抗體依賴性增強作用

目前在臨床研究上對登革觀察到一些現象: (1)個體在初次感染登革病毒後，對下 一次感染同一型病毒(homotypic serotype)產生保護的效力 (Sabin, 1952)。(2)但若 是第二次感染為不同型(heterotypic serotype)的病毒，則會產生更嚴重的病徵。在 臨床的觀察結果發現，有 90%的登革出血熱病人是由二次感染不同型的病毒 (heterotypic serotype)所引起。而且相較於被同一型(homotypic serotype)病毒感染，

不同型(heterotypic serotype)的病毒感染有高於 15-80 倍的機率會引起登革出血熱 (DHF) (Sangkawibha et al., 1984; Thein et al., 1997; Vaughn et al., 2000)。利用體外 試驗科學家發現，細胞被登革病毒感染的程度，會隨登革病毒特異性血清的加入 而被改變。當加入低量而不足以中和病毒之特異性血清時，將使細胞更容易受到 登革病毒的感染 (Hawkes and Lafferty, 1967)。在恆河猴身上先感染第四型登革病 毒或先注射抗病毒的免疫血清一段時間之後，再感染第二型登革病毒，猴子血液 中病毒含量較一次感染第二型登革病毒的對照組增加(Halstead, 1979; Halstead

- 5 -

and O'Rourke, 1977) 。 對 於 這 些 實 驗 結 果 Halstead 提 出 一 套 假 說 :ADE (antibody-dependent enhancement)，在初次感染登革病毒後，體內所產生的抗體，

在針對第二次接受感染不同型(heterotypic serotype)之病毒，不但不具有保護效力，

還因此藉由 Fc receptor 與抗體-病毒複合體(complex)進行作用，導致單核球細胞 (monocyte)更容易被登革病毒感染。造成宿主產生嚴重的登革出血熱(DHF)。

3.2 T 細胞反應與登革感染的關係

最早發現病人在感染登革病毒後，會引起體內特異性 T 細胞活化的是 Kurane 和 Bukouski 兩位科學家。在 1989 年 Kurane 的研究中，以登革病毒抗原刺激病人周 邊血液單核細胞 (PBMC)引起 CD4 T 細胞的增生並表現 IFN-γ (Kurane et al., 1989)。另外，Bukouski 團隊同年也發現到在感染登革第四型的病人身上分離出 的 CD8 毒殺性 T 細胞的毒殺能力可同時被第二型和第四型的病毒抗原所活化 (Bukowski et al., 1989)。1991 年 Kurane 發現登革出血熱(DHF)急性感染病人血清 中比起登革熱(DF)病人有更高量的 soluble IL-2 receptor (sIL-2R)、soluble CD4 (sCD4)、soluble CD8 (sCD8)及 IFN-γ (Kurane et al., 1991)，顯示了病人體內的 T 細胞在感染登革病毒後全被活化。

在 1995 年 Zivny 等人利用登革第四型病人的周邊血液單核細胞(PBMC)和登 革第四型病毒 NS3 上不同片段的九碼胜肽序列篩選出了毒殺性 T 細胞上面的抗 原決定位置(epitope)。同時也發現到這些感染登革第四型病毒的病人可以交互辨 識(cross-reactive)第二、三、四型的抗原決定位置 (Zivny et al., 1995)。

在 2003 年，Mongkolsapaya 團隊使用了 NS3 片段上具有專一性的 tetramer 來分析病人體內特異性的 CD8 毒殺性 T 細胞，他們發現這群特異性高的 T 細胞 在急性感染期間 (acute phase)會進行大量的細胞凋亡(apoptosis)，另外會有一群 特異性不高的 T 細胞則會進行增生(Mongkolsapaya et al., 2003)。這個結果被認為 和二次登革病毒感染後產生交互辨識(cross-reactive)T 細胞有關。

- 6 -

(四) T 細胞的活化(activation)與招引作用(recruitment) 4.1 T 細胞的活化 癒合(wound healing) 、細胞貼附(cell adhesion)和腫瘤轉移(tumor metastasis)。T 細胞被抗原刺激後表現 CD44，會與血管內皮細胞上的透明質酸(hyaluronate)分子 結合，讓 T 細胞可以從血液流動的狀態轉而貼附到血管壁上，進而讓 T 細胞進 入發炎處。在科學上 CD44^hi常被用來當成 T 細胞活化的標誌 (Haynes et al., 1989;

