實驗結果 實驗結果 實驗結果 實驗結果

第三章 第三章

第三章 實驗結果 實驗結果 實驗結果 實驗結果

第一節第一節

第一節第一節 禽流感病毒實驗結果禽流感病毒實驗結果禽流感病毒實驗結果禽流感病毒實驗結果

3.1.1 螢光螢光螢光螢光////表面修飾控制實驗表面修飾控制實驗表面修飾控制實驗表面修飾控制實驗

為了證明我們在第一章中所提出的修飾方法，確實可以以雙硫鍵將抗體固定 於元件表面，我們透過旋轉塗佈 (Spin coating)在矽晶片表面塗佈了 LOR5B 以及 S1813 兩層光阻，並透過光罩 (Mask)顯影出一片放射狀溝槽結構。由圖圖圖圖 3-1 (a) 可看到製作完成的結構之側視圖，另圖圖圖圖 3-1 (b)則為上視圖。由於光阻的遮蓋(圖圖圖圖 3-1 (c) )，此時當我們以前述之方法修飾整片晶圓時，僅有曝露出來的溝槽部分 才會被修飾(圖圖圖圖 3-1 (d) )。接著將剩餘的光阻以 Remover PG 進行舉離 (Lift-off)，

並且修飾上標記有 FITC 螢光機團的抗體。經過 1.1.3 節所描述的修飾後，我們 可以在圖圖圖圖 3-1 (f)中清楚的觀察到螢光呈現一放射狀圖型。螢光的出現顯示抗體確 實的被固定到晶圓上。而修飾有螢光的基材經過 DTT 處理後，螢光圖形明顯減 弱(圖圖圖圖 3-1 (g) )。螢光的減弱表示 DTT 確實成功的將表面的雙硫鍵打斷使樣品回 復到僅有 MPTM 的狀態。若再將樣品重複以 Ab-FITC 進行修飾，則螢光將會重 新出現(圖圖圖圖 3-1 (h) )。從這樣的螢光的實驗結果，我們可以確定我們所提出的修飾 手法確實可以固定抗體，而且經由重複修飾螢光，我們證實元件重複使用的可能 性。

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Ab-FITC mpdification

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3.1.2 病毒表面電位量測病毒表面電位量測病毒表面電位量測病毒表面電位量測

為了對應 SiNW-FET 訊號以及提供質量傳輸模型計算所需的ψ_virus，我們特別 測定了病毒的表面電位 ( ζ potential )。測定時，H5N2 病毒尿囊液樣品先被稀 釋一千倍，然後分別用 pH 2-9 的 1X PBS， 以一個單位的 pH 作為間隔，配成七 種樣品。 透過奈米粒徑暨介面電位量測儀，7 個 pH 值的病毒樣品之 ζ potential 被 測定出來並且對 pH 作圖。實驗結果如圖圖圖 3-2 所示，病毒的等電點 (Iso-electric 圖 point, pI) 約在 3.2 左右。量測結果顯示，pH 值越高，病毒表面越趨負電；反之 則趨向正電。另外，由圖中我們發現在 pH 7.4 的實驗條件下，病毒表面將帶有 負電性，因此 p-type SiNW-FET 若偵測到病毒，將觀測到電流的增加。而我們質 量傳輸模型計算中的ψ_virus就是帶入這個實驗測定出來的-9 mV。

3.1.3 病毒濃度量測病毒濃度量測病毒濃度量測病毒濃度量測

在估算病毒濃度時，我們將從獸醫所王金和老師實驗室取得之病毒母樣品

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-(圖圖圖圖 3- 2) 病毒表面 ζ potential 對 pH 變化圖

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稀釋 50 倍後，與直徑 137 nm 之聚苯乙烯奈米球 (Polystyrene, PS)的溶液混合。

