一、樟芝粗蛋白之測量
水萃取物 酒精萃取物 樟芝 15.82%Protein 12.33%Protein 香杉樹上的樟芝 11.87%Protein 9.89%Protein 人工太空包培養樟芝 62.65%Protein 18.47%Protein
由此表可知，無論是水萃取物、酒精萃取物的粗蛋白含量都是人 工太空包中培養樟芝含量較多。
但是，由於太空包中的樟芝深入培養基交雜生長，無法分離，
因此此數據有些誤差。
二、不同含醣培養基對樟芝醣類合成之影響
1. 醣類的添加對菌絲生長的影響
由全部的生長曲線（圖一至七）看來，前四天是 lag phase，五至 二十天為 log phase。實驗組與對照組相比較之下，實驗中添加的醣類 在不同劑量下幾乎都可增加菌絲的生長。添加 10，20，40，80g/L glucose 的培養基在第 56 天時的相對生長速率分別為 16，26.4，45，和 26。
添加 10，20，40，80g/L galactose 的培養基在第 56 天時的相對生長速 率分別為 31，25.4，47，和 29.4。對 CCRC35396 而言，在培養基中添 加 40g/L 是最有效益的劑量。當 rhamnose，xylose，maltose 成為培養 基中碳的來源時，它們給予的劑量對菌絲生長的影響不顯著。添加 80g/L sucrose 及 maltose 的培養基在第 56 天時的相對生長速率為 33 及 23。
圖一：Glucose(葡萄糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生 長第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表示。
圖二：Xylose(木糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生長第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表示。
圖三：Rhamnose(鼠李糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以 生長第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表 示。
圖四：Galactose(半乳糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生 長第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表 示。
圖五：Fructose(果糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生長 第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表示。
圖六：Sucrose(蔗糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生長 第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表示。
圖七：Maltose(麥芽糖)對培養樟芝菌絲體生長之影響；生長速率以生 長第 n 天的菌絲體直徑相對於第 0 天的接種時菌絲體直徑的比例表 示。
2. 醣類的添加對菌絲細胞中游離醣的影響
運用陰離子交換層析來測定細胞中的游離醣。層析管柱在 90mM NaOH，1ml/min 流速下，可將 myo-inositol，arabitol，ducitol，mannitol，
fucose，rhamnose 及 glucose 於 8 分鐘內分離。（圖八）
用 80%酒精萃取細胞中的游離醣，比較在培養基中不同劑量碳水 化合物及碳源不同時，游離醣的差異。所有偵測到的碳水化合物的範 圍都小於 0.1%的菌絲乾重。在對照組（PDA 中不添加碳水化合物）的 菌絲中，arabitol 和 mannitol 是最主要的游離醣，它們的量分別為 1g 乾重菌絲中含有 1.7mg 及 1.68mg。隨著添加在培養基中 glucose 濃度 的增加（圖九），arabitol 和 glucose 在菌絲中的量也隨之增加。添加的 glucose 量為 10，40，80g/L 時，1g 乾重菌絲中 arabitol 的量為 2.62，
4.95，5.96mg，而 glucose 的量為 1.1，1.1，3.8mg。由於 xylose 劑量的 增加（圖十）對 mannitol 及 glucose 的含量有減少的效果，猜測它能抑 制此兩種醣類的合成。添加的 xylose 量為 10，20，40g/L 時，1g 乾重 菌絲中 mannitol 的量為 1.2，0.64，0.43mg。添加的 xylose 量為 10，20，
40，80g/L 時，1g 乾重菌絲中 glucose 的量為 0.45，0.27，0.21，0.20mg。
添加 rhamnose（圖十一）對菌絲中的 rhamnose 有正相關的影響，對 其它醣類含量無影響。添加的 rhamnose 量為 10，20，40，80g/L 時，1g 乾 重菌絲中 rhamnose 的量為 0.3，0.6，4.0，5.4mg。添加的 galactose（圖十二）
濃度在 40g/L 或低一些時對 glucose 的合成可能有促進的效果，而在高濃度 (801g/L)時則對 glucose 有了抑制的作用。Galactose 添加在培養基的濃度為 10，20，40，80g/L 時，1g 乾重菌絲中 glucose 的量分別為 0.2，0.3，2.4，
10，20，40，80g/L 時，1g 乾重菌絲中 myo-inositol 的量為 0.06，0.06，0.07，
