4-1 合成銀奈米粒子
圖 4-1 是以 SEM 拍攝表面修飾 Tiopronin 銀奈米粒子的照片，計 算300 顆銀奈米粒子的平均尺寸為 15.2±4.1 nm，可知銀奈米粒子的 粒徑分佈相當廣，為非均一的粒徑分佈。在圖4-2EDX 光譜圖中可測 得元素C、N、O、S、Ag、Si 以及 Pt 的訊號，其中 Si 及 Pt 屬於背 景物質(矽晶片與鉑膜)，由測得的元素訊號可代表 Tiopronin 分子確 實有鍵結在銀奈米粒子表面上。
圖4-1以SEM偵測，表面修飾Tiopronin的銀奈米粒子之照片 粒徑平均為 15.2±4.1 nm
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圖4-2銀奈米粒子的EDX光譜
電子顯微鏡加速電壓為 10 keV，可得 C、N、O、S、Ag、Si 以 及Pt 的訊號。
4-2 探討不同比例的雙水相系統
首先探討 PEG 1500 和 K2HPO4形成的雙水相系統，分別配製不 同比例的PEG 和 K2HPO4，總共配製九個比例，見表 4-1。由圖 4-3-1
~ 4-3-8 的 SEM 圖所觀察到的結果，我們由這九個比例發現到一個趨 勢，當使用的K2HPO4濃度過高時(20%)，都會導致下層相的銀奈米 粒子容易形成聚集，但是當K2HPO4濃度過低時(10%)，則不管 PEG 濃度如何變化都不會有銀奈米粒子分佈到上層相。只有在 K2HPO4適 當的濃度，使用較高濃度的PEG，此時銀奈米粒子的不同顆粒大小才 會有不同分佈的現象，我們也另外使用PEG 600、1000、2000 和 K2HPO4雙水相系統各別配製相同九個比例，發現K2HPO4濃度在10%
或20%情況下，所產生的趨勢都是和使用 PEG 1500 一樣。最後實驗 結果以No.8，PEG 20%(w/w)、K2HPO4 15%(w/w)、DI water 65%(w/w) 組成的雙水相系統會有一個最佳的萃取效果，此時上層相分佈較大顆
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粒的銀奈米粒子，平均粒徑大小為17.2±5.3 nm，下層相分佈較小顆 粒的銀奈米粒子，平均粒徑大小為10.8±1.6 nm，且可以明顯看出下 層相銀奈米粒子的粒徑標準差比上層相來得小很多；另外由圖 4-4 銀 奈米粒子的UV-Vis 吸收光譜圖也得到相同的結果，No.8 系統下層相 的銀奈米粒子因為平均粒徑較小，所以測出來的最大吸收值波長跟原 本的銀奈米粒子樣品比較，有藍位移的現象，反之上層相的銀奈米粒 子因為平均粒徑較大，所以測出來的最大吸收值波長跟原本的銀奈米 粒子樣品比較，有紅位移的現象。
使用 PEG-K2HPO4的雙水相系統，我們知道上層相以PEG 的成 分較多，疏水性作用力較強，下層相以 K2HPO4的成分居多，靜電作 用力較強，可以推斷，如果下層相的K2HPO4濃度偏高，在下層相的 銀奈米粒子會因為離子強度過高而呈現較不穩定的情況，此時如果我 們提高PEG 的濃度，則銀奈米粒子會因為疏水作用力增強，傾向分 佈到較穩定的上層相。
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表4-1ATPS:PEG 1500 + K2HPO4 + DI water配製比例 單位:重量百分比
No. PEG 1500(%) K2HPO4(%) DI water(%)
1* 10 10 80
2 10 15 75
3 10 20 70
4 15 10 75
5 15 15 70
6 15 20 65
7 20 10 70
8 20 15 65
9 20 20 60
No. 1*:沒有形成雙水相系統
PEG 1500 = Polyethylene glycol (M.W. 1500) No. : 雙水相系統編號
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圖4-3-1銀奈米粒子在No.7上層相 SEM圖片
No.7: PEG 1500(20%) K2HPO4(10%) DI water(70%) 平均粒徑: N/D
圖4-3-2銀奈米粒子在No.7下層相 SEM圖片
No.7: PEG 1500(20%) K2HPO4(10%) DI water(70%) 平均粒徑:14.9±4.2 nm
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圖4-3-3銀奈米粒子在No.8上層相 SEM圖片
No.8: PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:17.2±5.3 nm
圖4-3-4銀奈米粒子在No.8下層相 SEM圖片
No.8: PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:10.8±1.6 nm
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圖4-3-5銀奈米粒子在No.9上層相 SEM圖片
No.9: PEG 1500(20%) K2HPO4(20%) DI water(60%) 平均粒徑:18.9±4.5 nm
圖4-3-6銀奈米粒子在No.9 下層相 SEM圖片 No.9: PEG 1500(20%) K2HPO4(20%) DI water(60%) 平均粒徑:聚集
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4-3 改變不同萃取條件參數
我們使用系統 No.8，PEG M.W. 1500 20%(w/w)、K2HPO4 15%(w/w)、DI water 65%(w/w)，具有最佳萃取效果的雙水相系統來 進行更進一步的探討，藉由各別改變PEG 的分子量、雙水相系統的 pH 值以及萃取時候的溫度，觀察對於萃取結果有何影響。
4-3-1 PEG 分子量
