陸 陸
陸、 、 、實驗討論 、 實驗討論 實驗討論 實驗討論
本論文使用恐懼所促之動物驚跳反射 (fear-potentiated startle) 動 物行為模式，並合併神經化學的實驗方法，討論利用 ara-C 做於神
mg 之間。在實驗研究上觀察前人文獻指出利用 ara-C 針對抑制 DNA 重組，投予 ara-C 於小白鼠 (1 g/kg i.p.) 研究恐懼記憶的形成 (約等於中樞投予 1 mM) (Colon-Cesario et al 2006)；對下視丘新生神 經元進行抑制投予 40 µg/day icv(Kokoeva et al 2005)；抑制側腦室壁 (subventricular zone) 的細胞新生投予 6 µg/day icv (Ma et al 2006)。以 上諸多實驗指出 ara-C 確實可以用來作為一抑制神經新生的藥物但 也暗示出在實驗上使用 ara-C 並沒有統一之標準。無論如何我們利 用第二階段之電生理實驗測得 ara-C 於 50 µM 具有神經抑制作用；
於第三階段之動物行為實驗證實利用 ara-C 20 µg (68 µM) 也同樣於 投予 ara-C 後 3 小時發現具有抑制 FPS 的現象產生；另外伴隨第 四階段 TUNEL 之染色排除藥物濃度上過高引起的 DNA 斷裂現象。
證明實驗中所使用的 ara-C 濃度具有藥性且不會造成細胞之損傷。
另外本實驗所使用的條件化恐懼模式需要聲音來當作誘發恐懼 反應的刺激因子，因此對於聲音的敏感度的降低是有可能促進動物無 法表現出學習效果，因此把第一階段，訓練後實驗連續三天每天投予 藥物、第三階段，訓練後 24 小時投予 ara-C 且於投藥後 3、6 小 時觀察行為之原始數據 NA、LN 和 shock activity 的數據也一併呈 現(圖十、十一、十二)，這樣可以更清楚的說明 ara-C 對於 CS-US 配 對學習效果的下降並不是源自 ara-C 降低了實驗動物對於聲音的敏
感度。
在實驗一中我們利用不同時間點的方式投予 ara-C 作為一個神 經新生抑制藥物來觀察 ara-C 是否真的具有抑制條件化恐懼的現象。
發現訓練後 1 到 3 天連續 3 天投予藥物確實會影響到訓練後 10 天恐懼記憶的表現，但是在訓練後 4 到 6 天的連續 3 天投予藥物 並沒有發現此現象產生；其中比較值得注意的是訓練後 1 到 3 天投 予 ara-C 與 4 到 6 天投予 ara-C 的 percent potentiated startle 可 以發現有統計上的差異 (p = 0.008)，且訓練後 4 到 6 天投予 ara-C 與訓練後 1 到 3 天投予 ACSF 在 percent potentiated startle 不具 有統計上之差異，支持了訓練後 1 到 3 天內神經的改變對於日後恐 懼記憶之表現具有影響存在。然而此影響是否真的來自於 ara-C 對於 新生細胞抑制作用而非來自於 ara-C 的其他影響呢？
於第二階段之電生理實驗，利用離體電生理測量杏仁核，使用 50µM ara-C 灌流後可以使突觸後興奮電位訊號變小，並且可以藉由 ACSF 的灌流去除 ara-C 所造成的抑制現象，證明了 ara-C 有確實 具有抑制神經傳導的功能，且此急性效果是屬於可逆性的。於是利用 第三階段之行為動物實驗，利用恐懼所促進隻驚跳反應進行動物實驗 並且中樞投予 ara-C 以期望可以由動物行為來觀察到短時間內
