4.1 以 Top-down 方法微細化 BC
4.1.1 球磨及酵素對 BC、HBC 降解之影響
BC 薄膜以密閉式高剪力混合器均質後，以 Masterizer 2000 粒徑分 析儀偵測其粒徑範圍在115－1080 μm 之間，體積平均粒徑為 600.65 ± 18.43 μm (圖 4.1)。均質後之 BC 以 10 mm 二氧化鋯珠球磨 1 小時後，
粒徑下降至19.21－682.44 μm 之間，體積平均粒徑 255.60 ± 15.11 μm (圖 4.2a)，再以 3 mm 二氧化鋯珠球磨 1 小時後，纖維持續裂解，粒徑 範圍降低至4.10－115.34 μm，體積平均粒徑 57.60 ± 6.53 μm (圖 4.2b)，
最後以0.3 mm 二氧化鋯珠球磨 1 小時，粒徑下降至 2.87－15.60 μm 之 間，體積平均粒徑8.23 ± 0.17 μm (圖 4.2c)。實驗中亦發現當 BC/二氧 化鋯球徑比過大時，纖維會包覆二氧化鋯球珠，導致二氧化鋯球珠和 鋯碗內壁間的碰狀作用力減弱，不僅粒徑無法降低，纖維還會聚集成 團狀，顯示二氧化鋯球珠的大小和球磨效果有密切的關係。故本實驗 依據BC 粒徑大小而選擇以 10 mm、3 mm 及 0.3 mm 二氧化鋯球珠依 序分別球磨 1 小時，以得到理想的球磨效果。由於上述球磨條件也僅 能將鹼處理過的BC 球磨至 8 μm 左右的粒徑，因此後續實驗將嘗試降 低BC 結晶度或減弱其結構，期能改善球磨效果。
4.1.1.2 球磨對 HBC 降解之粒經分析
在培養 BC 的發酵液中添加不同濃度干擾物質 HPMC，製備改變 結晶度及網狀結構的HBC，發現以添加 0.5%、0.75%及 1% HPMC 製 備的HBC 體積平均粒徑分佈分別是 597.15 ± 15.23、595.54 ± 14.02 和 601.26 ± 15.25 μm，經均質、球磨後體積平均粒徑分別降至 3.59 ± 0.08 μm (圖 4.3a)、1.99 ± 0.38 μm (圖 4.4a) 及 6.67 ± 0.18 μm (圖 4.5)，顯然
以添加0.75% HPMC 製備的 HBC，球磨微細化的效果最好。
由於以 Masterizer 2000 粒徑分析儀偵測到 HBC 球磨後具有小於 1 μm 的降解纖維，因此將樣品經 1200×g 離心 10 分鐘，去除分子較大的
纖維素，進ㄧ步以Zetasizer Nano 粒徑分析儀分析樣品在次微/奈米級 部份的粒徑分佈。發現以0.5% HBC 及 0.75% HBC 製備的 HBC 球磨後 得到的次微/奈米級纖維之體積平均粒徑分別為 150 ± 24.04 nm (圖 4.3b) 及147 ± 9.9 nm，其中 100 nm 以下的纖維前者約佔懸浮微粒的 0.7%、
後者約佔14.0 % (圖 4.4b)。
由於培養 BC 過程中添加的 HPMC，因其分子結構類似 BC，在原 纖維及微纖維上形成物理性吸附作用及三級結構纏繞，在BC 排列結晶 時產生阻礙，因此降低BC 結晶度，不定型區增加，分子間鍵結強度降 低(Haigler et al., 1982；黃，2008)。隨著原位培養時 HPMC 濃度增加，
HBC 的纖維束較寬鬆、纖維直徑變寬、結晶度下降，其中以添加
0.75%HPMC 時最為明顯(黃，2008)。因此，在球磨時所產生的擠壓力、
剪切力或衝擊力，對結晶度較低、結構較為鬆散的 0.75%HBC 有較好 的降解效果。
4.1.1.3 微細影像觀察
從 SEM 影像可以觀察到均質後 BC 的纖維束互相糾結纏繞成網狀 結構(圖 4.6)。均質後的 BC 和 HBC 在經過球磨後皆呈不規則的小片段 (圖 4.7)。圖 4.7a 中觀察到球磨後的 BC 有較嚴重的聚集和堆疊現象，