Johnson et al., 2000)。

L-selectin，又稱 CD62L。是一個調控淋巴細胞遷移(migration)和調控淋巴球

Smalley and Ley, 2005)。

- 7 -

4.2 T 細胞表現的皮膚組織趨化分子

Cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA) ，最早被發現表現在皮膚上的 T 細胞表面，為碳水化合分子(carbohydrate)組成。其配體(ligand)為表現於發炎皮膚 上表皮細胞的 E-selectin。此分子是目前最常被用來診斷如皰疹病毒(HSV)感染、

牛皮癬(psoriasis)等皮膚相關疾病(Rook and Heald, 1995; Rossiter et al., 1994)。

CCR4 為一個 CC 趨化素受器，與 CCL17 和 CCL22 分子結合，主要由 T 細 到登革出血熱(DHF)多為二次感染病例 (Sangkawibha et al., 1984)。目前對於出血 的機制的了解認定可能與細胞激素、抗體依賴性增強反應(ADE)和交叉辨認抗原

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1. 觀察老鼠一次及二次感染後出血現象和出血組織中 TNF-α 及 IFN-γ 表 現。

2. 研究老鼠感染後病灶淋巴結內 T 細胞的活化及表現皮膚趨化表面分子。

3. 研究老鼠感染後病灶淋巴結內 T 細胞 TNF-α 及 IFN-γ 的表現。

- 9 -

第 二 章

材 料 與 方 法

- 10 - 27000 (轉/分鐘)離心濃縮(Millipore Centricon MWCO 1000)，再將病毒濃縮液以 0.22 μm filter 過濾後保存於-80℃冰箱。

- 11 - 洗淨、風乾，即可計算 PFU (plaque forming unit)。

(三) 老鼠感染登革病毒 FITC CD62L MEL-14 rat IgG2a eBioscience PE CD69 H1.2F3 Armenian Hamster BD

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Complete RPMI 1640 medium

RPMI 1640 430 ml

Heat-inactivated fetal calf serum 50 ml Penicillin-streptomycin (100mM 5 ml L-glutamine (200mM) 5 ml Non-essential amino acid (10mM) 5 ml Sodium pyruvate (100mM) 5 ml

℃

- 13 -

Complete DMEM medium

DMEM 430 ml

Heat-inactivated fetal calf serum 50 ml Penicillin-streptomycin (100mM) 5 ml L-glutamine (200mM) 5 ml Non-essential amino acid (10mM) 5 ml Sodium pyruvate (100mM) 5 ml Filter sterilized (0.22 μm) and stored at 4℃

2% DMEM medium

DMEM 460 ml

Heat-inactivated fetal calf serum 20 ml Penicillin-streptomycin (100mM 5 ml L-glutamine (200mM) 5 ml Non-essential amino acid (10mM) 5 ml Sodium pyruvate (100mM) 5 ml Filter sterilized (0.22 μm) and stored at 4℃

PBS

Na₂HPO₄ 23 g

NaH2PO4〃2H2O 5.98 g

NaCl 90 g

ddH2O 1 L

pH adjusted to 7.4 and filter sterilized (0.22 μm)

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RIPA Lysis buffer

Leupeptin 1%

Aprotinin 1%

PMSF 1%

Protease inhibitor cocktail 200:1

Intracellular cytokine staining buffer (for Flow cytometry) 1x Dulbecoo’s PBS buffer 492.5 ml Heat-inactivated fetal calf serum 5 ml Sodium azide (20%) 2.5 ml

pH adjusted to 7.4, filter sterilized (0.22 μm) and stored at 4℃

1% Fixation buffer (for Flow cytometry)

1x Dulbecoo’s PBS buffer 500 ml

paraformaldehyde 1 %

Store in dark at 4℃

Blocking solution (for IFA)

1x Dulbecoo’s PBS buffer 100 ml Heat-inactivated fetal calf serum (5%) 5 ml Prepared in lamina flow in sterilized condition