1.00mg。添加的 fructose 濃度低於或相當 20g/L 時，可以引發 mannitol 的合 成，濃度為 10，20g/L 時，1g 乾重菌絲中 mannitol 的量為 4.1 及 7.1mg（圖 十三）。添加 sucrose 於培養基時，mannitol 隨著 sucrose 劑量的增加而增加，
添加的濃度為 10，20，40，80g/L 時，1g 乾重菌絲中 mannitol 的量為 0.7，
2.6，3.6，7.8mg（圖十四）。添加 maltose 於培養基時，在 40g/L 以下的劑 量，mannitol、glucose 隨著 maltose 濃度的增加而增加，高濃度的 maltose 會抑制 glucose 的合成。Maltose 添加的濃度為 10，40，80g/L 時，1g 乾重 菌絲中 glucose 的量為 1.00，4.50，0.01mg。（圖十五）
實驗的對照組使用基本的馬鈴薯培養基(PDA)，所培養出之樟芝菌 絲體 1g 乾重中測得 myo-inositol 的量為 0.005mg，arabitol 的量為 1.7mg，mannitol 的量為 1.6mg，fucose 的量為 0.01mg，而 glucose 的 量為 0.2mg（圖十六）
圖八：七種單糖之 HPLC 分析圖
在 90mM NaOH，1ml/min 流速下，myo-inositol（1），arabitol（2），ducitol
（3），mannitol（4），fucose（5），rhamnose（6）及 glucose（7）於 8 分鐘內分離、
圖九：Glucose(葡萄糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，
mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十：Xylose(木糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，
mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十一：Rhmnose(鼠李糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，
arabitol，mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十二：Galactose(半乳糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，
arabitol，mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十三：Fructose(果醣)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，
mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十四：Sucrose(蔗糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，
mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十五：Maltose(麥芽糖)對培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，
mannitol，fucose 及 glucose 量之影響。
圖十六：對照培養樟芝菌絲體所含 myo-inositol，arabitol，mannitol，
fucose 及 glucose 量之影響
3. 醣類的添加對菌絲細胞中非游離醣的影響
將 80%酒精不溶的菌絲細胞內游離醣加以水解，分析其中的單醣 組成，想了解菌絲是否將菌絲細胞內無法容納的醣類轉而形成細胞壁 等非游離物質。
(圖十七)比較了添加 glucose 及 xylose 的菌絲。細胞壁水解後的單 醣大部分是 glucose，符合 Burczyk 等人於 1995 的報告。隨著 glucose 的添加在 20g/L 以下時,細胞壁及細胞中的 glucose 均有增加，添加的 glucose 量為 0，10，20，40，80g/L 時，1g 細胞壁組成中 glucose 的量 為 2.1，9.2，10.5，9.3 及 8.1mg。1g 菌絲中游離的 glucose 量為 0.2，
1.1，0.4，1.0 及 3.8mg。
添加 xylose 看似可以抑制游離 glucose 的量，而 xylose 對細胞壁 中 glucose 沒多大影響。添加的 xylose 量為 0，10，20，40，80g/L 時，
1g 細胞壁組成中 glucose 的量為 2.1，7.5，3.7，8.9 及 6.0mg。1g 菌絲 中游離的 glucose 量為 0.2，0.4，0.3，0.2 及 0.2mg。
圖十七：葡萄糖及木糖的添加對樟芝菌絲體中游離的葡萄糖及酒精不 溶成分中葡萄糖的影響；EtOH-insoluble hydrolysates 在本實驗中表示
三、相同培養條件下不同種樟芝多醣之測量
經培養的結果（圖十八），35396，35398 較其他生長的更快，培養 18 天即可達 log phase，在醣分析儀圖（圖十九）顯示有三個部分(Ⅰ, Ⅱ,
Ⅲ)：(Ⅰ)小分子量，B85、B86、35398 有很多 (Ⅱ)中分子量：子實體中 很多 (Ⅲ)高分子量：子實體有幾個吸收? 但濃度均很低，其他 5 種樟 芝在高分子量處均有 2 至 3 個多醣的吸收? 出現，B71 及 35398 尤其大 量。
圖十八：五種牛樟芝菌絲體在添加葡萄糖培養基之生長情形；生長速 率以生長第 n 天的菌絲乾重相對於第 0 天的菌絲乾重的比例表示。經 培養後 35396 與 35398 兩菌株生長速度較其他菌株快，培養 18 天即可 達生長對數期(log phase)。
