Fig. I-3 IGF-1 結構
I-7 實驗方向
實驗方向實驗方向實驗方向由於本實驗室專注在小白鼠的生殖研究。所以 IGF-1 的關聯研究便成了我 研究的主題。研究對象主要為公鼠，觀察 IGF-1 對於精子獲能效應及相關現象 的變化。
第二章
2. insulin-like growth factor I (IGF-I)重組蛋白，購自於 Sigma 公司，配製濃度 50µg/mL (1.31*10-7 µM) stock 溶液儲存於-20℃
3. AG538 抑制劑購自於默克公司，溶於 DMSO 中，配製濃度 5mg/mL (1x10-8 mM) stock 溶液儲存於-80℃
4. phosphor-IGF-I receptor β(Tyr1131)/Insulin receptor β(Tyr1146)
antibody(#3021)、IGF-I receptor β antibody(#3027)、anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (#7076)、anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (#7074) 購自於 cell signal 公司；IGF-IRα(n-20): sc-712、p-Tyr (py99): sc-7020，購自於 Santa 公 司; Donkey-anti-rabbit IgG, FITC conjugated (#711-096-152) 購自於 Fitzgerald 公司。
2. RNA 萃取：
a. 實驗用小白鼠以乾冰迷昏窒息死亡後，取出組織並迅速以液態氮凍
結，以研磨棒在臼上磨碎。
b. 以每 100 mg 組織加入 1mL TRI reagent 溶液的比例均勻混合。
c. 置於室溫 5 分鐘，讓核蛋白等物質與核酸分離。
d. 加入 200µl chloroform/1mL TRIzose，vortex 15 秒。
e. 以 12000g、 4℃、離心 15 分鐘，小心取出上清液﹙水層﹚至一乾淨
5. RNaseOUT TM (40U/μl)
Programable Thermal Controller (GeneAmp PCR systems 2400)
【方法】
3.加入 8μl cDNA synthesis mix cDNA synthesis mix amount
5x buffer 4μl
Programable Thermal Controller (GeneAmp PCR systems 2400)
【試劑】
1. Taq enzyme (Promega ,Madison, WI)
2. 10×Taq reaction buffer with MgCl2 (Promega ,Madison, WI) 500 mM KCl
4. Mineral oil (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA)
【方法】
PCR 所需要注意的事項 (Roche Molecular Biochemicals PCR Applications Manual 2nd edition)：
I. 模板 （Template）：
a. 模板的純度會影響到 PCR 反應，如果模板受到污染會影響到 PCR 反 應的結果，例如，過多的 RNA 會使得鎂離子的濃度降低影響到 PCR 反應進行時的專一性。
b. 模版的建議濃度：
3.電泳緩衝液（10×tank buffer）室溫儲存
Tris．HCl 0.25 M
Glycine 1.92 M
SDS 1 %
4.試料緩衝液（2×sample buffer）儲存於 4℃
Tris．HCl（pH 6.8） 0.125M
Glycerol 20.0 %
2-mercaptoethanol 10.0 % bromophenol blue 0.004%
** 若蛋白質帶雙硫鍵時以 2-mercaptoethanol 將之還原則可使
2. 10×TBST（pH 7.2）
10×TBS (995 ml) 加 Tween-20 (5 mL)
3. 5% Skim milk（DIFCO，0032-17-3）in 1×PBST 4. PVDF 轉印膜（MSI，PV4HY00010）
5. ECL reagent 1 and 2 （Perkin Elmer; Branchburg, NJ）
【儀器】
PVDF membrane
II-7 sperm preparation
1. 以乾冰窒息犠牲小白鼠，剪開腹部，取出副睪尾段 (cauda epididymis)。
