第三章 ： 材料與方法
3.2 儀器
3.2.1 ELISA-reader MICROPLATE AUTOREADER EL311, BIO-TEK INSTRUMENTS.，測定使用波長 595 nm。
3.2.2 Low Temperature Incubator, LE-509, YIH DER.
3.2.3 光源（由台灣大學醫學院光電研究所陳進庭教授提供），如圖 3 所示。
3.2.3.1 Red light with a wavelengh of 630±5 nm was chosen and the output power was set at 30 mW／cm2.
3.2.3.1.1 光劑量（light dose）的計算：
light dose（（（J／（ ／／／cm2）） ））
= output power（（（mW／（ ／／cm／ 2））））× illumination time（（（sec）（ ）））／／／／1,000
3.3 實驗流程與操作方法 實驗流程與操作方法 實驗流程與操作方法 實驗流程與操作方法
3.3.1 細菌檢量線實驗細菌檢量線實驗細菌檢量線實驗細菌檢量線實驗20：：：：
3.3.1.1 在細菌活化後測定在對數期的細菌濃度與吸光度的相對關係 曲線。
3.3.1.2 取各種濃度的細菌菌液在光度計（ELISA-reader, λ=595 nm）
下測定其吸光度。
3.3.1.3 將各濃度的菌液用 PBS 溶液為溶劑進行 10-1倍的序列稀釋
（serial dilution），取適當濁度的稀釋菌液 100 μl 塗佈於固 態瓊脂培養基上，在培養箱中 370C 下培養 16-18 小時後記算 菌落數，推算原菌液濃度，在與對應的吸光值作圖求取該細 菌檢量線。
3.3.2 光動力實光動力實光動力實光動力實驗驗驗驗：：：：
3.3.2.1 將種於 NB 液態培養基的菌液依實驗所需將 ALA 及 CP 添加 至菌液中，混勻(均避光)，儲放 60 分鐘
3.3.2.2 取 0.0, 1.0, 2.5, 10.0 mM ALA-細菌混合液 200 μl 置入 well 中照光（波長：630±5 nm、輸出功：30 mW／cm2），光照時 間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0 等小時。
3.3.2.3 在實驗操作時每 15-30 分鐘使用 ELISA-Reader 測定各實驗組 之 OD。
3.3.2.4 在光照完成後取 100 μl 菌液，以 PBS 溶液為溶劑，採 10-1 倍的序列稀釋方式稀釋，取稀釋後的菌液 100μl 塗布至瓊膠 固態培養基上，之後將此瓊膠培養基置培養箱中 370C 避光培 養，14-18 小時後記數瓊膠培養基上菌落數。
3.3.3 結合抗生素之光動力抗菌實驗結合抗生素之光動力抗菌實驗結合抗生素之光動力抗菌實驗結合抗生素之光動力抗菌實驗：：：：
3.3.3.1 菌株為對抗生素 oxacillin 具有 intermediate susceptibility 之 Staphylococci，其抑制圈直徑為11-12 mm。
3.3.3.2 將菌液均勻塗布至瓊膠培養基上
3.3.3.3 之後將含有抗生素（Oxacillin）的 disc 貼附
3.3.3.4 滴加 10μl 各含有 2.5, 5.0 mM ALA, 0.0％, 0.001％, 0.01％
CP 與 NB 之混合液至 disc 上，370C 下避光靜置 1 小時。
3.3.3.5 將 disc 照光（波長：630±5 nm、輸出功：30mW／cm2）1.5 小時（162 J／cm2）
3.3.3.6 照光後將 disc 置培養箱中 370C 避光培養，14-18 小時後觀察 瓊膠培養基上的抑菌圈大小
3.4 實驗目的 實驗目的 實驗目的 實驗目的
3.4.1 探索 ALA-induced photodynamic antimicrobial effect on gram positive and negative bacteria.
