探討阿糖胞苷在條件化恐懼中扮演的急性影響
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(2) 目 錄 壹、 中文摘要 (Abstract in Chinese)----------------------------------------2 貳、 英文摘要 (Abstract in English)---------------------------------------- 3 參、緒論 (Introduction) 一.. 研究背景 (Research background)-----------------------------------6. 二.. 研究目的 (Research aim)--------------------------------------------18. 肆、研究材料與方法 (Materials & methods) 一.. 實驗動物 (Animals)------------------------------------------------- 20. 二.. 實驗藥品 (Drugs)---------------------------------------------------- 20. 三.. 電生理學紀錄法 (Electrophysiological recording)-------------- 21. 四.. 立體定位手術 (Stereotaxic surgery)-------------------------------23. 五.. 藥物投予方式 (Drug injection)------------------------------------ 24. 六.. 注射位置之確定 (Verification of the injection site)--------------24. 七.. 恐懼所促進之動物驚跳反射 (Fear-potentiated startle)------- 25. 八.. 灌流 (Perfusion) 以及擷取腦組織 (Brain dissection)---------29. 九.. 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry, IHC)------------- 30. 十.. 統計方法 (Statistics)------------------------------------------------ 33. 伍、 實驗結果 (Results)------------------------------------------------------35 陸、 實驗討論 (Discussion)-------------------------------------------------47 柒、 參考文獻 (References)------------------------------------------------ 54 捌、 附圖/表 附圖 表 (Figures & tables)------------------------------------------- 59. 1.
(3) 壹、中文摘要 阿醣胞苷是胞嘧啶的異構物長期用於急性白血病的治療，但是阿 醣胞苷同時也是實驗上常用於抑制神經新生方面的研究藥物。在前人 研究中指出當條件化恐懼訓練之後投予阿醣胞苷於大白鼠 (1000 mg/kg body weight, i.p) 具有抑制條件化學習，這項研究支持了 DNA 重組參予條件化恐懼學習的過程，但是阿醣胞苷是否還有除了影響 DNA 重組以外的功能參予其中呢？本實驗利用大白鼠的離體胞外電 生理記錄法 (in vitro extracellular electrophysiological recording)、恐懼 所促進的驚跳反應 (fear-potentiated startle)、TdT-mediated dUTP end labeling (TUNEL) 染色來進行討論。 從實驗結果顯示經由阿醣胞苷處理的大白鼠腦片具有抑制杏仁 核興奮性突觸後電位 (EPSP) 的能力，並且在大白鼠行為訓練後二十 四小時中樞投予阿醣胞苷可以影響投予藥物後三小時的恐懼記憶，但 是不影響投予藥物後六小時的恐懼記憶，證實阿醣胞苷對恐懼記憶的 影響隨時間遞減。由於在先前的研究中指出高劑量的阿醣胞苷具有神 經毒殺的效果，因此實驗利用 TUNEL 染色來作為判斷投予此實驗 劑量的阿醣胞苷對神經是否有毒殺效果。實驗結果顯示於三小時以及 六小時的老鼠腦片中並沒有發現有細胞凋亡的現象。 最後，實驗結果支持了阿醣胞苷在短時間內可能會影響神經突觸 功能。期盼未來可以對阿醣胞苷影響神經傳導上有更明確的機制，並 且可以更深入的了解阿醣胞苷對於人類行為可能產生的影響。 2.
(4) 貳、英文摘要 Cytosine arabinoside (Ara-C) is a cytidine analogue which is routinely used in chemical therapy of acute myeloid leukemia. It has been also used as an anti-neurogenesis agent. Recent study showed injection of ara-C in rats (1000 mg/kg body weight, i.p) after fear condition learning can affect consolidation. They concluded that DNA recombination is an essential process for the consolidation of conditioned fear. We concerned that ara-C treatment may have other effects on the fear conditioning instead of inhibition DNA recombination. We used in vitro electrophysiological recording, fear-potentiated startle paradigm and TUNEL assay to test this amygdala. Our results showed superficial infusion of ara-C inhibited EPSP level in the amygdala region. Additional groups of animal were subjected for fear-potentiated startle test. Ara-C was administrated into the bilateral ventricle 24 hrs after fear conditioning. Results showed that acute ICV infusion of ara-C blocked expression of learned fear in a temporal pattern. It had significantly blockage effect of conditioned fear within a 3 hrs interval but did not show any inhibitory effect in the 6 hrs interval. Previous studies suggested higher doses of ara-C have neurotoxic effect. We used TUNEL assay to test the possible toxic effect of the ara-C dose we used in this experiment. Parallel groups of animals were scarified exactly the same time point according to the behavioral test results. No significant positive signal of TUNEL assay had been found in the ara-C treated animals. In conclusion, results obtained from this study suggest ara-C may 3.
(5) have acute effects on the synaptic transmission. Further experiments are required to elucidate the detail mechanism of ara-C acute effects on the synaptic transmission and to obtain a clear picture regard to the possible behavioral toxic effect of ara-C in human.. 4.
(6) 參、緒論 (Introduction). 5.
(7) 参、緒論 一、研究背景 A. 情緒性記憶 (Emotional memory) 1. 記憶之分類與形成 記憶不是一種單純的認知功能，而有各種不同面貌，可依照各種 不同特質加以分類。若依據記憶後提取的方式分類，可分為陳述性記 憶 (declarative) 和非陳述性記憶 (non-declarative)，又稱為外顯 (explicit) 或內隱 (implicit) 的記憶，此分法最早是在 1927 年由心理 學家 McDougal 提出，前者為有意識的回憶過去發生的事；後者則 屬於自動化和反射的反應。陳述性記憶是屬於事實、念頭及事件的記 憶，是可把記憶回憶出來的，例如回憶今早跟朋友的談話內容；非陳 述性記憶學習，則無法清楚的以言語陳述，而是以行為的表達來顯示 其記憶，很多運動和視覺上的技能習慣、情緒的學習及基本的反射反 應皆屬於非陳述性記憶。不同形式的非陳述性記憶在大腦的不同區域 表現，如杏仁核 (amygdala)、小腦 (cerebellum)、紋狀體 (striatum)， 即為了反射反應所特別用到的特定知覺和運動系統 (Richardson 1996; Squire & Zola 1996)。 透過臨床和實驗的觀察，記憶亦可以依據儲存在大腦的時間長短 來分類。1880 年代，德國心理學家 Ebbinghaus 提出記憶的兩個重 6.
(8) 要原則：第一，他發現記憶有不同的生命期限，有些記憶很短，只能 記得幾秒鐘或幾分鐘；有些可以記得幾天甚至幾年。第二，重複性的 學習使記憶維持得較久。美國心理學家 James 後來將這些發現給予 一個清楚量化的分野，把其稱為短期記憶 (short term memory) 和長 期記憶 (long term memory)。短期記憶可以持續幾秒鐘或幾分鐘，長 期記憶則可以持續幾小時、幾天、幾年，甚至終生 (Squire & Zola 1996)。 當外界之刺激訊息輸入後，至於記憶形成，通常都需經歷下述階段， 即學習獲得 (acquisition)、記憶固化 (consolidation)、記憶再現 (retrieval) 及再學習獲得 (reacquisition) 之過程。一旦新訊息經學習 獲得記憶固化後，便進入中期記憶型態；若再經由不斷再學習獲得或 記憶再現，而使記憶型態再次固化 (reconsolidation)，便可進入長期 記憶。. 2. 情緒記憶與杏仁核 (Amygdala) 情緒是一種「非意識形態」的心路歷程，不但會影響動物的生活 作息，更賦予其多采多姿的感受。在自然的環境下，生物隨時得面臨 捕食與被捕食的生死關頭，因此情緒反應對於生物的存活更具重要性， 使動物面對危險時，受到外界環境刺激做出快速的打或逃反應，以增 加其生存的機會。因此，在面對自然環境威脅時，動物產生本能的防 衛反應是必然的，包括恐懼的行為與情緒的表現 (Marks 1987)。在 7.