2.於 37℃, 5% CO2培養箱反應 90 分鐘 抑制 IGF-IR 磷酸化 phosphor-IGF-I receptor β
(Tyr1131) /Insulin receptor β(Tyr1146) antibody, 1:1000
anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (#7074), 1:5000
II-9 In vitro capacitation
1.將處理好之精子以計數器 (Hemacytometer) 確定數目，並分成三組
4.離心沉澱的精子以 2X sample buffer 抽取蛋白質，每 15μl / 10μl sample buffer 5.100℃水浴 10 分鐘
6.4℃全速離心 10 分鐘
採用 R＆D systems Quantikine Mouse IGF-1 kit 試劑組:
1.mouse IGF-1 Microplate (96 well) 2.mouse IGF-1conjugate
3.mouse IGF-1standard (4ng/vial) 4.mouse IGF-1controls (288pg/mL) 5.calibrator diluents RD5-38 6.wash buffer concentrate 7.color reagent A
8.color reagent B 9.stop solution
【方法】
Standard prepare
1.加入 2mL 的 RD5-38，配製成 2 00pg/mL stock solution
mouse IGF-1controls prepare
加入 1mL 滅菌過的去離子水，配製濃度為
substrate solution prepare
color reagent A 和 B 以相等體積混勻，需於 15 分鐘內使用完畢
ELISA protocol
1.加入 50μl 的 RD5-38 至每個 well 中 (皆三重覆)
2.各加入 50μl 的 standard, control, 及儲精囊液，置於 shaker 上室溫培養 2 小時
3.加入 wash buffer (400μl) wash，重覆 4 次
4.加入 100μl mouse IGF-1conjugate，置於 shaker 上室溫培養 2 小時 5.再重覆 3 的步驟
6.加入 substrate solution 100μl，置於不見光處 30 分鐘
7.加入 100μl stop solution，輕輕搖晃使溶液均勻混合，於 30 分鐘內以 450nm 及 540 或 570nm 測定其吸光值
II-11 immunofluorescene
1.將處理好的精子 (1x107 cells/ml) 分成兩組，各取 10μl 滴於載玻片上，以 methanol 固定後，加入含 3% BSA 的 blocking solution 1 小時，而後以 1:20 的比 例加入 IGF-IRα(n-20) 於 4℃中過夜培養，但控制組不加入 IGF-IRα(n-20)。
2.將 sperm 以 1x PBS 稍微清洗後，加入 donkey-anti-rabbit IgG (1:50)反應一小時，
之後以螢光顯微鏡 (AH3-RFCA) 觀察。
第三章
的睪丸中皆有表現 IGF-1 mRNA (V. Rouiller-Fabre et al., 1998, F. Beck et al., 1987)，因此我想進一步檢視 IGF-1 在公鼠及母鼠生殖系統中各器官的表現的情 討其功能，例如儲精囊自體免疫蛋白 (seminal vesicle autoantigen ，SVA) （Yu et al.,1993） 可以對精子進行去獲能反應 (decapacitation) （Huang et al.,1999,2000），防止精子過早活化。SVS VII 蛋白能在不誘發頂體反應之下增加精 子的游動力 （Luo et al,2001）。
於 2007 年有學者研究指出 (Fernando U et al., 2007)，人類儲精囊分泌液中 具有 IGF-1，其含量可達 300ng/mL，因此我進一步利用包夾式酵素免疫分析 (sandwich ELISA) 檢查公鼠儲精囊分泌液是否和人類相同具有 IGF-1。由圖 3-2 顯示，在不同週數公鼠的儲精囊分泌液中皆可鑑定出 IGF-1，尤其以 13 週的含
量最高，可達 12.45 ng/mL。
III-3 Localization of the IGF-1 receptor on mouse sperm
已有研究證實，在人類 (R. K. Naz and P. Padman, 1999) ，牛 (Donald M.