3.4.2 瞭解賦形劑 CP 是否對 ALA-induced photodynamic antimicrobial effect 有所助益。
3.4.3 探討 ALA-induced photodynamic effect 是否能助益抗生素 oxacillin 的抗菌效果。
3.4.4 評估利用微生物在吸光度的變化作為快速檢測抗菌效果檢測 法。
第四章 第四章 第四章
第四章： ： ： ：實驗結果與討論 實驗結果與討論 實驗結果與討論 實驗結果與討論
4.1
實驗一 實驗一： 實驗一 實驗一 ： ： ：
ELISA-reader 測定的吸光值測定的吸光值測定的吸光值測定的吸光值（（（OD）（ ）））所對應細菌所對應細菌所對應細菌所對應細菌（（（S. （ aurus））濃度））濃度濃度（濃度（（（108 cfu／／／／ml）））的檢量線）的檢量線的檢量線 的檢量線4.1.1 如圖 4.1 所示，培養於 NB 的金黃色葡萄球菌濃度與
ELISA-reader 測得的吸光值具有相對正比增加的關係，可應用 此檢量線求得約略的菌液濃度。
4.2
實驗二 實驗二： 實驗二 實驗二 ： ： ：
金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌之之之之 ALA 誘發光動力抗菌效應誘發光動力抗菌效應誘發光動力抗菌效應 誘發光動力抗菌效應4.2.1 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進 行紅光光照 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 小時之實驗結果與討論，如圖 4.2.1、
4.2.2、4.2.3、4.2.4 所示。
4.2.2 細菌細菌細菌細菌未添加未添加未添加 ALA 且未照光之對照組未添加 且未照光之對照組且未照光之對照組且未照光之對照組：：：：
4.2.2.1 當細菌未添加 ALA 且未照光之對照組，其吸光值（OD of ELISA-reader）的變化均呈逐漸上升的趨勢，此現象顯示金 黃色葡萄球菌呈現正常繁殖生長的情形。而細菌未添加 ALA 但有照光者，OD 的變化均也呈現逐漸上升的趨勢，甚至與 未加 ALA 未照光者接近，此現象顯示紅光光照對金黃色葡萄 球菌繁殖生長的情形無影響。
4.2.3 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且光照添加 且光照且光照且光照 2 小時小時小時小時（（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：216 J／／／／cm2））））者者者者：
4.2.3.1 金黃色葡萄球菌添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之各實驗 組，自照光開始，各組的吸光值均呈逐漸下降的趨勢（其中 以添加 1.0 mM ALA 者下降趨勢似乎較為平緩），其結果顯示 金黃色葡萄球菌在添加 ALA ㄧ小時後照光 2 小時的操作時，
可能有抑制金黃色葡萄球菌的繁殖生長情形，甚至可能有抗 菌效果。
4.2.4 細菌細菌細菌細菌添加添加添加添加 ALA 且光照且光照且光照且光照 1.5 小時小時小時（小時（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：162 J／／／／cm2））者））者者：者：：： 4.2.4.1 金黃色葡萄球菌在添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時
後，在紅光照射 1.5 小時期間均呈吸光度下降的趨勢，雖其 下降趨勢較光照 2.0 小時者平緩，其結果顯示金黃色葡萄球 菌在添加 ALA ㄧ小時後照光 1.5 小時的操作上，可能有光動 力抗菌效果。
4.2.4.2 在光照停止後各 ALA-treated 者之吸光值及不再下降，呈現 平緩的情形，其可能表示著細菌生長繁殖呈現抑制情形。
4.2.4.3 其細菌存活情形，如圖 4.4.5。當 ALA 為 1.0 mM 時細菌下降 了 6 個對數值，2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 者之細菌下降了近 8 個對數值，其結果顯示 ALA 誘發的光動力抗菌效應：
10.0 mM ALA treated＞5.0 mM＞2.5 mM＞1.0 mM
4.2.5 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且光照添加 且光照且光照且光照 1.0、、、、 0.5 小時小時小時（小時（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：108, 54 J／／／／cm2）））） 者者
者者：：： ：
4.2.5.1 在光照停止之前各實驗組之吸光值變化情形均與前光照 2.0 或 1.5 小時者相似，但在光照停止後各 ALA-treated 組均呈現 吸光值上升情形，其吸光值上升趨勢似乎與 ALA 濃度成反向 關係，即 ALA 濃度越高者吸光值增加趨勢越平緩，上升趨勢 強度為：1.0＞2.5＞5.0≧10.0 mM ALA 者，又以光照 0.5 小 時者最明顯，此現象可能表示 0.5 小時的光照時間在本實驗 條件下無法產生足夠光動力抗菌效應。
4.3
實驗三 實驗三： 實驗三 實驗三 ： ： ：
綠膿桿菌濃度對應綠膿桿菌濃度對應綠膿桿菌濃度對應綠膿桿菌濃度對應 ELISA-reader 的檢量線實驗的檢量線實驗的檢量線實驗的檢量線實驗 4.3.1 如圖 4.3，培養於 NB 的綠膿桿菌濃度與 ELISA-reader 測得的吸光值具有相對正比的關係，可應用此檢量線求得約略的菌液濃 度。
