實驗結果

登革病毒二次感染引發老鼠嚴重出血

在登革疾病的研究中，目前已有許多的團隊利用老鼠作為研究材料並發表結果。

本實驗室過去模擬蚊子叮咬人類的情況以皮下(intradermally) 注射病毒至老鼠的 方式。實驗結果顯示，在一次感染(4x10⁷PFU)登革第二型 (strain 16681)病毒後三 天，會有 33%比例的老鼠會出血 (Chen et al., 2007; Yen et al., 2008)。在本實驗中 我利用老鼠模式來研究二次感染後老鼠出血的現象。我使用了兩種血清型的登革 病毒 (Hawaii strain as DENV-1 and 16681 strain as DENV-2)，分別在第 0 天注射 低劑量(4x10⁶ PFU)的登革第一型病毒、第二型病毒或 PBS 至老鼠皮下，30 天後， 果顯示二次感染不同型 (heterotypic infection)病毒的老鼠有較高的出血比例 (DENV-2 DENV-1, 50% ; DENV-1 DENV-2, 75%)。這個現象與人類臨床研究 結果相吻合。到目前為止人類的臨床病例顯示大部分出現嚴重 DHF/DSS 的病人 都是由二次感染不同型的登革熱病毒所引起 (Sangkawibha et al., 1984; Thein et al., 1997; Vaughn et al., 2000)。若是第一次感染引起較輕微出血比例的登革第一型 病毒，之後，再給予較嚴重的登革第二型病毒(75%)，這樣的感染方式比起先感

- 22 - (Green et al., 1999b; Kontny et al., 1988)。本實驗中我研磨感染三天後老鼠患處的 出血組織，並利用酵素連結免疫分析法(ELISA)量測均質液中 TNF-α 及 IFN-γ

- 23 - 型病毒，都顯著地高於控制組別，CD4^＋ T 細胞：PBS (7±0.4%)，DENV1DENV2 (18.1 ±3.89%)，DENV2DENV2 (21.2 ±7.88%)；CD8^＋T 細胞：PBS (6.2 ±0.57%)，

DENV1DENV2 (21.7 ±5.13%)，DENV2 DENV2 (20 ±3.35%)，並且 CD69^＋ T 細胞在老鼠感染後會隨著時間而增加，在第 2.5 天時 CD69^＋ T 細胞的百分比會達 到高點，CD4^＋ T 細胞：DENV1DENV2 (41.8 ±1.81%)，DENV2DENV2 (41.85

±2.65%)；CD8^＋T 細胞：DENV1DENV2 (32.2 ±2.91%)，DENV2DENV2 (34.4

±2.86%) (Fig. 4A)。這些結果顯示老鼠經過二次感染後，淋巴結內 T 細胞在第 1 天就會開始活化，並隨著時間持續增加。另外，代表 T 細胞遭遇抗原後所表現 的 effector 相關分子 CD44^hi (Haynes et al., 1989; Johnson et al., 2000)在感染後 1 天 也有顯著的增多，CD4^＋ T 細胞：PBS (13.9 ±1.4%)，DENV1DENV2: (18.8

±1.47%)，DENV2DENV2 (21.4 ±2.57%)；CD8^＋T 細胞：PBS (6.3 ±1.15%)，

DENV1DENV2 (24.2 ±5.72%)，DENV2DENV2 (23.2 ±0.9%) (Fig. 4B)。不同 於 CD69^＋ 的是，CD44^hi 表現量最高點出現在第 1.5 天，CD4^＋ T 細 胞：

DENV1DENV2 (26.3 ±9.51%)，DENV2DENV2 (25.4 ±8.81%)；CD8^＋T 細胞：

DENV1DENV2 (34.7 ±6.25%)，DENV2DENV2 (32.4 ±6.46%)。另外，調控 淋巴球遷移的分子 CD62L (Grailer et al., 2009; Smalley and Ley, 2005)，其 CD62L^low細胞群達到最高點的時間也是出現在感染後第 1.5 天，CD4^＋ T 細胞：

- 24 -

PBS (11.5 ±2.04%)，DENV1DENV2 (26.6 ±5.77%)，DENV2DENV2 (26.2

±8.03%) ； CD8^＋T 細胞： PBS (6.2 ±1.9%) ， DENV1DENV2 (31.4 ±1%) ， DENV2DENV2 (32.04 ±9.86%) (Fig. 4C)。這些結果顯示二次感染後，T 細胞在 第 1 天開始活化表現 CD69，1.5 天表現 CD44 分子並且使 CD62L 表現量下降讓 DENV1DENV2 (8.28 ±2.91%);，DENV2DENV2 (6.8 ±2.26%)；CD8^＋T 細胞：

PBS (3.12 ±0.73%)， DENV1DENV2 (6.7 ±1.88%); ，DENV2DENV2 (7.2

±1.22%) (Fig.5A)。而代表皮膚趨化受器 (chemokine recepter)的 CCR4 也和 CLA 有類似的趨勢，CD4^＋ T 細胞：PBS (2.15 ±1.26%)，DENV1DENV2 (14.6 ±4.24%)，

DENV2DENV2 (15.63 ±4.96%)；CD8^＋T 細胞：PBS (2.65±1%)，DENV1DENV2 (10.25 ±2%)，DENV2DENV2 (13.05 ±3.7%) (Fig.5B)，由此顯示老鼠淋巴結內 的 T 細胞在感染後除了活化外，也表現皮膚趨化分子準備前往皮膚組織。