圖十九：牛樟芝多醣的高效液相層析 (HPLC)圖譜。在室溫下，90 分鐘內醋 酸鈉(NaOAc)由 100~700mM 梯度，90 mM 氫氧化鈉的條件下分析。圖中顯 示子實體(fruit bodies)含有很多中分子 量化合物，以及有幾個高分子量化合 物吸收峰，但是濃度均很低。
B85、B86、35398 菌株有很多分子量 較小的化合物，但是在高分子量處均 有 2 至 3 個多醣的吸收峰出現，B71 菌株及 35398 菌株尤其含有大量的吸 收峰。
上述小分子量化合物，係指分布在延 滯時間 30 分鐘以前的吸收峰；中分子 量化合物，係指分布在延滯時間 30~65 分鐘的吸收峰；高分子量化合物，係 指分布在延滯時間 66~90 分鐘的吸收
四、抗乙型肝炎病毒活性之測定
抗 B 型肝炎病毒實驗，用 Ms-G2 cell 抵抗 B 型肝炎病毒的程度來 評估五種樟芝多醣之抗病毒能力，發現 B86 同時對 HBsAg 及 HBeAg 均有顯著之抑制作用，其 Anti-HBsAg 的抑制比率比 1,000 units/ml 的 α-干擾素較高，B71、B85、35396、35398 皆比 250 units/ml 的 alfa 干 擾素有效，而只有 B86、35398 有 Anti-HBeAg 的活性，其有效性比 1,000 units/ml 的α-干擾素低，但比 250units/ml 的α-干擾素高(圖二十、圖 二十一)。
控制組之 AST(I.U./L)為 14-25 (I.U./L)，而α-干擾素及不同樟芝多 醣體對培養細胞的 AST 釋放並沒有增加，仍在 14-25 (I.U./L)範圍內，
表示均無細胞毒性(表一)。
圖二十: α-干擾素(units/ml)及五種培養樟芝多醣體之抗 B 型肝炎表面 抗原活性，對病毒增生抑制的百分比依下公式計得到：
抑制百分比＝(對照組 OD 值-樣品 OD 值) / 對照組 OD 值。
圖二十一：α-干擾素(units/ml)及五種培養樟芝多醣體之抗 B 型肝炎 e 抗原活性，對病毒增生抑制的百分比依下公式計得到：
抑制百分比＝(對照組 OD 值-樣品 OD 值) / 對照組 OD 值。
表一：五種培養樟芝菌絲多醣體之抗 HbsAg 及抗 HbeAg 活性
Table 5. Anti-HBsAg and Anti-HBeAg Effects of the Five Cultured Mycelia Polysaccharide Isolated from Antrodia camphorata
Treatments
µg/ml (Inhibition %)HBsAg
HBeAg
(Inhibition %)
AST
(I.U./L)
Control 2.5 µl/ml 0 0 14-25
α-Interferon 1000 units/ml 250 units/ml 100 units/ml
50.4 ± 3.1 Each value represents the mean ± standard deviation obtained from 3 repeated experiments.
第五章 討論
galactose 的生長速率最高，但 80g/L galactose 生長速率反而降低，添 加 glucose 亦有此情形，並非添加劑量增加，生長速度就增加，而是找 到一最適當的濃度。另外，rhamnose，xylose，maltose 對菌絲生長影 響不顯著，是故，找出最適當的醣類與劑量，對菌絲的生長速度最佳，仍有繼續研究的空間。
就醣類添加物對菌絲細胞中游離醣的影響，glucose 增加 arabitol 和 glucose 的量，fructose 增加 mannitol 的量，scrose 增加 mannitol 的 量，這些醣類的合成均有正向的增加。但添加 rhamnose 對其他醣類並 無促進合成的現象；而，添加 galactose 在 40g/L 時 glucose 量增加，在 80g/L 時反而減少，低濃度促進 glucose 合成，高濃度反而抑制，這種 情形在添加 mannitol 時，對 glucose 的影響亦相同。由於添加 Xylose 對 mmanitol 及 glucose 含量均有減少的作用，猜測木醣能抑制其合成，
本實驗，印證菌絲的細胞壁水解後的單醣大部分是 glucose，且在相同 的培養條件下，35396 及 35398 生長的速度最快。
評估五種樟芝多醣體，發現 B86 及 35398 對 HbsAg 及 HbeAg 均 有明顯的抑制作用。就 Anti-HbsAg 而言，五種均有活性，且皆比 250units/ml 的α干擾素有效。就 Anti-HbsAg 而言，只有 B86，35398 有活性，其有效性比 1000units/ml 的α干擾素差，但比 250units/ml 的 α干擾素佳。
本論文所用之生物活性測定模式(bioassay model) 為 MS-G2 細胞 株，此乃人類肝癌細胞株 Hep G2 經轉染(transfection)帶有 HBV DNA 及 neomycin resistance 基因的質體，經 G418 篩選得到，此細胞株有乙 型肝炎病毒 DNA 嵌入，且已形成一個穩定的細胞株，故可持續地生產 具有活性的 HBV 病毒體，為 HBV permanent expression system(85)。
本論文所用之生物活性測定模式(bioassay model) 為 MS-G2 細胞 株，此乃人類肝癌細胞株 Hep G2 經轉染(transfection)帶有 HBV DNA 及 neomycin resistance 基因的質體，經 G418 篩選得到，此細胞株有乙 型肝炎病毒 DNA 嵌入，且已形成一個穩定的細胞株，故可持續地生產 具有活性的 HBV 病毒體，為 HBV permanent expression system(85)。