(9) 1950 年代時，科學家便提出情緒的學習和反應來自於大腦的邊緣系 統 (limbic system)。許多研究報導指出這種因為恐懼與驚嚇所引起的 防衛反應，主要是源自於大腦顳葉內的杏仁核 (amygdala) 所調控， 其不僅在情緒記憶的習得扮演重要的角色，亦會影響非習得情緒的表 達 (Walker and Davis, 1997)。因此當杏仁核受到傷害時，動物雖面對 大自然環境的威脅，不僅不再感到恐懼，也不再有防衛的動作，甚至 連恐懼情緒的表達都受到干擾 (Davis 1992; Davis et al 1994)。 有研究利用正向追蹤劑 (anterograde tracer) 的方式，探討情緒反 應產生在大腦中的神經路徑，利用腦損傷實驗分別破壞各投射的腦區。 結果發現，當杏仁核被破壞後，情緒的學習就無法形成了 (LeDoux et al., 1986)，也就是說杏仁核可能是掌管情緒學習和反應最重要的區域。 當動物受到情緒刺激時，此刺激在腦中會分別進行兩個不同的途徑， 一是經由視丘直接投射到杏仁核，同時另一個路徑則是上傳至感覺皮 質區之後再傳至杏仁核 (Doron & Ledoux 2000; LeDoux et al 1990)。 在老鼠身上，恐懼的刺激訊息從視丘送到杏仁核大約需要十二毫秒， 若先經感覺皮質再送至杏仁核則約需十九毫秒的時間。這顯示了較短 的神經路徑使得情緒系統可以立即的對危險作出危機反應，而較遠的 路徑則是可以經過大腦皮質的思考、判斷或評估後，再投射到杏仁核去 修正情緒反應 (Killcross et al 1997; LeDoux et al 1990)。 8.
(10) 3. 條件化恐懼模式 (Fear conditioning) 條件化恐懼 (fear conditioning) 是常被用於研究情緒學習和恐懼 記憶形成機制的動物模式 (Davis 1992)，此行為模式是經由先給予動 物一個無傷害性的條件刺激 (conditional stimulus；CS)，例如燈光或 聲音等，隨後再配合一個嫌惡性的非條件刺激 (unconditional stimulus； US)，例如給予電擊。經過幾次配對，使動物習得條件刺激 (CS) 與 非條件刺激 (US) 間的配對連結後，當單獨給予條件刺激 (CS) 時， 會誘發動物表現出面對非條件刺激 (US) 時之行為與生理的反應：例 如驚嚇反射增加、血壓上升、心跳加速、呼吸困難或是僵直、制約的 情緒反應等等，這些反應與動物在面臨大自然環境威脅時的行為表現 極為相似。並且，一旦動物學習到條件刺激與非條件刺激間的關連性 後，雖然只給動物單獨的條件刺激而未給非條件刺激，就算經歷一段 時間後，還是會引發動物產生如同面對非條件刺激時的行為反應，這 種現象與記憶模式和長期的神經可塑性非常符合 (Davis 1992; Myers & Davis 2002)。本實驗所使用來研究恐懼情緒記憶的模式是恐懼所促 進之動物驚跳反應 (fear-potentiated startle)。包括人類在內的許多動 物，如果已處於一個較緊張或恐懼的狀態時，其更易受到驚嚇。 因此，本實驗模式除了利用上述的條件化恐懼 (conditioned fear) 原理，先將無傷害性的條件刺激 (CS)-燈光，與嫌惡性的非條件刺激 9.
(11) (US)-足部電擊進行配對學習，而後進行測試時，再將一個高分貝的 聲音和燈光一起或單獨出現。當高分貝聲音和燈光同時出現時，老鼠 的驚跳反應往往會比單獨只出現高分貝聲音時還要來的大。此外，恐 懼能夠大幅增加驚跳反應的強度，這是非常符合我們直觀的判定。當 我們害怕時，一個微不足道的聲響也會加大我們的恐懼程度，而且在 恐懼的狀態下，驚跳反應可以持續較久的一段時間。和其他的恐懼行 為指標相比較，驚跳反應具有以下幾個特點：(1) 驚跳反應在行為上 相當明確而容易量化，不僅可以從整體行為去測量，也可以測量單一 肌肉的肌電圖，因此即使部分癱瘓的受試者也能測量驚跳反應。這在 研究行為的神經機制上，有很大的方便性及優點。(2) 驚跳反應與恐 懼程度有正向關係，恐懼愈大，驚跳愈高。這有別於在其他行為上， 恐懼往往是扮演抑制性的角色。因此，以驚跳幅度測量恐懼，不會受 到底限效應的影響。(3) 驚跳反應的神經迴路已相當清楚，有助於研 究恐懼記憶形成之神經機制 (Davis 1992)。. 4. 恐懼學習之分子機制 (Molecular mechanism of fear learning) 新經驗的獲取來自學習，而保留經驗靠的是記憶。從細胞層次來 說，整個學習記憶的過程，可能是因神經細胞與神經細胞間突觸的聯 繫變強，或是訊息傳導的頻率改變 (Hebb et al 1994)。但這些改變的 內在分子機制為何？神經突觸傳導中的長期增益現象 (long-term 10.
(12) potentiation；LTP) 是一種與活性有關的突觸可塑性形式，且在學習 與記憶中扮演著極重要的角色。長期增益現象被公認為是大腦神經細 胞儲存訊息的方式，也是學習與記憶的細胞基礎模式。這個現象最早 在 1973 年，由 Bliss 等人首先發現，在兔子海馬迴 (hippocampus) 的齒狀回 (dentate gyrus) 區域的顆粒狀神經細胞元 (granule cell)。藉 由其輸入神經路徑 perforant pathway，給予高頻率連續性的電刺激 (tetanus stimulation；TS)，會造成突觸後電位 (postsynaptic potential) 長期增加的現象發生，可以持續數小時之久，稱之為長期增益現象 (Bliss & Lomo 1973)。在大腦海馬迴及杏仁核皆可發現此現象，利用 紀錄細胞外區域電位的技術，分別在海馬迴-杏仁核路徑 (Maren & Fanselow 1995) 以及視丘-杏仁核路徑 (Rogan et al 1997) 觀察到長 期增益現象，進一步推論哺乳動物杏仁核和海馬迴，對於記憶的形成 和神經突觸傳導中的長期增益現象有著密切的關係，杏仁核的不同投 射路徑可能分別涉及不同作業類型的恐懼制約學習。研究發現已學得 恐懼記憶的老鼠，在其大腦杏仁核有長期增益的現象，且利用藥理性 的方法抑制長期增益現象的表現，也破壞了恐懼記憶的形成與表現 (Yaniv & Richter-Levin 2000)。 此一結果提供長期增益效應與記憶有高度的相關性，雖然目前沒 有辦法證實長期增益效應就是記憶，但是利用動物行為實驗和誘發長 11.
(13) 期增益現象的實驗技術的結合，提供我們很多長期記憶形成的分子機 制，但大多以海馬迴為主要研究領域。由於杏仁核在情緒記憶和其他 記憶的重要性逐一被證實，近年來杏仁核在長期記憶形成中的訊號傳 遞、基因和蛋白質改變、機轉之研究愈來愈多。很多的實驗報告指出， 無論是在無脊椎動物(如海兔和果蠅等)，或是脊椎動物(如大鼠)，其 記憶的分子機制是需要細胞外神經傳導物質的刺激強度改變，如麩胺 酸 (glutamate)、血清素 (5-HT)…等，和次級信使 (second messenger)， 例如 cAMP 或 Ca2+ 等訊號傳導路徑活化細胞內的一些蛋白激酶 (protein kinases)，有 protein kinase A (PKA) 或 mitogen-activated protein kinase (MAPK)，而這些蛋白酶短暫的磷酸化或去磷酸化先前 存在的分子、受體 (receptors) 或離子孔道 (ion channels)，可短暫地 改變神經傳導物質對突觸後細胞的作用效應 (Davis 2002; Goosens et al 2000; Huang & Kandel 1998; Mayford et al 1996)。 其中麩胺酸 AMPA 類受體 (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor) 是廣泛存在中樞神經細胞上的興奮性神經傳 導物質麩胺酸的受體，當突觸前細胞釋放麩胺酸至突觸時，會使 AMPA 型接受器打開，讓鈉離子流入突觸後 (post-synaptic) 神經元， 使突觸後神經元產生去極化。當去極化產生之後進一步打開 NMDA receptors，使 NMDA receptors 本身的離子通道打開，使生理離子中 12.
(14) 的鈉、鉀和鈣離子進行通透，這時鈣離子會接合調鈣素 (calmodulin) 形成複合物，以 Ca2+-calmodulin complex 的型式與下游分子作用， 短時間內可以興奮神經，長時間可以改變分子的表現影響神經可塑 性。. 13.
