16: 3-33.
Kajimoto, Y., Rotwein, P., 1991. Structure of the chicken insulin-like growth factor-1 gene reveals conserved promoter. J. Biol. Chem. 266: 9724-9731.
Kooijman R. 2006. Regulation of apoptosis by insulin-like growth factor (IGF)-I.
Cytokine Grwothe Factor Rev. 17: 305-323.
Lai, M.L., Chen, S. W., and Chen, Y. H. 1991. Purification and characterization of a trypsin inhibitor from mouse seminal vesicle secretion. Arch. Biochem. Biophys. 290:
265-271.
Leyton, L. and P. Saling. 1989. Evidence that aggregation of mouse sperm receptors by ZP3 triggers the acrosome reaction. J Cell Biol. 108: 2163-8.
Levitzki, A. and Gazit, A. 1995. Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development. Science. 1782-1788.
Lee KO, Oh Y, Giudice LC, Cohen P, Peehl DM, Rosenfeld RG. 1994. Identification
of insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) fragments and IGFBP-5 proteolytic activity in human seminal plasma: a comparison of normal and
vasectomized patients. J Clin Endocrinol Metab. 75: 1367-72.
Lin T. 1995. Regulation of Leyding cell function by insulin-like growth factor-I and binding proteins. J Androl. 16: 193-196.
Li, S. H., R. K. Lee, et al. 2005. Demonstration of a Glycoprotein Derived from the Ceacam10 Gene in Mouse Seminal Vesicle Secretions. Biol Reprod.
Luo, C. W., H. J. Lin, et al. 2001. A novel heat-labile phospholipid-binding protein, SVS VII, in mouse seminal vesicle as a sperm motility enhancer. J Biol Chem. 276:
6913-21.
Minelli A, Moroni M, Castellini C. 2001. Isolation and purification of the IGF-1 protein complex from rabbit seminal plasma: effects on sperm motility and viability. J Exp Zool 290: 279-290.
Naz RK, Padman P. 1999. Identification of Insulin-like growth factor (IGF)-I receptor in human sperm cell. Arch Androl 43: 153-159.
Noyes, R. W. 1953. The fertilizing capacity of spermatozoa. West J Surg Obsetet Gynecol. 81: 342-9.
Ovesen P, Ho KY, Orskov H, Jorgensen JO, Ingerslev J, Christiansen JS. 1996. GH treatment of subfertile males. Fertil Steril 66: 292-298.
Parks, J. E. and R. H. Hammerstedt. 1985. Development changes occurring in the lipids of ram epididymal spermatozoa plasma membrane. Biol Reprod. 32: 653-68.
Peitz, B., and Olds-Clark, P. 1986. Effects of seminal vesicle removal on fertility and uterine sperm motility in the house mouse. Biol. Reprod. 35: 608-617.
Rosenfeld RG, Pham H, Oh Y, Lamson G, Giudice LC. 1990. Identification of insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) and a low molecular weight IGFBP in human seminal plasma. J Clin Endocinol Metab. 70: 551-3.
Shimatsu, A., Rotwein, P., 1987. Mosaic evolution of the insulin-like growth factor:
organization, sequence, and expression of the rat insulin-like growth factor-1 gene. J.
Biol. Chem. 262: 7894-7900.
Siduh, K. S. and S. S. Guraya. 1989. Cellular and olecular biology of capacitation and acrosome reaction in mammalian spermatozoa. Int Rev Cytol. 118: 231-80.
Suarez, S. S., D. F. Katz, et al. 1983. Movement characteristics and acrosomal staturs of rabbit spermatozoa recovered at the site and time of fertilization. Biol Reprod. 29:
1277-87.
Tsuruta JK, O’Brien DO. 1995. Sertoli cell- spermatogenic cell interactions:
insulin-like growth factor II/cation-independent mannose-6-phosphate receptor mediates changes in spermatogenic cell gene expression in mice. Biol Reprod. 53:
1454-1464.
Urner, F. and D. Sakkas. 2003. Protein phosphorylation in mammalian spermatozoa.
Reproduction. 125: 17-26.
Vijayaraghvan, S., and Hoskin, D.D. 1990. Changes in the mitochondrial calcium influx and efflux properties are responsible for the decline in sperm calcium during epididymal maturation. Mol. Reprod. Dev. 25: 186-194.
V. Rouiller-Fabre, L. Lecerf, C. Gautier, J. Saez, R. Habert. 1998. Expression and effect of the insulin-like growth factor I on rat fetal Leydig cell function and differentiation. Endocrinology. 139: 2926-2934.
W. H. Daughaday, P. Rotwin. 1989. Insulin-like growth factors I and II. Peptide messenger ribonucleic acid and gene structures, serum and tissue concentration.
Endocr. Rev. 10: 68-91.
Yie SM, Lobb DK, Clarck DA, Younglai EV. 1994. Identification of a transforming growth factor α-like molecule in human seminal plasma. Fertil Steril 61: 129-135.
Zhou J, Bondy C. 1993. Anatomy of the insulin-like growth factor system in the human testis. Fertil Steril 60: 897-904.