實驗流程

用micropipette取 100μl參考物（如：L-methionine）加入微量離心管 中，再加入100μl 目標物（如：D-(＋)-葡萄糖）1×10^-3M 的溶液和 100μl 的1％（V/V）NH₄OH溶液和 700μl的甲醇，以試管震盪器震盪，使其混 合均勻。

※ 其他分析藥品的分析樣品溶液皆以此類似方法來製備。

第三章 結果與討論

動力學法是依據質子化二聚體於碰撞誘導解離後，目標物與參考物碎 片強度比值與參考物GA 値來推導目標物的 GA 値，然而此相對訊號的大 小，會受到碰撞時操作條件的影響，過低的能量可能使得解離效率（cross section）過差，所得訊號比值太小，過高的碰撞能則會造成二次解離，導 致目標物與參考物的相對碎片強度有誤。因此本研究首先針對幾項有可能 干擾碰撞能的參數進行探討，以找出最佳之實驗設定條件。

首先探討的是碰撞室（gas cell）壓力所造成的影響。碰撞室壓力的大 小，代表碰撞室中含有氣體分子數目之多寡。當碰撞室中若含有過多的氣 體分子，會使得質子化二聚體獲得較高的內能，而有可能使得兩個生成離 子進行進一步的碎裂（二次碎裂），太多的碰撞也可能造成生成離子撞擊到 碰撞室內壁而消失，以致對相對強度大小造成誤判。而壓力過小時又可能 不足以產生足夠的訊號，而有較差的訊雜比，導致判斷相對訊號大小時有 較大的誤差。在碰撞室壓力的影響上，本研究採用了5psi和 10psi兩種壓力，

此處的壓力值為質譜儀碰撞室外的供壓，並非指碰撞室內的實際壓力。圖 10 是分析樣品為內含 1×10^-4M 葡萄糖、1×10^-4M isoleucine和 0.1％ NH4OH 的甲醇溶液，collision energy為 5eV，cone為 15V，而碰撞室壓力分別為 5psi 和10psi的質譜圖。結果顯示，外壓為 5psi時，片訊號強度雖較弱，但相較 於外壓為10psi時產生許多的二次碰撞離子m/z 161 和m/z 119 離子可能造成 於估算分析物與參考物訊號相對強度大小時有誤差，因此，決定以5psi外 壓做為研究時所用外壓。

圖 10 內含 1×10^-4M 葡萄糖、1×10^-4M isoleucine和 0.1％NH₄OH的甲醇溶液，碰撞能為 5eV，誘導電壓為 15V，而 碰撞室壓力為5psi和 10psi。

碰撞室壓力為10psi 碰撞室壓力為 5psi

除了碰撞室壓力外，不同碰撞能更是直接影響到質子化二聚體解離時 內能的大小；因此我們也觀察了不同碰撞能（1～9eV）對解離離子訊號的 影響，圖11 和圖 12 是分析樣品為內含 1×10^-3M 葡萄糖、1×10^-3M isoleucine 和0.1％ NH₄OH的甲醇溶液，同樣在 15V的誘導電壓下，於 1eV、3eV、

5eV、7eV、9eV碰撞能（collision energy）下解離之質譜圖。當碰撞能過小 時，不足以產生足夠的內能造成質子化二聚體的解離，當碰撞能過大時，

又可能使得待分析物與參考物產生二次碎裂，造成對訊號強度的誤判。由 圖11 及圖 12 可發現碰撞能為 1eV及 3eV時，碎片訊號強度極若不利測量，

而當碰撞能為7eV及 9eV時則有明顯的二次碎裂訊號（m/z 161 及m/z 119）

生成，因此較佳的碰撞能應介於 3～7eV間，因此接著試用 4eV及 5eV的碰 撞能（圖13）。在 4eV下的碰撞產生二次碎裂離子的強度較 5eV低，因此 4eV的碰撞能被選定為本研究中所用的碰撞能量。

為了吸引電噴灑游離所產生的離子進入質譜儀，質譜儀於入口處會施 予一個吸引電壓，此電壓於Q-TOF 質譜儀的設定參數名稱為誘導電壓（cone voltage）。由於解離的化合物於進入質譜儀前會與空氣進行多次的碰撞，因 此電壓的大小影響著離子進入質譜儀時內能的大小。因此本研究也針對誘 導電壓對解離訊號相對大小的關係做了探討。