Henricks et al., 1998) 及兔子 (Minelli et al., 2001) 的精子頭部皆有 IGF-1 receptor。我利用 IGF-1 receptor 的抗體運用間接螢光技術 (indirect florescence technique) 觀察小白鼠精細胞是否含有 IGF-1 receptor。其控制組為直接加入 FITC 標定的二級抗體，無任何螢光反應 (圖 III-3a)，而由圖 III-3b 可看出精子頭部具 有螢光反應，證實 IGF-1 receptor 位於精子頭部。
IGF-IR receptor 由 2 條α-subunit (135 KD)及 2 條β-subunit (90 KD)所組成，
由雙硫鍵共同連接，α-subunit 包含細胞外配位體 (extracellular ligand)，而β -subunit 具有跨膜蛋白 (transmembrance domain) 及酪胺酸蛋白自發性磷酸化位 置 (tyrosine autophosphorylation site)。我以 IGF-IRβ(cell signal) 及 IGF-IR α (santa) 抗體，運用西方墨點分析法 (western blot analysis) 檢視由精子抽取的蛋 白物。由圖 III-4 顯示，IGF-IRβ抗體可和 72 及 55KDa 的兩條蛋白帶產生免疫 反應 (Immuno reaction)，而 IGF-IR α則可和 135 及 55KDa 的兩條蛋白帶產生免 疫反應 (Immuno reaction)，此結果和他以 IGF-IRα-subunit 抗體去辨認人類精細 胞 IGF-IR 所得實驗結果類似 (P. Padman and R. K. Naz, 1999)。
進精子獲能作用。
III-5. 獲能效應誘發精子上
獲能效應誘發精子上獲能效應誘發精子上獲能效應誘發精子上 IGF-IR 的激酶活性的激酶活性的激酶活性的激酶活性Tyrphostins 為 tyrosine kinase 的抑制劑，可抑制受體 IGF-IR 磷酸化反應 (Levitzki A. and Gazit A, 1995 )，目前已發展為抗癌藥物。利用 AG538 Tyrphostin 和精子共同培養，進一步檢視精子蛋白酪胺酸磷酸化的程度。由圖 III-6 可得知，
在含有 IGF-I 情況下，IGF-IR 會被活化，但若加入 AG538，IGF-IR 磷酸化的程 度會下降，利用 BSA 誘發精子獲能作用亦可得到相同的實驗結果。接著觀察整 體磷酸化的情形，圖 III-7 顯示，lane 1 為加入 IGF-I 組，lane 2 為 IGF-I+AG538 組，lane 3 為 BSA 組，lane 4 為 BSA+AG538 組，當加入 AG538 5μl 後，整體 磷酸化程度皆會下降，因此推論獲能效應伴隨 IGF-IR 激酶活化。抑制 IGF-IR 的活性可降低精子蛋白因獲能效應而發生的酪胺酸磷酸化。
Fig III-1.IGF-1 在各個生殖系統中之表現
取出公鼠及母鼠生殖系統之各器官 total RNA 後，以 reverse transcriptase 轉成 cDNA 後，再以設計好之 IGF-1 forward primer: ACCAGAGACCCTTTGCGGG GCT; reverse primer: AAGTGTACTTCCTTCTGAGTCT 進行 PCR 反應，primer 濃 度為 0.1Μm。GAPDH PCR 條件為 94℃ (denaturation 溫度) 15 秒, 23℃ (annealing 溫度) 15 秒, 72℃(DNA synthesis) 15 秒,一共 23 cycle,而 IGF-1 PCR 條件為 94℃
(denaturation 溫度) 15 秒, 58℃ (annealing 溫度) 15 秒, 72℃(DNA synthesis) 15 秒, 一共 35 cycle, 最終以 2% agarose 電泳鑑定 IGF-1 和 GAPDH (控制組)的
mRNA：lane1; ovary 卵巢; lane2; oviduct 輸卵管; lane3; uterus 子宮; lane4;
vagina 陰道;
lane5; prostate 前列腺; lane6; coagulating gland 凝固腺; lane7; seminal vesicle 儲 精囊; lane8; epididymis 副睪; lane9; testis 睪丸;
IGF-1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
GAPDH
Fig III-2.以酵素免疫分析法量測 IGF-1 在儲精囊液中的含量
(A) 於 microplate 的盤孔 (microplate 盤孔已結合 IGF-1 的 monoclonal antibody, 見材料與方法 II-10) 加入 mouse IGF-1 (288pg/mL) 及不同體積 mouse IGF-1 標準 溶液，在 25℃培養 2 小時，清除溶液並以 wash buffer 洗滌 5 次，最後加入 100 μl 的 HRP-conjugation anti-mouse IGF-1 (polyclonal)溶液於 25℃培養 2 小時，清 除溶液後再以 wash buffer 洗滌 5 次。於暗處加入 100μl 基質溶液反應 30 分鐘，