PS 溶液在混合液中的濃度約為 7.91×10¹¹ M。透過 TEM 之影像，我們可以計算 病毒與 PS 粒子在每個畫面中的比例。由於 PS 溶液的濃度為已知，所以一旦我 們從 TEM 推算出病毒與 PS 的粒子數比就可以反推病毒濃度。為避免溶液中的 PS 與病毒分佈不均勻，除了將配置好的混合液以超音波震盪外，在推算比例時 也是透過許多張影像的結果做成平均值。最後，我們推估出濃縮一千倍的病毒樣 品濃度約為 10¹³ virus/mL。由此可以推出，未稀釋之病毒樣品(原先培養出來之 病毒母液，也是實驗樣品的最高濃度)約為 10¹⁰ virus/mL。專一性控制實驗中的 H6N1 病毒樣品，也依此方法推算出約 10⁹ virus/mL 的濃度。推算出來的濃度與 其他文獻所推測出來的病毒樣品值很接近，應屬於正常範圍。圖圖圖圖 3-3 為其中一張 典型的實驗影像，圖中具有淺色外膜且有類似腎型的粒子即為 H5N2 禽流感病 毒(藍色框內)，黑色的粒子為 PS(紅色框內)。病毒原先在 TEM 影像下無色，我 們以 2%磷鎢酸（Phosphotungstic acid，PTA）染劑進行蛋白質負染處理方能顯影。

(圖圖圖 3- 3) 病毒樣品與 PS 粒子混合後在 TEM 下的影像: 圖

藍框內為病毒，紅框內為 PS 粒子。

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3.1.4 以場效電晶體偵測病毒以場效電晶體偵測病毒以場效電晶體偵測病毒以場效電晶體偵測病毒之結果之結果之結果 之結果

圖圖

圖圖 3-4 (a)為許多次病毒電性偵測實驗中的一次，當微流體通道由一倍磷酸鹽 緩衝液(1X PBS buffer) 轉而通入含 10⁷ virus/mL 的樣品時，我們可以觀測到訊號 明顯的上升。在 3.1.2 節中我們曾經提過病毒在 pH7.4 下測出來的 ζ potential 約 為 -9mV，因此我們預期當病毒鍵結到 p-type SNW-FET 時，電流會產生相對應 的上升。而實驗的結果也確實與預期的訊號方向相吻合，部分證實了訊號應為真。

但為確認訊號並非因為 pH 值或者實驗環境之變化所造成，我們隨後又通入了 1X PBS 溶液。由圖上可以看出，就算轉換回 1X PBS 溶液元件的電流仍然維持在一 個結合後的狀態，並未被沖回偵測前的 1X PBS 電位。可見元件所觀測到的訊號 應為病毒經結合至元件表面所造成。在排除溶液環境造成的影響後，我們希望進 一步排除其他非特異性蛋白質的吸附的可能性。為了確定元件是以具專一性的方 式量測到病毒，而非其他吸附物，我們再進行了一組控制實驗。在這組實驗中，

我們對同一個元件分別流入 H6 以及 H5 兩種具有不同表面凝血蛋白素的病毒樣 品（皆在 1X PBS 環境下），照表面修飾的 H5 專一性單株抗體性質來看，元件應 該要可以分別出 H5 以及 H6 型的病毒。圖圖圖圖 3-4 (b) 顯示當我們從 1X PBS 通入 10⁶ virus/mL 之 H6N1 病毒溶液時，並未見到任何的元件訊號變化。相反的，當溶液 由 1X PBS 轉換到 10⁷ virus/mL 時我們則見到明顯的訊號上升。H6N1 與 H5N2 樣品是以同樣經過 12 天培養後的病毒母液樣本稀釋同樣倍數後進行實驗，雖然 H6 的病毒樣品濃度約低 H5 十倍，但由於考慮的是相同的感染天數所以濃度上 稍有差異。經由本小節中的兩個實驗，以及 3.1.1 節中的螢光實驗，我們清楚的 證實修飾後的元件是以專一性的方式在辨認病毒。

除了考慮元件的辨認專一性，我們也試圖以原子力顯微鏡結合電訊號實驗，

測定元件的病毒樣品偵測極限。在這個實驗中我們先以元件感測 10² virus/mL 的樣品(濃度約在 aM 層級)，在測得電訊號後，我們立即將元件轉到原子力顯微

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鏡的載台上進行掃描。實驗結果顯示(圖圖圖圖 3-5)，在偵測到電訊號的元件上最低僅 有個位數顆的病毒存在，顯示元件最低僅需要數顆病毒就可以測得訊號。這樣的 量測結果與過往的報導過的單一顆病毒偵測結果類似¹⁰。也顯示了元件對於病毒