(15) B. 阿糖胞苷 (Cytosine arabinoside, Cytarabine, Ara-C) 1. 基本介紹 Ara-C 在 1960 年於歐洲被發現然後於 1969 年被美國食品藥 物管理局認可並且被 Upjohn 藥廠製造並且命名為 Cytosar-U。 Ara-C 是屬於核苷酸 (nucleotide) 相似物的化療藥物，長期用來治療 急性骨髓性白血病 (acute myelogenous leukemia, AML)、惡性血液疾 病 (hematological malignancies) (Beard & Fairley 1974; Ellison et al 1968; Keating et al 1982)。其主要作用在於藉由抑制 DNA 的重組達 到抑制癌症細胞的效果，目前也普遍使用於神經新生實驗之抑制劑。. 2. 基本的化學組成與物化性質 Ara-C 其醫療藥用價值源自於其化學結構。結構示為 (圖一) 所 示。主要包含了一個胞嘧啶 (cytidine) 以及一個阿拉伯醣 (arabinoside)，組成一個類似三磷去氧胞苷 (dCTP, deoxycytidine triphosphate) 的結構。經過定量、品管要求後的 ara-C 為無臭的白色 結晶粉末製劑能完全溶於水，微溶於酒精和氯仿。Ara-C 主要是透過 三個方式影響 DNA 的複製。方法如下： a. 抑制 DNA 合成酶 (DNA polymerase) 的活性： 的活性 Ara-C 透過主動運輸進入細胞之後，在去氧胞苷激酶 (deoxycytidine kinase) 的作用下被磷酸化成為一磷阿醣胞苷 14.
(16) (Ara-CMP)，接下來再轉化成為二磷阿醣胞苷 (Ara-CDP) 最後變成具 有活性的三磷阿醣胞苷 (Ara-CTP)。Ara-CTP 具有抑制 DNA 聚合酶 的作用而抑制了 DNA 的合成 (Grant 1998)。 b. 和 dCTP 互相競爭： 互相競爭： Ara-CTP 本身也可以與 dCTP 互相競爭以嵌入 DNA 中，Ara-C 嵌入 DNA 後，生長中的 DNA 螺旋會再加入一個核苷酸，此 DNA 的合成即完全被抑制 (Grant 1998)。 c.抑制去氧核糖 抑制去氧核糖 (deoxyuceotide) 的產生： 的產生： Ara-C 也具有抑制核苷酸還原酶 (ribonucleotide reductase) 的作 用，藉由阻止核醣核苷酸 (nucleotide) 還原成去氧核糖核苷酸 (deoxynucleotide) 進而抑制 DNA 的合成 (Grant 1998)。. 3. 臨床用藥濃度以及其實驗用量 臨床上 ara-C 的使用濃度需要配合使用的次數跟病人的年紀還 有癌症的種類而有所調整，下列舉出一些臨床文獻所用的使用藥量。 急性骨髓性白血病 (acute myelogenous leukemia) 低劑量靜脈投予 1 g/m2，高劑量靜脈投予 3 g/m2。神經系統淋巴瘤 (Primary CNS lymphomas) 靜脈投予 3 g/m2。急性白血病 (Acute leukemia) 靜脈投 予 1 g/m2 (DeAngelis et al 1992; Slevin et al 1983; Sutoh et al 2003)。 另外在動物實驗方面也有文獻利用 ara-C 做研究，例如針對抑制 15.
(17) DNA 重組，投予小白鼠 1 g/kg i.p (約等於中樞投予 1 mM)(Colon-Cesario et al 2006)；細胞研究方面針對人類正常的大腸上 皮細胞株 (normal colonic epithelial cell line) 半生長抑制濃度 (half maximal inhibitory concentration, IC50) 約等於 67.4 ± 11.1µM (Cha et al 2005)。. 4.神經新生現象 神經新生現象 (neurogenesis) 與記憶 神經新生現象 (neurogenesis) 或是新生的神經細胞，在早期的認 知中只會出現在發育中的器官而不會出現於成熟的器官當中，於 1977 年神經新生現象在老鼠發育成熟的腦部被發現，分別出現在於 海馬迴 (hippocampus) 的齒狀迴 (dentate gyrus, DG) 和嗅球 (olfactory bulb, OB) (Kaplan & Hinds 1977)。自從這現象被發現之後， 越來越多的文獻專注於不同物種是否在相同腦區也有神經新生現象 的產生，之後陸續在小白鼠 (mice)(Kempermann et al 1997)、田鼠 (voles) (Ormerod & Galea 2001)、非人類靈長類 (Bernier et al 2002; Gould et al 1999)，甚至在人類 (Eriksson et al 1998) 都有在這些區域 發現有神經新生的現象。 成熟的腦部發生神經新生是甚麼原因引起的呢？目前已知大多 伴隨著一些刺激，有病理的原因像是中風 (ischemia) ( Kuge et al., 2009 )、腦部創傷 (traumatic brain injury, TBI)(Sun et al 2008)，有藥物 16.
(18) 引發的 (Sehara et al 2007)，也有因環境的改變 (Kaplan 2001) 而誘發 的。 然而新生的神經元扮演的又是一個甚麼機制呢？神經新生是否 可以影響記憶呢？在前人文獻中指出新生的神經元可以有兩個可能 的功能，一、取代舊有神經元並且執行舊有神經元的相同功能。二、 加入舊有神經網路中，形成新的神經網路，並且執行不同於舊有神經 網路的新功能 (Lledo et al 2006)。並且於空間記憶 (spatial memory) 已經被證實神經新生細胞的數目增加可以有助於獲得更好的記憶 (Clark et al 2008)。. 17.
(19) 二、研究目的 A. 釐清 ara-C 的投予是否影響神經的傳導。 B. 釐清條件化恐懼形成後投予阿醣胞苷對於恐懼記憶的影響。. 18.
(20) 肆、研究材料與方法 (Materials & methods). 19.
(21) 肆、研究材料與方法 一、 實驗動物 (Animals) 成年雄性 Wistar 大白鼠，體重約 250 g ~ 400 g (購自台灣大學實 驗動物研究中心)，於進行實驗手術前一禮拜購入並將其飼養於師大 生命科學系之動物房，手術前每 4 隻大白鼠放置於同一籠飼養，手 術後則個別置於籠具中單獨飼養。動物房內採 24 小時自動溫濕調控， 室溫約維持於 26 ~ 28 ℃，照明採 12 / 12 小時光暗週期調控，早上 10 點亮燈、晚上 10 點關燈，動物房清潔之維護由動物房工作人員 負責，本研究隻動物實驗均經由國立台灣師範大學實驗動物管理委員 會之省查及監督。. 二、實驗藥品 (Drugs) A. 藥品來源及作用 1. Ara-C 購置 SIGMA-Aldrich 大藥廠，藉由抑制三磷去氧胞甘 (dCTP, deoxycytidine triphosphate) 的結構來抑制 DNA 的合成。 2. 人工腦脊髓液 (artificial cerebral spinal fluid, ACSF) 配製藥品皆 購置 SIGMA-Aldrich 大藥廠，藉由多種鹽類的配置達到跟人體 腦脊髓液相類似的緩衝液。 3. 血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ) 購置 SIGMA 大藥廠，藉由影響下 20.
(22) 視丘之口渴中樞使投予後引發口渴的行為產生。 4. TdT-mediated dUTP end labeling (TUNEL) assay 此組 kit 購置 SIGMAL 大藥廠. 三、離體胞外電生理學紀錄法 離體胞外電生理學紀錄法 (In vitro extracellular electrophysiological recording) A. 試劑 電生理灌流使用之 ara-C (50 µM /100 ml) 250 µM 保存液 (避光保存) Ara-C. 100 mg. ddH2O. 1.644 ml. 使用時取 250 µM 保存液 20 µl 加入 100 ml ACSF 配製完成 ACSF 10 倍保存液 NaCl. 1170 mM. KCl. 47 mM. CaCl2. 25 mM. MgCl2. 12 mM. NaH2PO4. 26 mM. 使用時取 10 倍保存液 100 ml 在加入 11 mM glucose、 25mM NaHCO3 加水到 1 L 配置完成 21.
