3.3.1 菌種純化擴大培養
以接種環取菌種(BCRC12335)，以平行線的方式劃至MA平板培養 基上(四區畫線法)，放置於恆溫培養箱以30 oC培養24小時得到單一菌 落。將單一菌落之醋酸菌以MB在30oC，180 rpm震盪培養24小時後，
取1 mL接種至內含9 mL MB培養基之20 mL試管內培養24小時後鏡檢 確認為短桿狀之型態，接種10 mL菌液至內含100 mL MB培養基之250 mL三角錐瓶(共三瓶)，培養24小時後，300 mL菌液接種至5 L的小型發 酵槽(MDL500-5 L)內裝約2.7 L的MB培養基與0.1%纖維水解酵素，控制 進氣量1 L/min，攪拌速度600 rpm，以恆溫水槽控制30oC培養48小時 後，將菌液以5000 rpm於25oC離心10分鐘，沉澱菌體以含20－25%甘油 之MB培養基，依1/10 (v/v)回溶，分裝2 mL至冷凍管中，於-80 oC冷凍 保存。
3.3.2 球磨樣品製備
3.3.2.1 BC 薄膜製備
以MB培養基活化凍藏之BCRC12335菌株，接種10 mL (2 × 107 CFU/mL)至含100 mL之MB培養基中，靜置14天後取樣。培養14天後之 薄膜參考Wan等(2006)的方法，以0.5 N NaOH溶液煮沸10分鐘，冷卻後 浸漬0.25 N NaOH溶液2天，取出漂水處理2天，將BC之雜質及菌體完
全去除。
3.3.3.2 添加 HPMC 原位培養以改變 BC 結構
MB培養基中添加0.5%、0.75%及1% HPMC進行原位培養，接種醋 酸菌於30oC靜置培養14天後得到複合纖維素，分別簡稱為0.5%HBC、
0.75%HBC及1.0%HBC。
3.3.3 纖維素微細化實驗流程
3.3.3.1 Top down 試驗
BC 以行星式微量雙碗球磨機球磨降解，球磨條件如下：
1.經鹼處理之 BC 薄膜，以高剪力乳化機於 10000 rpm 下均質 30 分鐘。
2.取步驟 1 纖維素 20 g 放入球磨機專用缽，加入 10 mm 二氧化鋯球珠 (100 g)，於 400 rpm 球磨 1 小時。
3.取步驟 2 纖維素 20 g 放入球磨機專用缽，加入 3 mm 二氧化鋯球珠 (100 g)，於 400 rpm 球磨 1 小時。
4.取步驟 3 纖維素 20 g 放入球磨機專用缽，加入 0.3 mm 二氧化鋯球珠 (100 g)，於 600 rpm 球磨 1 小時。
3.3.3.2 Bottom up 試驗
以 MB 培養基活化凍藏之 BCRC12335 菌株，取 1 mL 接種至內含
9 mL MB 培養基之 20 mL 試管內培養 24 小，再以 10% (2 × 107 CFU/mL) 體積菌量置於含200 mL MB 的 500 mL flask，並添加 0.1%、0.15%、
0.25%及 0.5%纖維水解酵素，於 180 rpm 、30oC 進行搖瓶培養。
3.3.4 粒徑分析方法
3.3.4.1 雷射粒徑分析(Masterizer 2000)
纖維素懸浮液粒徑分佈以雷射粒徑分析儀進行量測，開機後先測 定純水時的背景(background)值，以防止純水造成的光散射訊號影響到 實際樣品的量測結果。量測時將纖維素懸浮液樣品緩慢加入燒杯內，
觀察其遮蔽率(obscuration)的變化，樣品濃度需調整達到遮蔽率10－
12%，以確保數據可靠性。為避免樣品中微粒聚集而造成量測誤差，測 量前樣品溶液先以超音波60 W震盪6分鐘後，立即進行量測。
3.3.4.2 動態散射粒徑分析儀(Zetasizer Nano)
為避免大顆粒干擾粒徑分析以確保數據可靠性，纖維素懸浮液以 1200 × g 10分鐘離心後，取3 mL上澄液裝載於石英管中，以Zetasizer Nano粒徑分析儀量測。
3.3.5 菌數變化曲線-平板塗抹法
取發酵培養液1 mL，加9 mL無菌水，連續稀釋，塗抹MB平板置於
30oC培養，計算菌落。
KBr 混合(W/W = 1:100)，再以手動壓片機打錠，將錠狀圓片固定在樣 品槽上以進行測定，以FTIR 掃描 4000－450 cm-1範圍內的吸收光譜，
每樣品掃描32 次以確認其精確性。
3.3.9 還原糖分析
參考Ilyina等(2000)及Sengupta等(2000)方法，利用dinitro-salcylic acid reagent (DNS reagent)作為發酵過程中還原醣分析試劑(作用機制原 理如附圖15)，並以不同葡萄糖濃度作出標準曲線以定量還原醣。取100 μL的發酵液樣品，經離心10分鐘(3300×g)，取其上清液與DNS反應試 劑(v:v=1：2)混合，置於100℃沸水中反應15分鐘，待其冷卻，以ELISA reader測量波長590 nm 吸光值。