樣品有非常高的靈敏度。另外，值得注意的是，在 aM 的工作濃度時元件的 τ_sat明顯延長。在確認元件具高度的專一性以及靈敏度後，我們還必須確認元件 在偵測後的可重複使用性。而圖圖圖圖 3-6 (a)、、、、(b)、、、、(c)、、、、(d)之實驗結果也顯示，透過 雙硫鍵循環修飾法，我們可以在一個元件上重複進行了四次的偵測。圖圖圖圖 3-6 (e) 為整個雙硫修飾循環的電訊號圖: MPTM 修飾、DTT 切除雙硫鍵、PBS 清洗元件 表面、抗體修飾以及病毒偵測的循環電訊號圖。我們可以清楚的從圖圖圖圖 3-6 (e)看到，

修飾抗體前的 PBS 電流位置，與整個實驗做完後 DTT 切除再進入 1X PBS 的電 流位置幾乎完全相同。這顯示了在 DTT 處理後元件的性質完全受到損傷，而且 元件已經回復到偵測前的狀態了。這些量測結果，證實了我們在 1.1.3 節所提出 的可重複式的循環修飾法，確實可在不傷害元件電子性質的前提下進行。

在圖圖圖圖 3-6 (e)中有一點值得注意的是，元件在 DTT 環境下的電流位置掉的非常

(圖圖圖圖 3- 4) 病毒電訊號實驗圖

(a)10⁷ virus/mL 奈米矽線場校電晶體電性偵測圖 (b)H5N2 與 H6N1 專一性實驗圖

(b) (a)

10⁷ AIV/mL

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低。這是因為 DTT 在水溶液中濃度高於背景溶液的濃度 (C_M-DTT = 500 mM in 1X PBS buffer )而非水溶液 pH 不同所造成的效應。一般來說，在進行流體實驗時若 不同溶液間的 pH 或者是離子強度有太大的差異，都會造成奈米矽線表面的矽醇 和鍵結分子重新與溶液達成新的電位平衡，進而造成訊號的變化。但如同所述，

DTT 溶液已經調整至與 PBS 等溶液相同皆為 pH=7.4，所以我們可以推斷此訊號 的產生是屬於離子強度變化所造成。

(圖圖圖圖 3- 5)元件偵測極限實驗

(a) 圖為元件對 10²/mL 的病毒樣品進行偵測的實驗結果 (b) 圖為為上圖之實驗元件偵測完後的原子力顯微鏡影像

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3.1.5 質量傳輸模型與質量傳輸模型與質量傳輸模型與 SCT 質量傳輸模型與

利用 3.1.4 節所展現的方法，我們以幾組元件進行大量的重複實驗，並且記 錄下元件之 SCT 與 τsat( 圖 3-6 (a)、(b)、 (c)、 (d))。實驗結果顯示，我們可以 頻繁的而且在相當短 τ_sat內的觀測到 fM（10⁶ virus/mL），這明顯的與傳統的擴散

(圖圖圖圖 3- 6) 元件重複利用實驗:

(a)(b)(c)(d)皆為同一元件量測 10⁷ virus/mL 病毒樣品的結果

其中 τmt表示元件質量傳輸所花費之時間,τsat為元件達到飽和的時間 (e)為循環修飾之電流圖

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3.1.6 未純化之尿囊液樣品偵測未純化之尿囊液樣品偵測未純化之尿囊液樣品偵測未純化之尿囊液樣品偵測

圖圖圖

圖 3-8 (a) 為元件在無額外病毒的尿囊液(Specific pathogen free allantoic fluid, SPF allantoic fluid)環境下所做的病毒偵測結果。無額外病毒的尿囊液 是指，從無病毒環境下培養的雞蛋之尿囊液抽取液，為一種近似於鳥類尿液 的溶液。由於它屬於含有許多代謝廢物的生理溶液，其高離子強度以及複雜 環境的背景溶液，對 SiNW-FET 偵測實驗上有許多的不利因素。因此我們特 別以無額外病毒的尿囊液作為背景溶液，來測試元件在修飾後的偵測專一性。

在實驗開始的時候，元件處在無禽流感病毒的尿囊液環境中。在訊號穩定後 我們導入含有 10⁸ virus/mL 禽流感病毒樣品的尿囊液中，我們可以觀測到 一個明顯的訊號抬昇，可見元件在尿囊液的環境下仍然可以具專一性的分別

在實驗開始的時候，元件處在無禽流感病毒的尿囊液環境中。在訊號穩定後 我們導入含有 10⁸ virus/mL 禽流感病毒樣品的尿囊液中，我們可以觀測到 一個明顯的訊號抬昇，可見元件在尿囊液的環境下仍然可以具專一性的分別