我們使用三組不同 PEG 分子量的雙水相系統進行測試，No.10 為PEG 600，No.11 為 PEG 1000，No.12 為 PEG 2000，由圖 4-5-1 ~ 4-5-6 的SEM 圖可觀察到，在使用 PEG 600 的雙水相系統，銀奈米粒子在 上層相並沒有分佈，且在下層相是聚集的狀況，在使用PEG 1000 的 系統下，銀奈米粒子在下層相還是聚集的情形，但是上層相開始有分 佈少量的銀奈米粒子，平均顆粒大小是 18.8±5.3 nm，在使用 PEG 2000 的系統下，發現銀奈米粒子也有不同粒徑大小有不同的分佈，此時上 層相銀奈米粒子平均粒徑是16.0±4.0 nm，下層相平均粒徑是 11.2±1.7 nm。系統 No. 8 的上層相平均粒徑為 17.1±5.2 nm，可以看出使用 PEG 2000 系統上層相的平均粒徑開始往下降的趨勢，表示 PEG 2000 系統 的上層相，對於小顆粒的銀奈米粒子，比PEG 1500 系統的上層相更 有吸引力。基於萃取效率的關係，之後還是以使用PEG 1500 的雙水 相系統為主。
在使用 PEG 不同分子量時，因為低分子量的 PEG，疏水作用力 較弱，所以銀奈米粒子無法分佈到上層相，但是隨著分子量的提高，
則可以觀察到逐漸地有銀奈米粒子分佈到上層相。而有文獻提到[49]，
PEG 從低分子量到高分子量與 K2HPO4所組成的雙水相系統的相圖中
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(可參考圖 2-1)，其中節線的部分，低分子量的 PEG 節線斜率比高分 子量的PEG 來得小，表示即使 PEG 低分子量與高分子量各別配製相 同比例的雙水相系統，PEG 低分子量的下層相 K2HPO4的濃度還是會 比用高分子量PEG 配製出來的系統來的高，所以這可能是我們在測 PEG 600 &1000 時的系統，下層相的銀奈米粒子會聚集的原因。
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圖4-5-1銀奈米粒子在No.10上層相 SEM圖片
No.10: PEG 600(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑: N/D
圖4-5-2銀奈米粒子在No.10下層相 SEM圖片 No.10: PEG 600(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:聚集
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圖4-5-3銀奈米粒子在No.11上層相 SEM圖片
No.11: PEG 1000(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:18.8±5.3 nm
圖4-5-4銀奈米粒子在No.11下層相 SEM圖片
No.11: PEG 1000(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:聚集
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圖4-5-5銀奈米粒子在No.12上層相 SEM圖片
No.12: PEG 2000(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:16.0±4.0 nm
圖4-5-6銀奈米粒子在No.12下層相 SEM圖片
No.12: PEG 2000(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:11.2±1.7 nm
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4-3-2 萃取溫度
我們進行了四個不同溫度的萃取測試，No.13 為 30℃，No.14 為 35℃，No.15 為 40℃，No.16 為 45℃。由 SEM 拍攝出來的圖可以發 現，隨著溫度的提高，上層相的平均粒徑由17.0±4.7 nm 逐漸下降到 14.3±3.8 nm，而下層相的平均粒徑只有些許增加，到最後產生聚集的 現象。而由圖 4-7-1 與 4-7-2 銀奈米粒子的 UV-Vis 吸收光譜圖，由波 峰的強度以及位移的現象，可以推斷，隨著溫度的升高，下層相較小 粒徑的銀奈米粒子逐漸往上層相移動，導致下層相的光譜波峰強度逐 漸下降，而上層相的光譜波峰強度逐漸上升，也因為較小粒徑的銀奈 米粒子逐漸往上層相移動，使得上層相的光譜波峰位置逐漸產生藍位 移，與SEM 圖得到粒徑和溫度的趨勢結果是相同的。
在測試萃取溫度時，因為雙水相系統上下層相組成的比例本身就 會受到溫度影響而有所改變，文獻指出[50]，隨著溫度的提高，此時 上層相的PEG 濃度也隨之增高，疏水作用力的強度也變大，可能因 為這個原因，使得在高溫環境下，有更多的銀奈米粒子分佈到上層相。
有其他文獻在萃取蛋白質[51]與葡萄糖苷酶[52]時，作者也是做了相 同的解釋，當溫度提高時，原本傾向分佈在下層相的兩個目標物，會 因為上層相的疏水作用力增強，而漸漸往上層相分佈。
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圖4-6-1銀奈米粒子在No.13上層相 SEM圖片
No.13: 30℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:17.0±4.7 nm
圖4-6-2銀奈米粒子在No.13下層相 SEM圖片
No.13: 30℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:11.0±1.8 nm
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圖4-6-3銀奈米粒子在No.14上層相 SEM圖片