Fixation buffer (for IFA)

Acetone 200 ml

methanol 200 ml

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Prepared and operated in chemical hood

ELISA coating buffer

NaHCO3 0.1 M

Na₂CO₃ 0.1 M

Adjusted pH to 9.5 and autoclaved

ELISA substrate solution

Tetramethylbenzidine 100 μl

(六) 化學藥劑和實驗器材

Chemicals and reagents Catalog No. Brand

10% Formalin Baso

Agar 213830 Invitrogen

Avertin T4,840-2 Aldrich

Dulbecco’s PBS 02-023-5A Biological Industries Fetal calf serum 04-001-1A Biological Industries

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L-glutamine 25030-081 Gibco BRL

Mounting medium S3023 DAKO

Non-essential amino acid 11140-050 Gibco BRL Penicillin-streptomycin 15140-122 Gibco BRL

Paraformaldehyde P-6148 Sigma

RPMI 1640 23400-021 Gibco BRL

TMB substrate 00-4201-56 eBioscience

Tween 20 X251-07 J.T. Baker

Disposable plastics Brand

5 ml pipet Costar

10 ml pipet Costar

25 ml pipet Costar

6-well culture plate Corning 24-well culture plate Corning 96-well culture plate Corning

25 T Flask Corning

75 T Flask Corning

10 cm2 culture dish Corning

21 G needle Terumo

23 G needle Terumo

10cm² cover slip 信德

FACScan staining tube Falcon Millipore

Silanized Slides DAKO

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Equipments Brand

BH-230 water bath

Centrifuge Kubota

CO2 incubator

FACScanto flow cytometry Becton Dickinson Laminar flow hood Dwyer

SP5 Microscope Leica

(七) 皮膚組織細胞激素測量-酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)

取下感染後老鼠出血組織，秤重後將組織置於400 μl RIPA lysis buffer，於冰上研 磨組織至泥狀。離心後取上清液以 ELISA 測量。

Apply sample or standard:

加入稀釋好的上清液和 standard，將 plate 以保鮮膜包好放置於室溫作用一小時；

每個檢體均做二重複。之後以 wash buffer 洗 5 次。

Incubate with detection antibody:

加入 100 ul 二次抗體(稀釋 250 倍)，放置於室溫一小時。之後 wash 5 次。

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Add avidin-HRP:

加入 100 ul avidin-HRP(稀釋 250 倍)，室溫作用三十分鐘。之後以 wash buffer 洗 5 次。

Add substrate and develop:

取 TMB substrate buffer，每 well 加入 100 ul，避光於室溫作用呈色 5 分鐘。

Stop reaction:

取 2N 硫酸溶液，每 well 加入 50 uL，以波長 450 nm 判讀吸光值。

(八) 淋巴結細胞表面分子螢光染色

以無菌刀械取出老鼠左右兩臂下腋窩淋巴結(brachial lymph nodes)，將淋巴結置 於盛有 1 ml RPMI 的 12 孔培養盤中，輕輕以 5 ml 針筒背面磨出淋巴結細胞，以 1500(轉/分鐘)離心 5 分鐘清洗細胞。取 10⁶淋巴結細胞置於 96 孔 V 型盤，以 4

℃，1500 轉離心十分鐘，將培養液倒掉，加入 200 μl staining buffer 清洗兩次。

將標有螢光染劑的抗體加入100 μl 於 96 孔盤中。染色過程中避光置於 4℃作用 30 分鐘。染色完後以 200 μl staining buffer 清洗，離去沒有黏著的抗體。重複兩 次清洗後，加入200 μl 之 1% paraformaldehyde 固定。最後將細胞移置 FACScan 小管，以流式細胞儀分析。

(九) 胞內細胞激素染色(ICS, intracellular cytokine staining) 山羊抗小鼠 CD3 抗體 coating:

犧牲小鼠前一天取 96 孔平底盤以無菌 PBS 緩衝液稀釋 anti-CD3 抗體成 1 μg/ml 濃度，每孔加入 100 ul，置於 4℃ overnight。

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anti-CD3 抗體刺激培養及胞內細胞激素染色:

以無菌刀械取出老鼠左右兩臂下腋窩淋巴結(brachial lymph nodes)，將淋巴結置 於盛有 1 ml RPMI 的 12 孔培養盤中，輕輕以 5 C.C.針筒背面磨出淋巴結細胞，

以 1500(轉/分鐘)離心 5 分鐘清洗細胞。取 10⁶淋巴結細胞加入 coating 有 anti-CD3 抗體之 96 孔培養盤，另外加入 100 μl 的 RPMI 1640 包含 10% FCS 完整培養液，

置 37℃、5% CO2培養箱中培養 6 或 24 小時。在收細胞前 6 小時加入 2 μM monesin 0.134μl 於每個培養孔內。達時間點時，將細胞離心，以染色專用含有 1% FCS 及 0.2% sodium azide 之緩衝液沖洗兩次。細胞經過洗滌後離心，取其細胞在低 溫下避光染 T 細胞表面抗原 CD4 及 CD8 分子 30 分鐘。30 分鐘後，以緩衝液洗 滌細胞兩次，以移走未黏著之抗體。之後用 4% paraformaldehyde 固定黏上 CD4 與 CD8 的抗體分子。細胞以含有 saponin 緩衝液洗滌兩次，加入 TNF-α 及 IFN-γ 抗體低溫避光染色 30 分鐘。30 分鐘後同樣以含有 saponin 緩衝液洗滌兩次。加 入200 μl 緩衝液懸浮細胞並移置 FACScan 小管，以流式細胞儀分析。

(十) 統計方法

本實驗所使用的統計方法為Student’s t test，當 P<0.05，表示兩組間有顯著差異

- 20 -

第 三 章

實 驗 結 果

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第三章 實驗結果

登革病毒二次感染引發老鼠嚴重出血

在登革疾病的研究中，目前已有許多的團隊利用老鼠作為研究材料並發表結果。

本實驗室過去模擬蚊子叮咬人類的情況以皮下(intradermally) 注射病毒至老鼠的 方式。實驗結果顯示，在一次感染(4x10⁷PFU)登革第二型 (strain 16681)病毒後三 天，會有 33%比例的老鼠會出血 (Chen et al., 2007; Yen et al., 2008)。在本實驗中 我利用老鼠模式來研究二次感染後老鼠出血的現象。我使用了兩種血清型的登革 病毒 (Hawaii strain as DENV-1 and 16681 strain as DENV-2)，分別在第 0 天注射 低劑量(4x10⁶ PFU)的登革第一型病毒、第二型病毒或 PBS 至老鼠皮下，30 天後， 果顯示二次感染不同型 (heterotypic infection)病毒的老鼠有較高的出血比例 (DENV-2 DENV-1, 50% ; DENV-1 DENV-2, 75%)。這個現象與人類臨床研究 結果相吻合。到目前為止人類的臨床病例顯示大部分出現嚴重 DHF/DSS 的病人 都是由二次感染不同型的登革熱病毒所引起 (Sangkawibha et al., 1984; Thein et al., 1997; Vaughn et al., 2000)。若是第一次感染引起較輕微出血比例的登革第一型 病毒，之後，再給予較嚴重的登革第二型病毒(75%)，這樣的感染方式比起先感

- 22 - (Green et al., 1999b; Kontny et al., 1988)。本實驗中我研磨感染三天後老鼠患處的 出血組織，並利用酵素連結免疫分析法(ELISA)量測均質液中 TNF-α 及 IFN-γ

- 23 - 型病毒，都顯著地高於控制組別，CD4^＋ T 細胞：PBS (7±0.4%)，DENV1DENV2 (18.1 ±3.89%)，DENV2DENV2 (21.2 ±7.88%)；CD8^＋T 細胞：PBS (6.2 ±0.57%)，

DENV1DENV2 (21.7 ±5.13%)，DENV2 DENV2 (20 ±3.35%)，並且 CD69^＋ T 細胞在老鼠感染後會隨著時間而增加，在第 2.5 天時 CD69^＋ T 細胞的百分比會達 到高點，CD4^＋ T 細胞：DENV1DENV2 (41.8 ±1.81%)，DENV2DENV2 (41.85