以內含1×10^-3M 葡萄糖、1×10^-3M phenylalanine和 0.1％NH₄OH的甲醇 溶液，或含1×10^-3M 葡萄糖、1×10^-3M methionine和 0.1％NH₄OH的甲醇溶 液進行電噴灑游離，於固定 3eV碰撞能下，記錄使用 15V、20V、25V、30V 和35V等不同誘導電壓下的誘導碰撞解離圖。

collision energy 1eV

collision energy 3eV

collision energy 5eV

collision energy 7eV

collision energy 9eV

圖11 內含 1×10^-3M 葡萄糖、1×10^-3M isoleucine和 0.1％NH4OH的甲醇溶液，碰撞能分別為 1eV、3eV、5eV、7eV、

9eV之質譜圖。

collision energy 1eV

collision energy 3eV

collision energy 5eV

collision energy 7eV

圖12 內含 1×10^-4M 葡萄糖、1×10^-4M isoleucine和 0.1％NH4OH的甲醇溶液，碰撞能分別為 1eV、3eV、5eV及 7eV 之質譜圖。

圖13 內含 1×10^-4M 葡萄糖、1×10^-4M isoleucine和 0.1％NH4OH的甲醇溶液，碰撞能分別為 3eV、4eV及 5eV之質 譜圖。

collision energy 3eV

collision energy 4eV

collision energy 5eV

經五次實驗後，以解離後為[Phenylalanine^－]/[ Glucose^－]與

[Methionine^－]/[ Glucose^－]的相對訊號強度平均值和誘導電壓作圖（圖 14 與 圖15），可發現不同的誘導電壓確實會對相對訊號大小造成影響，而當誘 導電壓為15V時相對訊號強度比值較大，而當誘導電壓為 25V時訊號強度 比值較小。為避免較高的誘導電壓形成較高的分子內能，導致二次解離，

因此我們選定以15V為最佳操作誘導電壓條件。

圖14 [Phenylalanine^－]/[ Glucose^－]的 5 次訊號強度比值及平均值對誘導電 壓值各設定為15V、20V、25V、30V、35V作圖。

選定碰撞室氣體壓力、質譜儀入口電壓和碰撞能等條件後，為了測試 選定條件是否可應用於當質子化二聚體中組成的[ A^－]和[ B^－]離子相近時，

是否能區分其不同，乃以Valine（Val）作分析物，而以Leucine（Leu）和 Isoleucine（Ile）為參考物，分別對[Leu^－…H⁺…Val^－]和[Ile^－…H⁺…Val^－]進 行碰撞誘導碎裂，已知GA（Ile）＝1389±13 kJ/mol；GA（Leu）＝1390±13 kJ/mol；GA（Val）＝1391±13 kJ/mol。圖 16 顯示即使Leu和Ile的GA只有 1 kJ/mol差異，與Val所形成的質子化二聚體碎裂圖中的訊號強度相對比値已 有顯著不同，於相同條件下I[Val]/I[Ile]＝0.55，而I[Val]/I[Leu]＝0.67，結果 顯示若是計畫中所要探討的兩個醣類之間GA只差 1 kJ/mol，應也可以以動 力學法加以辨別量測。

圖15 [Methionine^－]/[ Glucose^－]的 5 次訊號強度比值及平均值對誘導電壓 值各設定為15V、20V、25V、30V、35V作圖。

[Valine

]

[Valine

]

圖16 [Leucine^－…H^＋…Valine^－]與[Isoleucine^－…H^＋…Valine^－]，碰撞能為 4eV之CID質譜圖。

[Isoleucine

]

[Leucine

] [Valine

]

[Valine

]

3.1 C-2 和 C-4 上的-OH 基位向對單醣 GA 値之影響

D-(+)-葡萄糖與D-(+)-半乳糖在結構上的差異，在於前者C-4 上的-OH 基位於水平向，而後者是在軸向以L-methionine、L-phenylalanine、L-lysine、

L-isoleucine、L-leucine和L-valine為參考物，分別與葡萄糖和半乳糖形成質 子化二聚體。經由動力學法操作顯示GA（D-(+)-Glucose）＝1379±13kJ/mol；