(23) B. 方法 首先進行杏仁核腦薄片製備 (amygdala slice preparation) 先將 5 週年紀的大鼠利用不鑄鋼動物斷頭台 (guillotine) 將其斷頭犧牲。以 剪刀剪開頭皮，再利用小骨剪將腦上之頭蓋骨剪除，之後以小鑷子將 腦膜 (dura) 挑開，並以取腦扁平器具將視神經與腦殼分離，將大腦 放入裝有 4℃ 冰的人工腦脊髓液 (artificial cerebrospinal fluid , ACSF) 的燒杯中，實驗過程中腦組織皆放置於持續供給 95 % O2 和 5 % C02 混合氣體之腦脊髓液中。之後將大腦倒入鋪有濾紙的培養皿中，並使 大腦持續浸潤於充有混合氣體的 ACSF 中。接著用解剖刀將整個小 腦切除，並將大腦對切分為左右半腦，並以快乾膠固定於載物台上， 再置於震動切片機 (vibroslice) 的水槽中。以刀片進行水平切法 (horizontal section) 的方式將大腦切成厚度約 400 µm 的腦薄片 (brain slice)。取含有杏仁核 (amygdala) 的腦薄片，於室溫下靜置至 少 1 小時再進行實臉。 使用胞外電生理學紀錄法，將杏仁核腦薄片移至紀錄槽 (recording chamber) 中，以黏有尼龍細線的不鏽鋼環固定杏仁核腦薄 片，並使 ACSF 覆蓋。灌流的速率為每分鐘維持 2-3 滴的流速(視 情況而調整)，並利用循環式加熱器使紀錄槽內溶液的溫度維持在 32℃ 左右。準備好之後，將雙極型刺激電極 (bipolar stimulus 22.
(24) electrode) 擺放在 (basolateral amygdala；BLA) 區域，紀錄電極擺放 於杏仁中央核 (amygdaloid central；CeA) 的區域，以誘發突觸後興 奮性電位的反應 (excitatory postsynaptic potential; EPSP)。呈穩定狀態 後，開始記錄突觸的基礎訊號 (baseline)，20 分鐘後，確定其反應穩 定後開始切換成 ara-C 進行灌流，灌流的速率為每分鐘維持 2-3 滴 的流速(視情況而調整) 20 分鐘後再切換 ACSF 進行沖洗，觀察其變 化。. 四、 立體定位手術 (Stereotaxic surgery) 所有手術均採用 sodium pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) 進行麻醉， 動物於麻醉後利用電動削髮剪剔除頭皮上方之毛髮，再利用酒精做表 面消毒然後固定於立體定位儀上 (David Kopf instruments, Tujunga, CA)，切開頭皮使頭蓋骨露出隨即利用止血鉗將傷口擴張並固定(可同 時於傷口處滴入數滴雙氧水，消毒傷口並可同時清除血污，方便手術 進行)，劃定座標 (bregma) 位置後，於頭蓋骨鑽孔並植入鋼管 (model C313G；Plastic Products, USA)，植入部位及座標為 bilateral ventricle (AP : - 0.4 mm ; DV : -4.2 mm ; LM : ± 1.5 mm from bregma)，利用鋼 釘於頭蓋骨上進行固定，按照座標埋入鋼管後，利用牙科粉固定鋼管， 最後輕輕鎖上管蓋避免飼養時鋼管內部阻塞。手術後的動物將分開單 獨飼養，動物於手術後靜待7天待其傷口癒合後再進行後續之行為實驗。 23.
(25) 五、藥物投予方式 (Drug injection) 我們利用中樞給藥 (central administration) 的方式利用下述之立 體定位手術配合微量注射針筒 (model 7105KH, Hamilton) 及微量注 射器 (model 102 microdialysis pump, CMA) 抽取藥物，並以毛巾包裹 動物(防止動物於注射期間掙扎逃走)，用手輕輕取出鋼管內之管蓋， 徐徐放入注射針後，先靜候一分鐘再開始注射，利用微量注射器等速 (1µl / min) 注射，注射完畢後再等候一分鐘緩慢取出注射針，再放入 用 75% 酒精消毒好之管蓋。. 六、注射位置之確定 (Verification of the injection site) A .試劑 試劑 AngiotensinⅡ(1 µg / µl) AngiotensinⅡ. 10 mg. ACSF. 10 ml. 分裝後避光冷凍保存。. B.方法 方法 在手術完成後休養 1 禮拜後於實驗前 1 天，利用上述之投予方 式投予血管張力素Ⅱ (angiotensin Ⅱ) 2 µl，如果埋管位置正確處於側 腦室內，則會迅速誘發實驗動物產生喝水的反應。. 24.
(26) 七、 恐懼所促進之動物驚跳反射 (Fear-potentiated startle) A. 行為實驗儀器 (Behavior apparatus) 由恐懼所促進之動物驚跳反應之測定，採用購自美國 San Diego Instrument (model CA92126) 之行為箱，此行為箱內部附有電擊桿以 及燈光顯示器，於儀器底部有一壓力感應器 ( accelerometer)，當動物 由於聲音刺激或電極產生驚跳反應時，所引發之重力變化，會經由壓 力感應器轉換成電子訊號，傳送至控制儀器之電腦中，原廠所附之程 式將記錄動物驚跳反應之大小，驚跳反應之強度被定義為刺激呈現 200 ms 內所產生之最大震動。. B . 試劑 動物行為實驗投予之 ara-C (2 µg /1 µl) Ara-C. 100 mg. ACSF. 50 ml. 分裝後避光冷凍保存。. C. 行為實驗程序 (General behavior procedures) 所有實驗將進行以下之實驗程序，它包括馴化階段、條件化恐懼 訓練前驚跳測試、條件化恐懼訓練、訓練後測試(或為條件化恐懼訓 練後驚跳測試)，主要之分組依據是根據條件化恐懼訓練前驚跳測試， 25.
(27) 排除無明顯驚跳反應之動物，其主要原因為排除可能具有運動功能或 知覺障礙之動物。茲分述各階段實驗動物處理如下：(Lu et al 2001; Walker et al 2002a) 1. 馴化階段 (acclimation) 於實驗開始之前 3 天，每天將動物置放於行為箱中 10 分鐘， 這是為了讓大白鼠熟悉背景音所籠罩的環境，主要目的是使老鼠對此 完全未接觸過之環境能漸漸熟悉，進而降低其自發性的探索行為，以 免在之後的正式記錄中，受到了自發行為活動量的干擾。每個階段之 背景音量的設定皆固定於 70 分貝，稍微高於行為箱外的室內音量， 如此一來可以隔絕外部噪音之干擾，以確保所有的刺激皆來自於儀器， 此階段結束之後把動物放回籠具內。 2. 條件化恐懼訓練前驚跳測試 (match) 連續 2 天將動物置放於行為箱內，給予連續 30 次 95 分貝之 聲音刺激，並記錄由聲音所引發之大白鼠驚跳反應，無明顯驚跳反應 之動物將排除於實驗外，因這些動物可能具有聽覺或運動功能的障礙， 對實驗構成不良之影響。此階段之數據，代表動物單純接受聽覺刺激 之反應，可視為一個參考的基準值，是日後需於訓練階段進行藥物處 理時，常態化分組之憑藉。 3. 條件化恐懼 (conditioned fear) 26.
(28) 於前述測試結束 24 小時後，動物被放置於行為箱中接受 10 次 燈光—足部電擊之配對訓練 (light-shock pairing)，足部電擊(非條件化 刺激, US)將於燈光(條件化刺激, CS)呈現 3.2 秒時給予，電擊強度為 0.6 mA 持續一秒鐘，每次訓練之間隔為 4 分鐘，訓練動物時同時記 錄其由電擊所引發之驚跳反應。 4. 短期測試 (short test) 於條件化訓練後 24 小時，動物重回行為箱中靜待 5 分鐘，給 予 10 次燈光合併聲音刺激(light-noise, LN)(95 分貝)，以及 10 次單 獨聲音刺激(noise alone, NA)(95 分貝)，並記錄其驚跳反應，由恐懼所 促進之驚跳反應 (FPS)，其計算方法為利用燈光合併聲音刺激時之平 均反應，除以單獨由聲音刺激所引發之平均反應，兩者之差即為 FPS。 為便於計算及減少個體差異對實驗數據之影響，驚跳反應將採以百分 比方式計算 (percent potentiated startle)，舉例說明如 ( 圖二 )。 以 control 組為例，某動物於測試時其 light-noise pairing 及 noise-alone 之反應分則為 100 及 50，FPS 等於兩者之差即 50 (100 - 50 = 50)，FPS 再除以 noise alone 之數值 (FPS / noise alone = 50 / 50 = 1)，即 percent potentiated startle，等於 100 %。. 27.