纖維糾結不易分散，但球磨後HBC 的纖維片段則較細碎且短，且球磨 後HBC 皆可以觀察到粒徑小於 1 μm 的微細化 BC (圖 4.7b, c)。
4.1.1.4 BC 和 HBC 球磨前後結構分析
由FTIR 圖譜分析觀察原位培養 BC (圖 4.8a)和 0.5、0.75% HBC (圖 4.8bc)，發現改變結構的 HBC 的吸收峰仍與 BC 的位置相同，只有在 部分吸收峰的寬度上有些微變化，包括於 3200 cm-1—3600 cm-1 代表 OH 官能基之吸收峰由窄變為寬。由於分子內(intramolecular)及分子間 (intermolecular)氫鍵之吸收波峰分別為 3455—3410 cm-1、3375—3340 cm-1及3310—3230 cm-1，且3590—3650 cm-1是未以氫鍵結合之單離態 OH 基團(Cael et al., 1975; Schwanninger et al., 2004)，因此 HBC 游離態 OH 基團呈現增加，也反映其氫鍵數量相對減少，結構較 BC 鬆散。
BC 球磨後在 3200 cm-1—3600 cm-1之吸收峰由窄變為寬(圖 4.8d)，
原本在1430 cm-1分別代表 CH2官能基的吸收峰則會消失，897 cm-1的 位置則呈現增加(圖 4.9d)。由於 1430 cm-1附近的吸收峰為CH2官能基 所貢獻，代表纖維素的結晶區，897 cm-1 則代表纖維素的非結晶區 (O’Connor et al., 1958)，顯示 BC 經過球磨後顯示非結晶區增加，結晶 度下降。Qiu 等(2003)也發現棉花纖維經球磨在 3200 cm-1—3600 cm-1 之吸收峰會變寬，推論球磨過程中提供的機械力足以將纖維素間氫鍵 破壞，使大量 OH 基暴露出來，而造成吸收峰的改變，使微細化的纖 維結晶區減少。
0.5%HBC (圖 4-8e)及 0.75%HBC (圖 4-8f)球磨後的 FTIR 圖譜，在 3200 cm-1—3600 cm-1 之吸收峰並沒有明顯變寬的現象，1430 cm-1的波 峰減少，897 cm-1 的波峰則無明顯變化(圖 4-9e,f)。推測原位培養添 HPMC，可使 HPMC 與 BC 的微纖維間有明顯糾結現象，而影響分子 內及分子間氫鍵形成，進而影響結晶型態形成之網狀結構。結構較鬆 散的HBC 位於 3200 cm-1—3600 cm-1之吸收峰原本就較寬，球磨後此 吸收峰並沒有呈現更寬的現象，顯示在球磨後游離的 OH 基團並沒有 明顯的增加。反觀代表結晶區的1430 cm-1吸收峰經過球磨後還是會呈 現減少，顯示經球磨後之 HBC 結晶區受到破壞，而結晶度變低。BC 經球磨後，在非結晶區域之 897 cm-1的吸收峰有明顯增加，顯示可將 原本非結晶區較少的纖維因機械力的破壞，形成更細微的片段而增加
非結晶區的比例；相對的，HBC 原本即具有較低的結晶度，非結晶區 較多，因此球磨後代表非結晶區域之 897 cm-1並未觀察到有顯著的變 化。
球磨過程所造成官能基的增加或消失，可歸因於纖維素結晶度和 聚合度下降所造成(Schwanninger et al., 2004)。因此，進一步以 X-ray 繞射分析BC 和 0.75% HBC 球磨後的結晶型態及結晶度。
4.1.1.5 BC 和 HBC 球磨前後之結晶型態與結晶度分析