GA（D-(+)-Galactose）＝1378±13kJ/mol（圖 17），兩者僅差 1 kJ/mol。GA

（D-(+)-Glucose）比理論預測值ΔacidG°298(α-D-glucose)＝1398 kJ/mol和 ΔacidG°298(β-D-glucose)＝1408 kJ/mol少了 20～30 kJ/mol。實驗時所用的 D-(+)-葡萄糖為具有α-和β- form的混合物，依據文獻於水溶液中達到平衡時 這兩種型態異構物的比例應為36：64，因此實驗值應介於 1398～1408 kJ/mol，然而，實驗數值卻較預測值低，原因可能為Salpin等人低估了去質 子化（deprotonation）葡萄糖的穩定度，理論計算時依據的是C-1 上的O^－離 子會與C-2 上的-OH基形成分子內氫鍵而穩定，但有可能C-1 上的O^－官能基 不只會與C-2 上的-OH基形成作用力，也可能與其他位置的-OH基作用而更 穩定。

D-(+)-葡萄糖與D(+)-甘露糖的差異則在C-2 上的-OH基的位向，前者的 位向是軸向，後者為水平向。如同改變C-4 上的-OH基的位向對GA值的影 響，C-2 上的-OH基位向的改變對GA値也是只有些微（1 kJ/mol）的影響。

這項結果暗示著C-4 上的-OH基似乎對於去質子化後的葡萄糖穩定性沒有

顯著的影響，也就是說C-1 上的O^－離子與C-4 上的-OH基並無明顯的作用力 存在。

圖17 分析物D-(＋)-葡萄糖、D-(＋)-半乳糖和D-(＋)-甘露糖之ln(reference^－/analysis^－) 對 ΔG (kJ / mol)作圖。【ΔG

1374.0 1376.0 1378.0 1380.0 1382.0 1384.0 1386.0 1388.0 1390.0 1392.0

ΔG (kJ/mol)

ln(reference / analysis)

Aa--D-(+)-Glucose Ca--D-(+)-Galactose Ea--D-(+)-Mannose

線 性 (Aa--D-(+)-Glucose) 線 性 (Ca--D-(+)-Galactose) 線 性 (Ea--D-(+)-Mannose)

3.2 C-2 和 C-6 去氧基化對單醣 GA 之影響

依據理論計算所得葡萄糖中最具酸性的H乃是位在C-1 上，由結構上來 看，去質子化後的葡萄糖其C-1 上的O^－離子應會與C-2 上的-OH基形成分子 內氫鍵，因此若將藉由以H取代C-2 上原有的-OH基去氧基化，應可以看出 此分子內氫鍵對葡萄糖GA値的影響。由於 2-deoxy-D-mannose無法購得，

故所探討的目標物只有2-deoxy-D-glucose和 2-deoxy-D-galactose。

不同於葡萄糖和半乳糖，2-deoxy醣類化合物與參考物所形成的質子化 二聚體於相同條件下進行碰撞誘導解離時，極易失去H₂O產生二次解離離 子（圖18），觀察 2-deoxy-D-glucose和 2-deoxy-D-galactose碰撞誘導解離質 譜圖可發現[M-H-H₂O]^－/[M-H]^－ 分別為 17.6％和 13.7％，而於相同的實驗 下D-葡萄糖和D-半乳糖只生成 1.3％和 1.2％。由於[M-H-H₂O]^－是由[M-H]^－ 裂解生成，因此在計算質子化二聚體解離成2-deoxy 離子和參考物離子強 度相對比值時，所用的2-deoxy離子強度是採用將質譜圖中[M-H-H₂O]^－和 [M-H]^－訊號強度的總和。

量測 2-deoxy化合物所用的參考物為L-Alanine、L-Glycine及Isobutytric acid，GA（Ala）＝1396±8.4 kJ/mol，GA（Gly）＝1400±8.4 kJ/mol，GA

（Isobutytric acid）＝1418±8.4 kJ/mol。由於可用的參考物有限，目前只能 找到三個化合物符合所需條件。依據圖19 的趨勢線所推導出的GA

（2-deoxy-D-glucose）＝1395±8.4 kJ/mol，GA（2-deoxy-D-galactose）＝

1389±8.4 kJ/mol，結果顯示將C-2 上的-OH基去氧基化會導致葡萄糖的GA 値增加了16 kJ/mol，而半乳糖則只增加了 11 kJ/mol。葡萄糖所受的影響大 於半乳糖5 kJ/mol，然而葡萄糖和半乳糖之間只差 1 kJ/mol，是以 5 kJ/mol 的差異代表著C-2 上的-OH基應不只受到C-1 上-OH基的作用，受到其他部

位較微弱的第二種作用力的影響。改以將C-6 上的-OH基以H取代，則GA 値增加了17～18 kJ/mol，GA（6-deoxy-D-glucose）＝1395±13 kJ/mol，GA