(29) D. 條件化恐懼不同階段的實驗設計 根據 Fanselow 1998 所提出條件化恐懼實驗操作，在不同之時間 點給予藥物或破壞腦區分別代表動物在學習條件化恐懼之不同階段 表現：獲得 (acquisition of conditioned fear)、固化 (consolidation of conditioned fear)、表現 (expression of conditioned fear)。本實驗選擇恐 懼記憶形成之後的表現來做研究的重心：. expression of conditioned fear. 測試前給藥. 本實驗依據以上實驗流程 1 到 3 天先給予 ACSF 主要目的是 使實驗動物習慣給藥的動作，之後於訓練後 24 小時依照實驗設計中 樞投予 20 µg /10 µl ara-C 或 ACSF，並且於給藥後依照實驗設計之 時間點進行行為之觀察測試，並於測試結束後犧牲進行分子方面的實 驗。. 28.
(30) 八、灌流 (perfusion) 以及擷取腦組織 (brain dissection) A..試劑 試劑 生理食鹽水 (1 L) Sodium Chloride. 0.9g. 加水到 1L. 10Ⅹ Phosphate Buffered Saline (10ⅩPBS) (1,000 ml) NaH2PO4. 2.03 g. Na2HPO4. 11.49 g. NaCl. 85 g. 4 % 三氯甲醛 (paraformadehyde) Paraformadehyde. 40g. 10ⅩPBS. 100 ml. 溶解加水到 1L. B.方法 方法 當實驗動物經過測試之後便立即將老鼠予以麻醉處理，然後在通 風櫥內將大白鼠固定在板子上，夾起胸骨箭突處的毛皮並以剪刀剪開 皮膚，夾起箭突將胸骨剪斷，以括胸鉗沿著箭突兩側把肋軟撐開，以 小手術剪，剪開心包膜，露出心臟，用平滑手術鑷夾住心臟後，再以 預先備妥內裝有生理鹽水的鈍型針頭插入左心室，深入到主動脈處， 29.
(31) 以止血鉗夾住針頭後，打開灌流幫浦，並將右心耳剪開，讓血液流出。 待 200 毫升的生理食鹽水灌流完畢，將灌流幫浦接到 4 % 三氯甲醛 (paraformadehyde) 固定液處並灌流。 當灌流結束後斷頭犧牲，老鼠斷頭後從枕骨大孔剪出缺口，用虎 鉗掀開頭蓋骨，再用小型鑷子剔除腦膜及結締組織，以不傷害腦組織 為原則，用小平匙輕輕地將腦與腦殼分離。將腦組織取出並浸泡在冰 冷 4 % 三氯甲醛固定液進行後固定處理。. 九. 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry, IHC) A. 冷凍組織切片 (Freezing section) 灌流結束後於第 2 天取出後固定的腦組織將其浸泡至 20 % sucrose 中待腦組織下沉後在將其浸泡至 30 % sucrose 待其下沉，此 步驟主要目的是將腦組織中的水份置換避免冷凍切片時產生冰晶破 壞腦組織，再利用冷凍切片機進行切片，厚度為 25 µm，切出所需之 部位，位置之確認主要根據 Paxinos and Watson 所繪製之標準化腦部 立體定位圖 (Paxinos and Watson, 1997)。. 30.
(32) B. 染色方法以及步驟 TdT-mediated dUTP end labeling(TUNEL)assay 1.試劑 試劑 DNaseI (200µl) 10X DNaseI buffer. 20µl. ddH2O. 178 µl. DNaseI (RNase free). 2 µl. Terminal deoxynucleotidyl transferase (100µl) 5X TdT buffer. 20 µl. 25 mM CoCl2. 6 µl. 10 mM dATP. 0.75 µl. Alexa-488 dUTP. 0.25 µl. Terminal transferase. 0.5 µl. ddH2O. 72.5 µl. Blocking solution (1 ml ) Donkey serum. 20 µl. Tween 20. 5 µl. Triton X-100. 5 µl. Sodium Azide. 5 µl. 1X PBS. 965 µl. 31.
(33) 2.方法 方法 利用 free float 的方法處理組織切片於 6 well 細胞盤中，先利用 0.1M, PH 7.4 的 PBS 緩衝液清洗 3 次每次 5 分鐘(之後每步驟處 理過程中間都利用 PBS 進行清洗且其方式都比照此步驟)，接著置於 0.01M Sodium Citrite 中放置於 80℃ 水域槽中進行 antigen retrieval 20 分鐘然後使其降溫至室溫。由於 TUNEL 必須製作 positive control 所以選其中一腦片利用 DNAseI 處理 10 分鐘再以 kit 中 的 1X SSC 處理 15 分鐘終止反應；至於其他不做 positive control 的腦片則正常處理，利用 TUNEL 處理 1.5 小時再以 1X SSC 處理 15 分鐘終止反應。之後利用 Blocking solution 處理 30 分鐘。 由於實驗需求必須證明此細胞為神經細胞，因此必須加染神經元 的標記 NeuN 以及細胞核的標記 DAPI，因此需再加入 mouse anti-NeuN 抗體 (1:500)，4℃作用一晚。隔天再加入 donkey anti-mouse antibody, Alexa 555 conjugated (1:500)，及 DAPI (1:500)， 4℃ 作用 4 小時，之後貼片封片於螢光顯微鏡下觀察。. 32.
(34) 十. 統計方法 所有之條件化恐懼行為實驗結果均採用 percent potentiated startle 方式表示。主要運用 Dunnet t-type test 進行事後組間之比較，p＜0.05 被認定具有統計上之顯著差異。. 33.
(35) 伍、實驗結果 (Results). 34.
(36) 伍、結果 ◆ 第一階段： 第一階段： 探討不同時間點投予 ara-C 影響神經新生現象，是否對於條件 化恐懼學習後恐懼記憶的表現有所影響。. 實驗 1 A. 實驗設計說明 於本實驗中使用 Wistar 雄性大白鼠，依照前述手術處理，並且 經過血管張力素 II 測試以確定埋管位置正確後，依照標準化的條件 化恐懼訓練模式，於第 3、4 天連續兩天進行條件化恐懼訓練前驚跳 測試 (match)，按照老鼠對於 95db 聲音所引發之驚跳表現，將動物 進行分組，使之平均分配於兩組中，讓各組老鼠於條件化恐懼的訓練 時，均具有相似之基本驚跳反應，排除可能具有聽覺或運動功能障礙 之實驗動物。各組分別接受如下之藥物處理： Group one： ：control (n= 12) 為控制組，接受 ACSF 的中樞雙側腦室投予。訓練後 1 到 3 天連. 續每天投予一次。 Group two： ：After train 1 ~ 3 days (n = 10) 以中樞雙側腦室投予的方式投予 ara-C，其劑量為 20 µg/10 µl 注射 速度為 1µl /min。訓練後 1 到 3 天連續每天投予一次。 35.
(37) Group three： ：After train 4 ~ 6 days (n = 10) 以中樞雙側腦室投予的方式投予 ara-C，其劑量為 20 µg/10 µl 注 射速度為 1µl /min。訓練後 4 到 6 天每天一次投予。 以上各組動物皆於條件化恐懼的訓練 (fear conditioning) 經過 10 次的燈光與電擊的配對訓練 (light-shock pairing)，且於訓練後 10 天後神經狀態穩定後進行條件化恐懼訓練後驚跳測試 (post-test)。以 了解 ara-C 是否會影響條件化恐懼之表現階段 (expression)。. 實驗流程如下： 實驗流程如下： Group one： ：control (n= 12). Group two： ：After train 1 ~ 3 days (n = 10). 36.
(38) Group three： ：After train 4 ~ 6 days (n = 7). B. 實驗結果說明 於訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ACSF 之 group one 與訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 之 group two 在於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 (p = 0.009)。 推知訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 之處理會影 響動物對於條件化恐懼之表現 (expression)。但是在訓練後 1 到 3 天 每天一次連續 3 天投予 ACSF 之 group one 與訓練後 4 到 6 天 每 天 一 次 連 續 3 天 投 予 ara-C 之 group three 在 於 percent potentiated startle 上不具有統計上的差異 (p = 0.487)。然而在訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 之 group two 與訓練後 4 到 6 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 之 group three 在於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 (p = 0.036)。實驗結果如(圖 三)。. 37.