由X-ray 繞射圖譜中可觀察到原位培養 BC (圖 4.10a)及 0.75% HBC (圖 4.10c)都有二個主要繞射峰，分別是 2θ = 22.7o及 14.62o，分別代表 纖維素結晶平面的位向 200 及 110 所表現的繞射強度(Segal et al., 1959)，由於 BC 與 0.75% HBC 間之繞射角度並無差異，證明添加這些 干擾物質原位培養並不會影響微纖維在形成結晶時，自我排列組成的 結晶型態，而仍保有原來纖維之繞射角度。
利用Segal method (Segal et al., 1959)計算BC及0.75% HBC結晶度 指數(CrI %)，發現BC及0.75% HBC結晶度分別為70.54 ± 7.54%及45.04
± 3.25% (表一)，證明原位培養時添加HPMC干擾BC的形成，確實使 HBC結晶度降低，此乃HPMC在原纖維及微纖維上形成物理性吸附作 用及三級結構纏繞，在BC排列結晶時產生阻礙而降低結晶度(Haigler et al., 1980; Haigler et al., 1982; 黃，2008)。
經過球磨處理後BC (圖 4.10b)及 0.75% HBC (圖 4.10d)的波鋒繞射 強度會減少，結晶度分別下降至 57.07 ± 4.27%及 38.80 ± 2.43% (表 一)。Qiu 等(2003)亦發現球磨會使纖維素的結晶區減少，使纖維素轉成 非結晶的纖維素。值得注意的是由 X-ray 繞射圖譜中可發現 BC 和 0.75% HBC 在球磨後的樣品，皆於 2θ = 34.0o和 37.6o附近產生新的波 峰，顯示球磨後有新的結晶產生。纖維素再結晶溫度範圍為160－260oC (Bhuiyan et al 2001; Yildiz and Gumuskaya, 2007)，本實驗使用的球磨機 因沒有冷卻系統，推論在球磨過程中產生的高溫，配合微細化後的表 面效應，促使BC 碎片相互靠近並利用暴露的 OH 基再度形成氫鍵，產 生再結晶現象，這也可能是球磨機硬體設計之球磨極限外，另一個無 法形成大量奈米級纖維素降解產物的原因。因此，另嘗試以酵素水解 低結晶的HBC，觀察是否能得到較好的降解效果。
4.1.1.6 纖維水解酵素對 BC、HBC 降解之粒徑分析
將BC、0.5%HBC、0.75%HBC薄膜以密閉式高剪力混合器均質後，
添加1% 纖維水解酵素，於180 rpm、30oC震盪一天，以Masterizer 2000 粒徑分析儀偵測，體積平均粒徑分別由600.65 ± 18.43 μm、597.15 ± 15.23 μm及595.54 ± 14.02 μm降至9.50 ± 0.11 μm (圖4.11a)、8.63 ± 0.28 μm (圖4.11b) 及6.57 ± 0.18 μm (圖4.11c)，顯示HBC經纖維水解酵素降 解的效果比BC好。
纖維素水解反應會先發生在非結晶區，然後才是作用在結晶區 (Walseth , 1952)，非結晶區的纖維素水解速率是結晶區的3－30倍(Lynd et al., 2002)。因此本實驗中，球磨降解和纖維水解酵素水解效率都是以
改變結構後的0.75% HBC最高，和其低結晶度應有密切的關係。本實 驗使用的纖維水解酵素包含有內切型及外切型酵素，由於纖維水解酵 素水解之前必須先結合在纖維素的表面(Chang and Tsao, 1981)，低結晶 度HBC分子間鍵結強度降低，可形成更多的不定型區，因此造成纖維
水解酵素可吸附在纖維表面的量增加，也因此提供更多空間給EG
(Endo-β-1,4-glucanase)從非結區任意裂解糖苷鍵，使纖維素還原端或非 還原端大量暴露出來，再由CBH (Exo-β-1,4-glucanas)將纖維素降解成纖 維二糖或纖維寡醣。雖然低結晶度HBC可增加纖維水解效果，但也僅 能降解至6.57 ± 0.18 μm。