±2.65%)；CD8^＋T 細胞：DENV1DENV2 (32.2 ±2.91%)，DENV2DENV2 (34.4

±2.86%) (Fig. 4A)。這些結果顯示老鼠經過二次感染後，淋巴結內 T 細胞在第 1 天就會開始活化，並隨著時間持續增加。另外，代表 T 細胞遭遇抗原後所表現 的 effector 相關分子 CD44^hi (Haynes et al., 1989; Johnson et al., 2000)在感染後 1 天 也有顯著的增多，CD4^＋ T 細胞：PBS (13.9 ±1.4%)，DENV1DENV2: (18.8

±1.47%)，DENV2DENV2 (21.4 ±2.57%)；CD8^＋T 細胞：PBS (6.3 ±1.15%)，

DENV1DENV2 (24.2 ±5.72%)，DENV2DENV2 (23.2 ±0.9%) (Fig. 4B)。不同 於 CD69^＋ 的是，CD44^hi 表現量最高點出現在第 1.5 天，CD4^＋ T 細 胞：

DENV1DENV2 (26.3 ±9.51%)，DENV2DENV2 (25.4 ±8.81%)；CD8^＋T 細胞：

DENV1DENV2 (34.7 ±6.25%)，DENV2DENV2 (32.4 ±6.46%)。另外，調控 淋巴球遷移的分子 CD62L (Grailer et al., 2009; Smalley and Ley, 2005)，其 CD62L^low細胞群達到最高點的時間也是出現在感染後第 1.5 天，CD4^＋ T 細胞：

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PBS (11.5 ±2.04%)，DENV1DENV2 (26.6 ±5.77%)，DENV2DENV2 (26.2

±8.03%) ； CD8^＋T 細胞： PBS (6.2 ±1.9%) ， DENV1DENV2 (31.4 ±1%) ， DENV2DENV2 (32.04 ±9.86%) (Fig. 4C)。這些結果顯示二次感染後，T 細胞在 第 1 天開始活化表現 CD69，1.5 天表現 CD44 分子並且使 CD62L 表現量下降讓 DENV1DENV2 (8.28 ±2.91%);，DENV2DENV2 (6.8 ±2.26%)；CD8^＋T 細胞：

PBS (3.12 ±0.73%)， DENV1DENV2 (6.7 ±1.88%); ，DENV2DENV2 (7.2

±1.22%) (Fig.5A)。而代表皮膚趨化受器 (chemokine recepter)的 CCR4 也和 CLA 有類似的趨勢，CD4^＋ T 細胞：PBS (2.15 ±1.26%)，DENV1DENV2 (14.6 ±4.24%)，

DENV2DENV2 (15.63 ±4.96%)；CD8^＋T 細胞：PBS (2.65±1%)，DENV1DENV2 (10.25 ±2%)，DENV2DENV2 (13.05 ±3.7%) (Fig.5B)，由此顯示老鼠淋巴結內 的 T 細胞在感染後除了活化外，也表現皮膚趨化分子準備前往皮膚組織。

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Fig. 2 的實驗結果顯示老鼠感染後，出血皮膚組織有高量的 TNF-α, 和 IFN-γ。

並在組織中浸潤的 T 細胞可能是來自周邊淋巴結 (Fig. 5)。接下來我想要了解這 些活化並且正準備進入患處的 T 細胞是否表現 TNF-α 和 IFN-γ。我取出感染老 鼠的腋窩淋巴結的淋巴細胞，以 plate-bound anti-CD3 antibody 分別刺激 10⁶淋巴 細胞 6 小時和 24 小時。再以胞內染色法染細胞激素(intracellular cytokine staining,

並在組織中浸潤的 T 細胞可能是來自周邊淋巴結 (Fig. 5)。接下來我想要了解這 些活化並且正準備進入患處的 T 細胞是否表現 TNF-α 和 IFN-γ。我取出感染老 鼠的腋窩淋巴結的淋巴細胞，以 plate-bound anti-CD3 antibody 分別刺激 10⁶淋巴 細胞 6 小時和 24 小時。再以胞內染色法染細胞激素(intracellular cytokine staining,

在文檔中 探討小鼠在一次和二次登革感染後T細胞反應作用 (頁 13-0)