(39) ◆ 第二階段： 第二階段： 由第一階段之實驗連續三天每天投予藥物的結果推論於條件化 恐懼訓練後短時間 (1 ~ 3 天) 內投予 ara-C 確實具有抑制條件化恐 懼記憶的表現 (expression) 功能，然而 ara-C 是否本身就具有影響神 經的功能呢？為了進一步探討其機轉，於是利用離體電生理進行了第 二階段之實驗。. 實驗 2 A. 實驗設計說明 本實驗中使用 Wistar 雄性大白鼠，按照前述之實驗步驟利用杏 仁核腦薄片進行離體電生理，並且測量杏仁核在誘發出 EPSP 之後 灌流 ara-C 50µM 是否可以引起，以及利用 ACSF 灌流觀察是否可 以回復 ara-C 造成的影響。. 實驗流程如下： 實驗流程如下：. 38.
(40) B. 實驗結果說明 於杏仁核誘發出 EPSP 之 0 到 20 分鐘期間與 ara-C 開始灌 流後最低點 35 到 45 分鐘期間在 fEPSP 上相比較有顯著的統計差 異 (p= 4.765*10-17)，並且 ACSF 開始清洗後回復其 EPSP 程度為一開 始的 20 分鐘。由此推知 ara-C 在 50µM 具有抑制神經傳導的功能， 並且其作用迅速而且不會對神經造成永久性的傷害(圖四)。. 39.
(41) ◆ 第三階段： 第三階段： 由實驗第二階段的離體電生理結果推論 ara-C 具有抑制神經傳 導的特性，且此特性可借由藥物的清除而回復，於是進一步的藉由恐 懼所促進之驚跳反應行為實驗去觀察是否可以在活體實驗動物上看 到相同的情況，因此為了進一步探討其機轉，進行第三階段之實驗。. 實驗 3-1 A. 實驗設計說明 於本實驗中使用 Wistar 雄性大白鼠，依照前述手術處理，並且 經過血管張力素測試以確定埋管位置正確後，依照標準化的條件化恐 懼訓練模式，於第 3、4 天連續兩天進行條件化恐懼訓練前驚跳測試 (match)，按照老鼠對於 95 db 聲音所引發之驚跳表現，將動物進行 分組，使之平均分配於兩組中，讓各組老鼠於條件化恐懼的訓練時， 均具有相似之基本驚跳反應，排除可能具有聽覺或運動功能障礙之實 驗動物。各組分別接受如下之藥物處理： Group one： ：After ACSF injection 3 hr (n = 7) 為控制組，接受 ACSF 的中樞雙側腦室投藥。 Group two： ：After Ara-C injection 3 hr (n = 8) 利用中樞雙側腦室投予的方式投予 ara-C，其劑量為 20 µg/10 µl 注射速度為 1ul / min。 40.
(42) 以上各組動物皆於條件化恐懼的訓練經過 10 次的燈光與電擊 的配對訓練 (light-shock pairing)，於訓練後 24 小時投予藥物並且於 投藥後 3 小時進行條件化恐懼訓練後驚跳測試 (post-test)，以了解 ara-C 投予後是否會影響條件化恐懼之表現階段 (expression)。. 實驗流程如下： 實驗流程如下：. B. 實驗結果說明 於訓練後 24 小時投予 ACSF，並且於 3 小時後觀察之 group one 與訓練後 24 小投予 ara-C，並且於 3 小時後觀察之 group two(20 µg/10 µl) 在於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 (p = 0.004)。推知訓練後短時間 (3 小時) 之處理會影響動物對於條件 化恐懼之表現 (expression)。實驗結果如(圖五)。. 41.
(43) 實驗 3-2 A. 實驗設計說明 於本實驗中使用 Wistar 雄性大白鼠，依照前述手術處理，並且 經過血管張力素測試以確定埋管位置正確後，依照標準化的條件化恐 懼訓練模式，於第 3、4 天連續兩天進行條件化恐懼訓練前驚跳測試 (match)，按照老鼠對於 95db 聲音所引發之驚跳表現，將動物進行分 組，使之平均分配於兩組中，讓各組老鼠於條件化恐懼的訓練時，均 具有相似之基本驚跳反應，排除可能具有聽覺或運動功能障礙之實驗 動物。各組分別接受如下之藥物處理： Group one： ：After ACSF injection 6 hr (n = 7) 為控制組，接受 ACSF 的中樞雙側腦室投予。 Group two： ：After Ara-C injection 6 hr (n =7) 利用中樞雙側腦室投予的方式投予 ara-C，其劑量為 20 µg/10 µl 注射速度為 1 ul / min。 以上各組動物皆於條件化恐懼的訓練經過 10 次的燈光與電擊 的配對訓練，於訓練後 24 小時投予藥物並且於投藥後 6 小時進行 條件化恐懼訓練後驚跳測試 (post-test)，以了解 ara-C 投予是否會影 響條件化恐懼之表現階段。. 42.
(44) 實驗流程如下： 實驗流程如下：. B. 實驗結果說明 於訓練後 24 小時投予 ACSF，並且於 6 小時後觀察之 group one 與訓練後 24 小時投予 ara-C，並且於 6 小時後觀察之 group two (20 µg/10 µl) 在於 percent potentiated startle 上不具有統計上的 差異 (p = 0.322)。推知訓練後 24 小時投予 ara-C 之處理不會影響 動物於投藥後 6 小時之條件化恐懼之表現。實驗結果如(圖六)。. 43.
(45) ◆ 第四階段： 第四階段： 由實驗第二階段、第三階段的結果由離體電生理以及活體動物行 為實驗確立了 ara-C 對於條件化恐懼學習的表現 (expression) 確實 有一急性之影響。然而是否在活體所觀察到的行為影響是來自藥理濃 度上的毒殺現象。因此為了進一步探討其機轉，進行了第四階段之實 驗利用 TUNEL、NeuN、DAPI 染色去進行神經細胞 DNA 是否有斷 裂現象之確認。. 實驗 4-1 A. 實驗設計說明 於實驗 3-1 中使用的大白鼠，依照之前行為訓練完畢後立即進行 前述的灌流並且取出腦組織之犧牲動作。之後進行 TUNEL、NeuN、 DAPI 染色，以確認是否有神經細胞凋亡的產生。. B. 實驗結果說明 訓練後 24 小時投予 ACSF 後 3 小時後觀察之 group one 與 訓練後 24 小時投予 ara-C (20 µg / 10 µl) 後 3 小時後觀察之 group two 在於 TUNEL 的處理上並沒有看到有神經細胞的凋亡現象，推 論在投予藥物後 3 小時並不會造成藥物濃度過高產生的毒殺現象。 Positive control 實驗結果如(圖七)。正常處理實驗結果如(圖八) 44.
(46) 實驗 4-2 A. 實驗設計說明 於實驗 3-2 中使用的大白鼠，依照之前行為訓練完畢後立即進行 前述的灌流並且取出腦組織之犧牲動作。之後進行 TUNEL、NeuN、 DAPI 染色，以確認是否有神經細胞凋亡的產生。. B. 實驗結果說明 於訓練後 24 小時投予 ACSF 後 6 小時後觀察之 group one 與於訓練後 24 小時投予 ara-C (20 µg / 10 µl) 後 6 小時後觀察之 group two 在於 TUNEL 的處理上並沒有看到有神經細胞的凋亡現 象，推論在投予藥物後 6 小時並不會造成藥物濃度過高產生的毒殺 現象。Positive control 實驗結果如(圖七)。正常處理實驗結果如(圖九). 45.
(47) 陸、實驗討論 (Discussion). 46.