（6-deoxy-D-galactose）＝1397±13 kJ/mol（圖 20）。去質子化葡萄糖內的 分子內氫鍵存在於C-1 上的O^－離子與C-2 上的-OH基之間，但有趣的是 6-deoxy的實驗結果顯示C-6 上的-OH基可能也與C-1 上的-OH基有作用力存 在。

針對 2-deoxy-D-glucose，Salpin 等人的預測值為 1436.5 kJ/mol，不但 比量測值多了41 kJ/mol 左右，此外 deoxy 化合物與葡萄糖之間 GA 差異值，

實驗所得16 kJ/mol 也遠小於預測值的 38.2 kJ/mol（α-form）和 28.4 kJ/mol

（β-form），至於6-deoxy 則無理論計算值可供比對。推斷理論計算時低估 了去質子化化合物的穩定度，忽略了第二種分子內氫鍵存在的可能。

B：2-deoxy-D-glucose

D：2-deoxy-D-galactose

A：D-glucose

圖18 內含 1×10^-4M 分別為 2-deoxy-D-glucose、2-deoxy-D-galactose和D-glucose和 0.1％NH4OH的甲醇溶液之CID 質譜圖。

B+18 : y = -0.103x + 143.69 R² = 0.9552

D+18 : y = -0.1069x + 148.49 R² = 0.9546

-3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5

1390.0 1395.0 1400.0 1405.0 1410.0 1415.0 1420.0

ΔG(kJ/mol)

ln(reference/analysis)

Ba+18--2-Deoxy-D-Glucose Da+18--2-Deoxy-D-Galactose

線 性 (Ba+18--2-Deoxy-D-Glucose) 線 性 (Da+18--2-Deoxy-D-Galactose) L-Glycine

iPrCOOH L-Alanine

圖19 分析物 2-deoxy-D-glucose和 2-deoxy-D-galactose之ln(reference^－/analysis^－)對ΔG (kJ / mol)作圖。【ΔG (kJ / mol) 值取自NIST網站³³】

圖20 分析物 6-deoxy-D-galactose和 6-deoxy-D-glucose之ln(reference^－/analysis^－) 對ΔG (kJ / mol)作圖。【ΔG (kJ / mol) 值取自NIST網站³³】

J : y = -0.37x + 516.3 R² = 0.9388

K : y = -0.3546x + 495.5 R² = 0.9241

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1388.0 1390.0 1392.0 1394.0 1396.0 1398.0 1400.0 1402.0

ΔG (kJ/mol)

ln(reference / analysis)

Ja--6-Deoxy-D-Galactose Ka--6-Deoxy-D-Glucose

線 性 (Ja--6-Deoxy-D-Galactose) 線 性 (Ka--6-Deoxy-D-Glucose) L-Alanine

L-Glycine L-Leucine

L-Valine L-Proline

3.3 甲氧基化對單醣 GA 値之影響

除了將 C-2 和 C-6 上的-OH 基以 H 取代，探討了分子內氫鍵對 GA 値 的影響，將 C-1 上的-OH 基改以甲氧基化應也會破壞 C-1 和 C-2 之間的分 子內氫鍵，針對此項研究所選用的目標物為methyl α-D-glucopyranoside、

methyl β-D-glucopyranoside 及 methyl β-D-galactopyranoside，而參考物為 isobutytric acid、propionic acid 及 acetic acid，由圖 21 之趨勢線計算所得 GA（methyl α-D-glucopyranoside）＝1429±8.4 kJ/mol；GA（methyl β-D-glucopyranoside）＝1424±8.4 kJ/mol；GA（methyl

β-D-galactopyranoside）＝1420±8.4 kJ/mol，如預期般地將 C-1 甲氧基化破 壞氫鍵造成GA 値的增加，而增加的幅度遠大於將 C-2 上的-OH 基以 H 取 代的效果，推測原因為glucose 上 C-1 的 H 同時受 C-2 和 C-6 上的-OH 基 作用形成氫鍵，如同前述2-deoxy 和 6-deoxy 實驗結果，移去其中一個-OH

β-D-galactopyranoside）＝1420±8.4 kJ/mol，如預期般地將 C-1 甲氧基化破 壞氫鍵造成GA 値的增加，而增加的幅度遠大於將 C-2 上的-OH 基以 H 取 代的效果，推測原因為glucose 上 C-1 的 H 同時受 C-2 和 C-6 上的-OH 基 作用形成氫鍵，如同前述2-deoxy 和 6-deoxy 實驗結果，移去其中一個-OH