4.4
實驗四 實驗四： 實驗四 實驗四 ： ： ：
綠膿桿菌的綠膿桿菌的綠膿桿菌的綠膿桿菌的 ALA 誘發光動力抗菌效應誘發光動力抗菌效應誘發光動力抗菌效應誘發光動力抗菌效應4.4.1 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行紅光 光照 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 小時之實驗結果與討論，如圖 4.4.1、4.4.2、
4.4.3、4.4.4 所示。
4.4.2 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且添加 且且且光照時間光照時間光照時間光照時間 2 小時小時小時小時（（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：216 J／／／cm／ 2））））者者者：者：：： 4.4.2.1 在未照光前 1 小時中，各實驗組（除細菌添加 10.0 mM ALA
組之外）及對照組其吸光值的變化均呈逐漸上升的趨勢，此 現象顯示綠膿桿菌呈現正常繁殖生長的情形，然濃度過高的 ALA 可能會影響綠膿桿菌的正常繁殖生長
4.4.2.2 綠膿桿菌中添加 2.5, 1.0 mM ALA 的各實驗組的吸光值變化 趨勢也ㄧ致，其結果顯示綠膿桿菌在添加 2.5, 1.0 mM 等濃度 的 ALA 之處理對綠膿桿菌並無抑制其繁殖生長的影響，呈現 與未添加 ALA 之對照組相類似的繁殖生長速率。
4.4.2.3 添加 10.0, 5.0 mM ALA 的綠膿桿菌未照光時其生長繁殖未如
其他各實驗組快速的原因，可能是受 ALA 的低酸鹼度及受 ALA 誘發的光動力效應所影響。
4.4.2.4 未添加 ALA 的綠膿桿菌之照光組與未照光組在光照期間中，
二組之各時間點的吸光度相近及增加速率相似，其表示細菌 繁殖生長在 2 小時的光照下並無影響。
4.4.2.5 綠膿桿菌添加 10, 5.0, 2.5 及 1.0 mM ALA 之各實驗組，自照 光開始，各組的吸光值均呈逐漸下降的趨勢，尤其是添加 10 mM ALA 處理的實驗組，其吸光值下降情形與其他各組比較 下最為明顯，且也是最低。其結果顯示綠膿桿菌在添加 10.0, 5.0, 2.5, 1.0 mM 等濃度的 ALA ㄧ小時後照光 2 小時的操作有 抑制綠膿桿菌的繁殖生長情形，甚至可能有抗菌效果。
4.4.3 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且添加 且且且光照時間光照時間光照時間光照時間 1.5 小時小時小時（小時（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：162 J／／／／cm2））者））者者：者：：： 4.4.3.1 綠膿桿菌在添加 ALA ㄧ小時後，在紅光照射 1.5 小時期間均
呈吸光度下降的趨勢，其結果顯示綠膿桿菌在添加 ALA ㄧ小 時後照光 1.5 小時的操作有抑制綠膿桿菌的繁殖生長情形及 可能有抗菌效果。
4.4.3.2 在紅光照射結束後，添加 2.5, 1.0 mM ALA 之實驗組的吸光度 有逐漸增加的情形，顯示 ALA 在此二濃度的光動力抗菌效應 不佳，而含 5.0, 10.0 mM ALA 之實驗組的吸光度呈平緩情
形，顯示 ALA 在此二濃度的光動力抗菌效應較前二濃度好。
4.4.3.3 其細菌存活情形，如圖 4.4.5 所示：當 ALA 為 1.0 mM 時細菌 下降了近 4 個對數值，2.5 mM 時細菌下降了近 5.3 個對數值，
5.0 mM 時細菌下降了近 6.5 個對數值，10.0 mM 時細菌下降 了 8 個對數值。
4.4.3.4 結果顯示 ALA 誘發的光動力抗菌效應：
10.0 mM ALA treated＞5.0 mM ALA＞2.5 mM ALA＞1.0 mM ALA
4.4.4 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且添加 且且且光照時間光照時間光照時間光照時間 1.0 小時小時小時（小時（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：：108 J／／／／cm2））者））者者：者：：： 4.4.4.1 在光照時間 1.0 小時的添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之
各實驗組，結果顯示在 10.0 及 5.0 mM ALA 處理下，各實驗 組菌株較有明顯 ALA 誘發光動力抗菌效應，但在光照後細菌 仍有逐漸快速生長的趨勢。而在 2.5 及 1.0 mM ALA 處理下，
各實驗組菌株無明顯 ALA 誘發光動力抗菌效應。
4.4.5 細菌細菌細菌細菌添加添加添加 ALA 且添加 且且且光照時間光照時間光照時間光照時間 0.5 小時小時小時小時（（（（光劑量光劑量光劑量光劑量：：：54 J／： ／／／cm2））））者者者：者：： ： 4.4.6 在光照時間 0.5 小時的添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之各實驗
組，結果顯示各實驗組雖在光照期間吸光值均有下降或平緩的 情形，但在光照之後各實驗組吸光值均呈明顯上升的現象，顯 示 0.5 小時的 ALA 誘發光動力效應並不顯著，可能是光照時間
組，結果顯示各實驗組雖在光照期間吸光值均有下降或平緩的 情形，但在光照之後各實驗組吸光值均呈明顯上升的現象，顯 示 0.5 小時的 ALA 誘發光動力效應並不顯著，可能是光照時間