(48) 陸、實驗討論 本論文使用恐懼所促之動物驚跳反射 (fear-potentiated startle) 動 物行為模式，並合併神經化學的實驗方法，討論利用 ara-C 做於神 經新生抑制藥物的過程中是否還具有其他抑制神經新生以外之影響。 實驗發現 ara-C 對於離體電生理具有抑制杏仁核神經傳導的功能， 並且於條件化恐懼學習具有抑制的影響，然而此學習抑制之影響會隨 著給藥後時間的增加而降低其作用效果，證明 ara-C 具有急性且並 非不可逆的改變神經活性之特性。 Ara-C 被廣泛運用在各種癌症治療，由於其抑制細胞之藥理機轉 特性使其普遍使用於研究神經新生現象之實驗。自從 1977 年在老鼠 發育成熟的腦部發現神經新生現象 (Kaplan & Hinds 1977) 之後，越 來越多的相關文獻開始證實人類也有其現象產生，也使得神經新生的 研究趨於重要且熱門，因此一個有效且專一的神經新生抑制藥物對於 未來神經新生的研究必定有一定程度之要求。也因其抑制細胞之藥理 機轉使其對於作用之目標並沒有很好的專一性，因此在使用上必須額 外的小心，在於劑量使用劑量上也需額外的注意。臨床實驗上使用的 藥量是採取連續多天且高劑量的投予藥物或伴隨其他不同的抑癌藥 物合併使用，其劑量單位通常於 g/m2，利用公式 m2=0.012 × 身高 (cm)0.60 × 體重 (kg)0.45 求得其使用濃度每次施打的劑量為 g 到 100 47.
(49) mg 之間。在實驗研究上觀察前人文獻指出利用 ara-C 針對抑制 DNA 重組，投予 ara-C 於小白鼠 (1 g/kg i.p.) 研究恐懼記憶的形成 (約等於中樞投予 1 mM) (Colon-Cesario et al 2006)；對下視丘新生神 經元進行抑制投予 40 µg/day icv(Kokoeva et al 2005)；抑制側腦室壁 (subventricular zone) 的細胞新生投予 6 µg/day icv (Ma et al 2006)。以 上諸多實驗指出 ara-C 確實可以用來作為一抑制神經新生的藥物但 也暗示出在實驗上使用 ara-C 並沒有統一之標準。無論如何我們利 用第二階段之電生理實驗測得 ara-C 於 50 µM 具有神經抑制作用； 於第三階段之動物行為實驗證實利用 ara-C 20 µg (68 µM) 也同樣於 投予 ara-C 後 3 小時發現具有抑制 FPS 的現象產生；另外伴隨第 四階段 TUNEL 之染色排除藥物濃度上過高引起的 DNA 斷裂現象。 證明實驗中所使用的 ara-C 濃度具有藥性且不會造成細胞之損傷。 另外本實驗所使用的條件化恐懼模式需要聲音來當作誘發恐懼 反應的刺激因子，因此對於聲音的敏感度的降低是有可能促進動物無 法表現出學習效果，因此把第一階段，訓練後實驗連續三天每天投予 藥物、第三階段，訓練後 24 小時投予 ara-C 且於投藥後 3、6 小 時觀察行為之原始數據 NA、LN 和 shock activity 的數據也一併呈 現(圖十、十一、十二)，這樣可以更清楚的說明 ara-C 對於 CS-US 配 對學習效果的下降並不是源自 ara-C 降低了實驗動物對於聲音的敏 48.
(50) 感度。 在實驗一中我們利用不同時間點的方式投予 ara-C 作為一個神 經新生抑制藥物來觀察 ara-C 是否真的具有抑制條件化恐懼的現象。 發現訓練後 1 到 3 天連續 3 天投予藥物確實會影響到訓練後 10 天恐懼記憶的表現，但是在訓練後 4 到 6 天的連續 3 天投予藥物 並沒有發現此現象產生；其中比較值得注意的是訓練後 1 到 3 天投 予 ara-C 與 4 到 6 天投予 ara-C 的 percent potentiated startle 可 以發現有統計上的差異 (p = 0.008)，且訓練後 4 到 6 天投予 ara-C 與訓練後 1 到 3 天投予 ACSF 在 percent potentiated startle 不具 有統計上之差異，支持了訓練後 1 到 3 天內神經的改變對於日後恐 懼記憶之表現具有影響存在。然而此影響是否真的來自於 ara-C 對於 新生細胞抑制作用而非來自於 ara-C 的其他影響呢？ 於第二階段之電生理實驗，利用離體電生理測量杏仁核，使用 50µM ara-C 灌流後可以使突觸後興奮電位訊號變小，並且可以藉由 ACSF 的灌流去除 ara-C 所造成的抑制現象，證明了 ara-C 有確實 具有抑制神經傳導的功能，且此急性效果是屬於可逆性的。於是利用 第三階段之行為動物實驗，利用恐懼所促進隻驚跳反應進行動物實驗 並且中樞投予 ara-C 以期望可以由動物行為來觀察到短時間內. 49.
(51) ara-C 對於恐懼記憶的影響。在選用濃度上使用 20 µg/10 µl，有文獻 指出大鼠腦體積大約為 1.2 ml (Bunyamin et al 2001) 換算之後其在 腦中的濃度約為 68 µM 趨近於電生理的實驗藥量。在實驗 3-1、3-2 中分別呈現兩個時間點，分別為訓練後 24 小時投予 ara-C，並於 ara-C 投予後 3 小時以及 ara-C 投予後 6 小時，在實驗數據上 ara-C 投予後 3 小時具有抑制恐懼記憶表現的現象，但是在 ara-C 投予後 6 小時此現象便會消失。行為與電生理的證據兩者相互證明 ara-C 對於條件化恐懼學習有一急性的抑制作用，並且此抑制作用可 隨時間而減少，並不造成長時間的影響。 由上述實驗結果可以得知兩點結論，一、於訓練後 1 到 3 天連 續三天每天投予 ara-C 可以抑制十天後的條件化恐懼學習之表現。 二、Ara-C 具有一急性藥性，且此藥性並不會造成長時間的影響。再 由以上兩點結論我們可以更進一步提出兩個疑問，一、於訓練後 1 到 3 天連續三天每天投予 ara-C 抑制了十天後的條件化恐懼學習之表 現既然不是來自於 ara-C 的急性作用，那造成此結果之原因為何？ 二、Ara-C 具有一急性作用是透過何種機制產生？ 問題一中，有文獻使用水迷宮 (water maze) 為行為模式研究空間 記憶與神經新生間的關係，實驗指出神經新生越多越可以使空間記憶. 50.
(52) 增加 (Drapeau et al 2003)。支持了第一階段連續三天投予 ara-C 抑制 了條件化恐懼之表現可能是透過抑制了神經新生現象而產生。另外在 前人文獻中也指出 ara-C 的投予在長時間的觀察下發現 ara-C 具有 影響樹突 (dendrite) 結構改變的能力 (Chang et al., 2008)。也提供了 另一種可能造成訓練後 1 到 3 天連續給要下影響了第十天的條件 化恐懼表現的原因。 問題二，有文獻利用細胞作為實驗模式，利用高劑量的 ara-C (100 µM) 下是會引起細胞的凋亡 (Cha et al 2005)，然而藉由第四階段之 TUNEL 染色可以排除此原因。另外有文獻指出利用 1 µM 的 ara-C 處理會增加海馬迴神經細胞株對麩胺酸的易感性上升 (或降低細胞 對麩胺酸耐受性)，導致本來不會引起細胞興奮性毒殺的藥量，在 ara-C 作用下反而引發了細胞興奮性毒殺導致細胞凋亡的情形產生 (Ahlemeyer et al 2002)。雖然此實驗在 ara-C 使用濃度上與本論文實 驗並不相同，且此文獻利用細胞株為實驗模式不同於活體實驗，然而 卻提出了 ara-C 具有改變神經細胞對於麩胺酸的靈敏度。先前文獻 指出有很多分子可以藉由蛋白酶短暫的磷酸化或去磷酸化先前存在 的分子、麩胺酸受體或離子孔道，可短暫地改變神經傳導物質對突觸 後細胞的作用效應 (Goosens et al 2000; Huang & Kandel 1998; Mayford et al 1996)。也有文獻指出經由改變神經突觸間的一些接受器 51.
(53) 可以去改變記憶的形成，像是直接對杏仁核注射 partial NMDA receptor agonist 可促進消減作用 (extinction)，而預先使用 NMDA receptor antagonist (+)HA-966 則可拮抗 D-cycloserine 之促進作用 (Walker et al 2002b)。總而言之，麩胺酸是中樞神經系統中最主要的 興奮性胺基酸，其亦參與學習與記憶之過程 (Collingridge & Lester 1989)。改變突觸間對於麩胺酸的接受確實可以影響記憶的形成。 總結以上，本研究支持了 ara-C 在急性效果內會影響神經功能， 但其影響非不可逆之損傷。對於長時間的抑制神經新生的作用並不會 造成影響，支持 ara-C 可以利用於長時間神經新生抑制的觀察以及 提供 ara-C 再使用上的影響，最後期盼未來可以對 ara-C 影響神經 功能上有更詳細的機制。. 52.