最後加入 100μl stop solution 停止反應，於 450nm 測吸光。由此得 IGF-1 之量和 吸光值的線性關係。
(B) 收集 12, 13, 14 週的小鼠的儲精囊液，取代(A)之 IGF-1 標準溶液，依(A)之步 驟得 450nm 的吸光值，對應(A)圖可得儲精囊液 IGF-1 含量。
Mouse IGF-1 standard curve
Fig III-3. 利用間接免疫螢光染色觀察精子上之 IGF-IR
將精子由副睪取出並處理完後，直接塗抺於載玻片上，先以 IGF-1 receptor(1:20) 抗體過夜培養，再以 FITC 結合的二次抗體培養，於螢光顯微鏡下觀察。圖 a 為 控制組 (只加入二抗) 並無任何螢光反應，圖 b 為加了 IGF-1 receptor 抗體後，
發現在精子頭部具有螢光反應，代表精子頭部具有 IGF-1 receptor。
Control
IGF-IR
Fig III-4. 利用西方點墨法(western blot analysis) 觀察精子之 IGF-1 receptor
將精子由副睪中取出，處理完成後直接以 SDS-PAGE 所使用的 sample buffer 萃 取其蛋白質，經 SDS-PAGE (8% polyacrylamide) 解析後，再利用 IGF-1 receptor α及β兩種抗體以 1:1000 的比例檢視 gel 內蛋白帶的免疫活性。IGF-1 receptor β 可專一性辨認兩條 band，分子量分別為約 72 及 55 KD 的位置，而 IGF-1 receptor α所辨認位置為 130 及 55KD。
WB: IGF-I receptor β WB: IGF-I receptor α KDa
55 72
KDa
130
55 The extracted
protein of sperm
The extracted protein of sperm
Fig III-5. IGF-I 對精子獲能效應所引發蛋白酪胺酸磷酸化的影響
將精子由副睪中取出後，調整數目為 106/15μl，與 IGF-I 共同培養 90 分鐘，再 利用 western analysis 觀察整理磷酸化的情形。Lane 1：控制組，不加入 IGF-I; lane 2 及 lane 3 則各加入 5μl 及 10μl 的 IGF-I。由圖可看出加入 IGF-I 之後和控制組 相比，整體磷酸化程度有提高，代表 IGF-I 可促進蛋白酪胺酸磷酸化。IGF-1 stock 濃度為 1.31x10-7μM
KDa
72 95
43 55
34
control IGF-I-a IGF-I-b
WB:p-Tyr
Fig III-6. IGF-IR 的抑制物 AG538 降低精子獲能效應所引發蛋白酪胺酸磷酸化 於 AG538 (5mg/mL) 有無存在的培養液中，精子 (106/15μl) 與 IGF-1 (50μg/ml) 或 BSA (3%) 於 37℃培養 90 分鐘後，再以西方點墨法，利用 phosphor-IGF-I receptor β (cell signal) 抗體檢測 IGF-IR 酪胺酸磷酸化。Lane 1 為控制組，lane 2 為 IGF-I 組，lane 3 為 IGF-I+AG538，lane 4 為 BSA 組，lane 5 為 BSA+AG538，
由結果可知，當加入 IGF-I 及 BSA 時，皆會使 IGF-IR 磷酸化，但若加入 AG538 5μl 後，IGF-IR 磷酸化的程度會便下降。
KDa
72
55
control IGF-1
IGF-1 +
AG538 BSA
BSA + AG538
Fig III-7. AG538 對精子獲能反應之影響
於 AG538 (5mg/mL) 有無存在的培養液中，精子 (106/15μl) 與 IGF-1 (50μg/ml) 或 BSA (3%) 於 37℃培養 90 分鐘後，再以西方點墨法，利用 p-Tyr (santa) 抗體 檢測 IGF-IR 酪胺酸磷酸化。Lane 1 為只加入 IGF-I 與精子共同培養，lane 2 則加 入 IGF-I 及 AG538，lane 3 為 BSA 組，lane 4 為 BSA+AB538 組，由圖可看出，
不論是 IGF-I 或 BSA 組，在加入 AG538 後，其磷酸化程度皆會下降。
KDa
95
72
55
34 43
IGF-I
IGF-I +
AG538 BSA BSA
+ AG538
第四章
體的表現對於精子成形 (spermatogenesis) (Funk et al., 1992, Zhou J and Bondy C, 1993) 和發育(Ovesen et al., 1996)是必需的。在人類的精漿中，亦發現其它生長 因子，EGF 及 TGFα (Yie et al., 1994)，顯示這些生長因子對於精子生理調控也 許有其重要性。在本實驗中，我利用 mouse IGF-1 immunoassay 分析結果顯示，公鼠儲精囊液中含有 IGF-I，且不論公鼠或母鼠的生殖系統皆有 IGF-I mRNA 的 能。精子中磷酸化的修飾作用主要有兩種，Serine / threonine 及 tyrosine 磷酸化，
後者常伴隨獲能效應而發生。目前只有少數幾種產生酪胺酸磷酸化的蛋白於精子
第五章
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