ara-C 對於恐懼記憶的影響。在選用濃度上使用 20 µg/10 µl，有文獻 指出大鼠腦體積大約為 1.2 ml (Bunyamin et al 2001) 換算之後其在 腦中的濃度約為 68 µM 趨近於電生理的實驗藥量。在實驗 3-1、3-2 中分別呈現兩個時間點，分別為訓練後 24 小時投予 ara-C，並於 ara-C 投予後 3 小時以及 ara-C 投予後 6 小時，在實驗數據上 ara-C 投予後 3 小時具有抑制恐懼記憶表現的現象，但是在 ara-C 投予後 6 小時此現象便會消失。行為與電生理的證據兩者相互證明 ara-C 對於條件化恐懼學習有一急性的抑制作用，並且此抑制作用可 隨時間而減少，並不造成長時間的影響。
由上述實驗結果可以得知兩點結論，一、於訓練後 1 到 3 天連 續三天每天投予 ara-C 可以抑制十天後的條件化恐懼學習之表現。
二、Ara-C 具有一急性藥性，且此藥性並不會造成長時間的影響。再 由以上兩點結論我們可以更進一步提出兩個疑問，一、於訓練後 1 到 3 天連續三天每天投予 ara-C 抑制了十天後的條件化恐懼學習之表 現既然不是來自於 ara-C 的急性作用，那造成此結果之原因為何？
二、Ara-C 具有一急性作用是透過何種機制產生？
問題一中，有文獻使用水迷宮 (water maze) 為行為模式研究空間 記憶與神經新生間的關係，實驗指出神經新生越多越可以使空間記憶
增加 (Drapeau et al 2003)。支持了第一階段連續三天投予 ara-C 抑制 了條件化恐懼之表現可能是透過抑制了神經新生現象而產生。另外在 前人文獻中也指出 ara-C 的投予在長時間的觀察下發現 ara-C 具有 影響樹突 (dendrite) 結構改變的能力 (Chang et al., 2008)。也提供了 另一種可能造成訓練後 1 到 3 天連續給要下影響了第十天的條件 化恐懼表現的原因。
問題二，有文獻利用細胞作為實驗模式，利用高劑量的 ara-C (100 µM) 下是會引起細胞的凋亡 (Cha et al 2005)，然而藉由第四階段之 TUNEL 染色可以排除此原因。另外有文獻指出利用 1 µM 的 ara-C 處理會增加海馬迴神經細胞株對麩胺酸的易感性上升 (或降低細胞 對麩胺酸耐受性)，導致本來不會引起細胞興奮性毒殺的藥量，在 ara-C 作用下反而引發了細胞興奮性毒殺導致細胞凋亡的情形產生 (Ahlemeyer et al 2002)。雖然此實驗在 ara-C 使用濃度上與本論文實 驗並不相同，且此文獻利用細胞株為實驗模式不同於活體實驗，然而 卻提出了 ara-C 具有改變神經細胞對於麩胺酸的靈敏度。先前文獻 指出有很多分子可以藉由蛋白酶短暫的磷酸化或去磷酸化先前存在 的分子、麩胺酸受體或離子孔道，可短暫地改變神經傳導物質對突觸 後細胞的作用效應 (Goosens et al 2000; Huang & Kandel 1998;
Mayford et al 1996)。也有文獻指出經由改變神經突觸間的一些接受器
可以去改變記憶的形成，像是直接對杏仁核注射 partial NMDA receptor agonist 可促進消減作用 (extinction)，而預先使用 NMDA receptor antagonist (+)HA-966 則可拮抗 D-cycloserine 之促進作用 (Walker et al 2002b)。總而言之，麩胺酸是中樞神經系統中最主要的 興奮性胺基酸，其亦參與學習與記憶之過程 (Collingridge & Lester 1989)。改變突觸間對於麩胺酸的接受確實可以影響記憶的形成。
總結以上，本研究支持了 ara-C 在急性效果內會影響神經功能，
但其影響非不可逆之損傷。對於長時間的抑制神經新生的作用並不會 造成影響，支持 ara-C 可以利用於長時間神經新生抑制的觀察以及 提供 ara-C 再使用上的影響，最後期盼未來可以對 ara-C 影響神經 功能上有更詳細的機制。