(54) 柒、參考文獻 (Refereneces). 53.
(55) 柒、參考文獻 Ahlemeyer B, Kolker S, Zhu Y, Hoffmann GF, Krieglstein J. 2002. Increase in glutamate-induced neurotoxicity by activated astrocytes involves stimulation of protein kinase C. J Neurochem 82:504-15 Beard ME, Fairley GH. 1974. Acute leukemia in adults. Semin Hematol 11:5-24 Bernier PJ, Bedard A, Vinet J, Levesque M, Parent A. 2002. Newly generated neurons in the amygdala and adjoining cortex of adult primates. Proc Natl Acad Sci U S A 99:11464-9 Bliss TV, Lomo T. 1973. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol 232:331-56 Cha MC, Lin A, Meckling KA. 2005. Low dose docosahexaenoic acid protects normal colonic epithelial cells from araC toxicity. BMC Pharmacol 5:7 Clark PJ, Brzezinska WJ, Thomas MW, Ryzhenko NA, Toshkov SA, Rhodes JS. 2008. Intact neurogenesis is required for benefits of exercise on spatial memory but not motor performance or contextual fear conditioning in C57BL/6J mice. Neuroscience 155:1048-58 Collingridge GL, Lester RA. 1989. Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system. Pharmacol Rev 41:143-210 Colon-Cesario M, Wang J, Ramos X, Garcia HG, Davila JJ, et al. 2006. An inhibitor of DNA recombination blocks memory consolidation, but not reconsolidation, in context fear conditioning. J Neurosci 26:5524-33 Davis M. 1992. The role of the amygdala in fear-potentiated startle: implications for animal models of anxiety. Trends Pharmacol Sci 13:35-41 Davis M. 2002. Role of NMDA receptors and MAP kinase in the amygdala in extinction of fear: clinical implications for exposure therapy. Eur J Neurosci 16:395-8 Davis M, Rainnie D, Cassell M. 1994. Neurotransmission in the rat amygdala related to fear and anxiety. Trends Neurosci 17:208-14 DeAngelis LM, Kreis W, Chan K, Dantis E, Akerman S. 1992. Pharmacokinetics of ara-C and ara-U in plasma and CSF after high-dose administration of cytosine arabinoside. Cancer Chemother Pharmacol 29:173-7 Doron NN, Ledoux JE. 2000. Cells in the posterior thalamus project to both amygdala and temporal cortex: a quantitative retrograde double-labeling study in the rat. J Comp Neurol 425:257-74 Drapeau E, Mayo W, Aurousseau C, Le Moal M, Piazza PV, Abrous DN. 2003. Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of 54.
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(59) 十一. 十一 附圖/表 附圖 表 (Figures & Tables). 58.
(60) 圖一、 圖一、阿糖胞苷 (Cytosine arabinoside, Cytarabine, Ara-C). Cytarabine 化學名為 4-amino-1-B-D-arabinofuranosyl-2 ( 1H ) – pyrimidinone(Grant 1998)。. 59.
(61) 圖二、 圖二、原始數據與 percent potentiated startle 之換算. 原始數據與 percent potentiated startle 之換算公式為：Percent potentiated startle = ( LN – NA ) / NA。 60.
(62) 圖三、 圖三、不同時間點投予 arara-C 影響神經新生現象， 影響神經新生現象，觀察是否 觀察是否影響動物 是否影響動物 行為之 percent potentiated startle。 。. 此 圖 為 訓 練 後 連 續 三 天 每 天 投 予 藥 物 處 理 之 動 物 percent potentiated startle。於訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ACSF 與訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 在於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 (p = 0.009)。但是在訓 練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ACSF 與訓練後 4 到 6 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 在於 percent potentiated startle 上 不具有統計上的差異 (p = 0.487)；此外訓練後 1 到 3 天每天一次連 續 3 天投予 ara-C 與訓練後 4 到 6 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 相比較於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 ( p = 0.036 )。(*p < 0.05, ** p < 0.01) 61.
(63) 圖四、 圖四、利用離體電生理偵測杏仁核， 利用離體電生理偵測杏仁核，觀察 AraAra-C 是否本身就具有影響 神經之功能。 神經之功能。. 於實驗前 20 分鐘利用 ACSF 灌流並測得 EPSP，20 到 40 分 鐘後開始灌流 ara-C，40 分鐘後利用 ACSF 灌流 40 分鐘，實驗發 現灌流 ara-C 可以抑制 fEPSP ，並且此效果可被 ACSF 灌流還原， 0 到 20 分鐘與 35 到 45 分鐘 fEPSP 相比較有統計上的差異(p= 4.765*10-17)。(***p < 0.001). 62.
(64) 圖五、 圖五、藉由恐懼所促進之驚跳反應行為實驗去觀察是否可以在活體實 驗動物上看到與電生理相同的抑制狀況之 percent potentiated startle。 。. 於 ara-C 投予後 3 小時與 ACSF 投予後 3 小時相比較於 percent potentiated startle 上具有統計上的差異 (p = 0.004)。(**p < 0.05). 63.
(65) 圖六、 圖六、藉由把測試時間拉長， 藉由把測試時間拉長，以期藥物廓清後可在恐懼所促進之驚跳 反應行為實驗觀察到與電生理相同的回復狀況之 percent potentiated startle。 。. 於 ara-C 投予後 6 小時與 ACSF 投予後 6 小時相比較於驚跳 反應上不具有統計上的差異。. 64.
(66) 圖七、 圖七、利用 DNaseI 的人工誘導 DNA 斷裂的處理證實 TUNEL 染色 技術、 技術、手法沒有問題。 手法沒有問題。. 此圖為 positive control，由 TUNEL 圖可以證實確實有染到訊號 且由 Merge 圖證實為神經細胞，證實染色手法以及試劑無誤。 65.
(67) 圖八、 圖八、利用 TUNEL、 TUNEL、NeuN、 NeuN、 DAPI 染色去觀察 染色去觀察 3 小時之神經細胞 小時之神經細胞 DNA 是否有斷裂現象。 是否有斷裂現象。. 此圖為 3 小時的正常處理，由 merged 的圖可以證實沒有神經 細胞損傷。 66.
(68) 圖九、 圖九、利用 TUNEL、 TUNEL、NeuN、 NeuN、 DAPI 染色去觀察 染色去觀察 6 小時之神經細胞 小時之神經細胞 DNA 是否有斷裂現象。 是否有斷裂現象。. 此圖為 6 小時的正常處理，由 merged 的圖可以證實沒有神經 細胞損傷。 67.
(69) 圖十、 圖十、不同時間點投予 arara-C 影響神經新生現象， 影響神經新生現象，觀察是否 觀察是否影響動物 是否影響動物 行為之 NA、 、LN、 、LN-NA。 。. 圖為訓練後於訓練後 3 天每天一次連續 3 天投予藥物。相比較 三組於 NA 上不具有統計上的差異，但是於 shock activity 訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ACSF 與訓練後 1 到 3 天每天一 次連續 3 天投予 ara-C 具有統計上的差異 (p = 0.021)，並且訓練後 1 到 3 天每天一次連續 3 天投予 ara-C 與訓練後 4 到 6 天每天 一次連續 3 天投予 ara-C 相比較具有統計上的差異 (p = 0.008)。(*p < 0.05, ** p < 0.01). 68.
(70) 圖十一、 圖十一、藉由恐懼所促進之驚跳反應行為實驗去觀察是否可以在活體 實驗動物上看到與電生理相同的抑制狀況之 NA、 、LN、 、LN-NA。 。. 圖為 ara-C 投予後 3 小時與 ACSF 投予後 3 小時之原始數據， 相比較於 NA 上不具有統計上的差異，但是於 LN 和 LN-NA 上具 有統計上的差異。(*p < 0.05, ** p < 0.01). 69.
(71) 圖十二、 圖十二、藉由把測試時間拉長， 藉由把測試時間拉長，以期藥物廓清後可在恐懼所促進之驚 跳反應行為實驗觀察到與電生理相同的回復狀況之 NA、LN、LN-NA。 。. 圖為 ara-C 投予後 6 小時與 ACSF 投予後 6 小時的原始數據， 相比較於 NA、LN、shock activity 都不具有統計上的差異。. 70.
(72)
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