No.14: 35℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:14.9±4.3 nm
圖4-6-4銀奈米粒子在No.14下層相 SEM圖片
No.14: 35℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:12.5±2.2 nm
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圖4-6-5銀奈米粒子在No.15上層相 SEM圖片
No.15: 40℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:14.5±4.2 nm
圖4-6-6銀奈米粒子在No.15下層相 SEM圖片
No.15: 40℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:12.8±2.5 nm
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圖4-6-7銀奈米粒子在No.16上層相 SEM圖片
No.16: 45℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:14.3±3.8 nm
圖4-6-8銀奈米粒子在No.16下層相 SEM圖片
No.16: 45℃ PEG 1500(20%) K2HPO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:聚集
圖4
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4-3-3 系統 pH 值
我們進行了四組不同系統 pH 值萃取測試，No.17 為 pH9，No.18 為pH8，No.19 為 pH7，No.20 為 pH6。由圖 4-8-1~4-8-8 的 SEM 圖 可觀察到，上層相的銀奈米粒子平均粒徑隨著pH 值改變只有些許變 化，但是在系統為pH6 時，上層相的銀奈米粒子顆粒數已經少於可
計算平均粒徑的數量，而在下層相的銀奈米粒子，可觀察到隨著pH
值的降低，平均粒徑有上升的趨勢，從10.9±1.7 nm 上升到 14.5±4.7 nm，
而由圖4-9-1 與 4-9-2 銀奈米粒子的 UV-Vis 吸收光譜圖，我們由波峰 的強度以及位移的現象，可以推斷，隨著系統pH 值的下降，上層相 的銀奈米粒子逐漸往下層相移動，導致下層相的光譜波峰強度逐漸上 升，而上層相的光譜波峰強度逐漸下降，也因為較大粒徑的銀奈米粒 子逐漸往下層相移動，使得下層相的光譜波峰位置逐漸產生紅位移，
與SEM 圖得到粒徑和 pH 值的趨勢結果是相同的。
在測試 pH 值時可能也是相同情況，不同的 pH 值環境會改變雙 水相系統組成的比例，文獻指出[50]，隨著 pH 值的降低，此時上層 相的PEG 濃度也隨之降低，疏水作用力變小，可能也是因為這個原 因，導致在 pH 值較低的環境下，上層相的銀奈米粒子回到下層相。
另一個可能原因在雙水相系統形成原理中有提到[35;53]，PEG-Phosph ate 形成的雙水相系統，上層相的 PEG 會和陽離子產生類似水合作用，
抓住陽離子，使得上層相的正電荷數較多，下層相的負電荷數較多，
表面帶負電荷的銀奈米粒子就隨著正負電荷吸引往上層相移動，而隨 著pH 值的下降，銀奈米粒子表面的保護基(Tiopronin)也由原本的負 電荷型態慢慢轉為中性分子，所以又回到了下層相。文獻也有相同的 情況[52;54]，利用改變 pH 值影響蛋白質表面帶的電荷，使得原本表
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面帶負電荷分佈在上層相的蛋白質，當表面變成帶正電荷時傾向分佈 在下層相。
圖4-8-1銀奈米粒子在No.17上層相 SEM圖片
No.17: pH9 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:17.3±5.0 nm
圖4-8-2銀奈米粒子在No.17下層相 SEM圖片
No.17: pH9 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:10.9±1.7 nm
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圖4-8-3銀奈米粒子在No.18上層相 SEM圖片
No.18: pH8 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:17.2±5.3 nm
圖4-8-4銀奈米粒子在No.18下層相 SEM圖片
No.18: pH8 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:12.1±2.6 nm
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圖4-8-5銀奈米粒子在No.19上層相 SEM圖片
No.19: pH7 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:17.4±5.1 nm
圖4-8-6銀奈米粒子在No.19下層相 SEM圖片
No.19: pH7 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:12.9±2.9 nm
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圖4-8-7銀奈米粒子在No.20上層相 SEM圖片
No.20: pH6 PEG 1500(20%) K2HPO4+KH2PO4(15%) DI water(65%) 平均粒徑:N/D
圖4-8-8銀奈米粒子在No.20下層相 SEM圖片
圖4-8-8銀奈米粒子在No.20下層相 SEM圖片