- 25 -

Fig. 2 的實驗結果顯示老鼠感染後，出血皮膚組織有高量的 TNF-α, 和 IFN-γ。

並在組織中浸潤的 T 細胞可能是來自周邊淋巴結 (Fig. 5)。接下來我想要了解這 些活化並且正準備進入患處的 T 細胞是否表現 TNF-α 和 IFN-γ。我取出感染老 鼠的腋窩淋巴結的淋巴細胞，以 plate-bound anti-CD3 antibody 分別刺激 10⁶淋巴 細胞 6 小時和 24 小時。再以胞內染色法染細胞激素(intracellular cytokine staining, ICS)，分析 CD4^＋和 CD8^＋ T 細胞會表現 TNF-α 和 IFN-γ 的百分比。實驗結果顯 示，一次感染登革病毒後老鼠體內產生 TNF-α 和 IFN-γ 的 T 細胞比例高於控制 組，但其中具有統計上的顯著差異的只有感染登革第二型和感染登革第一型的 IFN-γ^＋CD8^＋ T 細 胞 ， IFN-γ^＋CD8^＋ T 細 胞 ： PBSPBS (0.17±0.07%) ， PBSDENV1 (2.75±2.46%)，PBSDENV1 (5.79±5.23%)。而老鼠接受二次感染 後無論是 DENV-2 DENV-1，DENV-1 DENV-2 或 DENV-2 DENV-2 組別，

TNF-α 和 IFN-γ 的 T 細胞比例都顯著高於未感染病毒的對照組，TNF-α^＋CD8^＋ T 細胞：PBSPBS (0.25±0.08%)，DENV-2 DENV-1 (1.17±0.41%)，DENV-1

DENV-2 (1.12±0.56%)，DENV-2 DENV-2 (0.73±0.41%)；TNF-α^＋CD4^＋ T 細胞：

PBSPBS (0.83±0.12%)，DENV-2 DENV-1 (1.87±0.9%)，DENV-1 DENV-2 (2.08±0.9%)，DENV-2 DENV-2 (1.95±0.86%)；IFN-γ^＋CD8^＋ T 細胞：PBSPBS (0.17±0.07%) ， DENV-2 DENV-1 (4.71±2.13%) ， DENV-1 DENV-2 (4.83±1.57%)，DENV-2 DENV-2 (4±0.88%)；IFN-γ^＋CD4^＋ T 細胞：PBSPBS (0.2±0.07%)，DENV-2 DENV-1 (0.6±0.22%)，DENV-1 DENV-2 (0.71±0.22%)，

DENV-2 DENV-2 (0.64±0.81%)。另外，比較一次感染和二次感染組別也發現到 二次感染老鼠 T 細胞除了 IFN-γ^＋CD8^＋ T 細胞外，其他組別都顯著高於一次感染 的 T 細胞，TNF-α^＋CD8^＋ T 細胞：PBSDNEV1 (0.45±0.21%)，DENV-2 DENV-1 (1.17±0.41%)；PBSDNEV2 (0.57±0.16%)，DENV-2 DENV-2 (0.73±0.41%)；

TNF-α^＋CD4^＋ T 細胞：PBSDNEV1 (1±0.38%)，DENV-2 DENV-1 (1.87±0.9%)；

PBSDNEV2 (1.25±0.59%)，DENV-1 DENV-2 (2.08±0.9%)；IFN-γ^＋CD8^＋ T 細

- 26 -

胞：PBSDNEV1 (2.75±2.46%)，DENV-2 DENV-1 (4.71±2.13%)；PBSDNEV2 (5.79±5.23%) ， DENV-1 DENV-2 (4.83±1.57%) ； IFN-γ^＋CD4^＋ T 細 胞 ： PBSDNEV1 (0.26±0.09%)，DENV-2 DENV-1 (0.6±0.22%)；PBSDNEV2 (0.42±0.17%)， DENV-1 DENV-2 (0.71±0.22%)。顯示二次感染的老鼠病灶淋 巴結內 T 細胞比一次感染的組別有較高的比例產生 TNF-α 和 IFN-γ (Fig. 6A &

6B)。然而，DENV-1 DENV-2 和 DENV-2 DENV-2 組別間沒有差異，也表示 TNF-α 和 IFN-γ 的 T 細胞的活化雖然與出血相關，但非充分條件。另外必須提 醒的是，由於淋巴細胞取於感染後第一天，尚不知出血比例，故所取的淋巴細胞 可能包括出血及不出血的小鼠。

- 27 -

第 四 章

討 論

- 28 - 人是被登革病毒二次感染 (Sangkawibha et al., 1984; Thein et al., 1997; Vaughn et al., 2000)。這些結果顯示接受登革病毒二次感染與登革出血熱有很大的關聯。先 登革第二型病毒會引起較嚴重的 DHF (Sangkawibha et al., 1984)。另外，我們使 用的第二型登革 strain 16681，是從泰國 DHF 病人身上分離而得，這些可能是實 驗中第二型病毒 16681 引起較高出血率的因素之一。為了要排除第二型病毒 16681 引起較高出血率的疑問，之後的實驗可使用另一品系的登革第二型病毒 strain PL046 來重複二次感染之出血實驗。若 strain PL046 做二次感染結果與 strain 16681 趨勢類似，則能表示二次感染組別 DENV1DENV2 出血嚴重的現象並非 僅靠 strain 16681 病毒毒力來引起。