Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4306
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(2) Abstract. In the present study we examined the effects of the photodynamic antimicrobial action by various amounts of δ-aminolevulinic acid（ALA） on the microorganisms Staphylococcus aureus （ S. aureus ）. and. Pseudomonas aeruginosa（P. aeruginosa）. This was performed by solely inducing the porphyrin biosynthesis pathway.. All strains exponentially. growing were incubated in nutrient broth with ALA at 370C in the dark for 1 hr and then irradiated with 630±5 nm red light. Incubation of ALA with these microorganisms did not slow down their growth.. When. ALA-induced photodynamic treatment（ALA-PDT） in light dose 162 J/cm2 was performed onto bacterial strains S. aureus and P. aeruginosa, decrease of bacterial viabilities in the orders of magnitudes 6.0 and 4.1, respectively was found with 1.0 mM ALA, and the total eradication could be achieved when ALA concentrations equal or higher than 2.5 mM was used.. Furthermore, when ALA-PDT was combined with a model. antibiotic and/or a macromolecular excipient (carbopol 971P；CP), the results of antimicrobes became even more promising. We observed that S. aureus been intermediately susceptible to oxacillin became sensitive to oxacillin when in combination with ALA-PDT, even became sensitive to CP only.. Our results showed that the PDT effect was worth further. investigation as a standard anti-infection treatment modality, and further combination of ALA-PDT with other antibiotics or excipients may result in even better anti-microbial effect. i.
(3) Keywors：δ-Aminolevulinic acid；ALA, Porphyrins, Photodynamic therapy；PDT, Antimicrobial effect, Carbopol. ii.
(4) 摘. 要. 由於細菌對抗生素產生抗藥性，使醫學面臨著越來越沒有適當有 效的抗生素來對抗治療微生物感染性疾病的窘困，找出新的抗微生物 感染療法實為醫學界的當務之急。五-胺基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid）為多數生物細胞可自行生成的物質，可在細胞內轉化成在適當 波長的可見光照射下呈現光動力效應的吡喀紫質（Porphyrins） ，鑑於 五-胺基酮戊酸在抗腫瘤上之光動力治療（Photodynamic therapy）的成 效，本研究藉由科學文獻的分析及實際的實驗操作下，探討五-胺基酮 戊酸所誘發的光動力抗菌效益。 本研究利用革蘭氏陽性菌之金黃色葡萄球菌(S. aureus)、與革蘭氏 陰性菌之綠膿桿菌(P. aeruginosa)等菌，在添加五-胺基酮戊酸、賦形 劑（Carbopol 971P；CP）後於 370C 培養 1 小時，再以波長 630±5 nm 的紅光照射，使用 ELISA-reader 及 plate counting 等實驗操作來觀察細 菌生長情形，以驗證五-胺基酮戊酸之光動力抗菌效益。 實驗結果發現金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌等菌在添加五-胺基酮 戊酸在紅光照射下呈現生長抑制的情形，而且更在合併使用賦形劑 （CP）時，細菌存活率呈現更明顯的下降情形。由此可證五-胺基酮 戊酸所誘發的光動力效應確實具有抗菌效果，而賦形劑（CP）對五-. iii.
(5) 胺基酮戊酸所誘發的光動力抗菌效應確實有所幫助。又對抗生素 oxacillin 具有半敏感性（intermediate）的金黃色葡萄球菌在添加五-胺 基酮戊酸且在紅光照射下的抗生素感受性的試驗中（antibiotic susceptibility Testing）呈現敏感性（sensitive）的結果。. 關鍵字：五-胺基酮戊酸，吡喀紫質，光動力治療，光動力抗菌效益. iv.
(6) 謝. 誌. 兩年的研究生生活真的是苦樂交掺，但終究是受益良多。要先感 謝指導教授蔡翠敏及李玟玲等老師對我的教導及寬容。蔡老師總是很 有耐心教我，不論課業上或生活上，都會適時給我意見，爲我著想。 而且要感謝臺大光電生物醫學研究中心陳進庭教授的指導及殷殷教 誨。 本論文承蒙口試委員的指導，李玟玲老師、鄧麗貞老師及蔡翠敏 老師，感謝您們給予的許多建議及指正錯誤，謝謝您們。謝謝蘇慶華 所長及其他所上老師們的照顧及提攜。 謝謝同學盈君、純佩、育才、維靈…，由於你們的照顧，讓我覺 得溫馨快樂。最後，要謝謝家人尤其是我太太盧麗如的幫助，不論是 工作上或課業上。在此，我要向所有關心我的人，曾經幫過我的人致 上感謝，謝謝你們！ 兩年多來，這些在實驗室的日子，一邊工作，一邊念書，回家反 而成為一種奢侈，除了身體的勞累，還包括心靈的疲倦，很多時候曾 想放棄，不過一切的辛苦，都將成為永恆美好的回憶。此番行程收穫 良多，受益匪淺，除知識的斬獲外，還增加生活上的智慧及規劃事務 的能力。 在此，我要將這份論文獻給我在天上的媽媽蕭惠美及重病的父親 v.
(7) 黃鴻雄，要感謝您們的事情太多，但沒有您們的教養就無今日的我， 謝謝爸爸媽媽。. vi.
(8) 目 英文摘要 中文摘要 謝 誌 目 錄 圖目錄 表目錄 第一章： 第二章： 2.1 2.2 2.3 2.4 第三章： 3.1 3.2 3.3 3.4 第四章： 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 第四章： 第五章： 第六章：. 錄. ............................................................................................. ............................................................................................. ............................................................................................. ……………………………………………………………. ............................................................................................. ............................................................................................. 緒論..................................................................................... 文獻探討............................................................................. 五-胺基酮戊酸光動力抗菌效益....................................... 五-胺基酮戊酸................................................................... 微生物防治......................................................................... 光動力效應......................................................................... 材料與方法......................................................................... 材料..................................................................................... 儀器..................................................................................... 方法..................................................................................... 實驗目的............................................................................. 實驗結果與討論................................................................. 實驗一： 葡萄球菌濃度對應 ELISA-reader 的檢量線實驗........... 實驗二： 葡萄球菌的 ALA 誘發光動力抗菌效應............................. 實驗三： 綠膿桿菌濃度對應 ELISA-reader 的檢量線實驗............ 實驗四： 綠膿桿菌的 ALA 誘發光動力抗菌效應............................. 實驗五： 賦形劑 CP 對 ALA 誘發光動力抗菌效應的影響................ 實驗六： 抗生素 oxacillin 合併 ALA 誘發光動力作用的抗菌效果 結論與建議......................................................................... 參考文獻............................................................................. 附錄…………………………………................................. 圖附錄………………………………................................. 表附錄………………………………................................. vii. 頁次 i iii v vii viii x 1 4 4 5 7 12 22 22 26 27 29 30 30 30 33 33 36 39 40 43 45 45 66.
(9) 圖目錄 圖1 圖2 圖3 圖 4.1 圖 4.2.1 圖 4.2.2 圖 4.2.3 圖 4.2.4 圖 4.3 圖 4.4.1 圖 4.4.2 圖 4.4.3 圖 4.4.4 圖 4.4.5 圖 4.5.1 圖 4.5.2 圖 4.5.3. 五-胺基酮戊酸的化學結構….............................................. Carbopol 971P（CP）的化學結構....................................... 光源，紅光，波長：630±5 nm，功率：30 mW／cm2.............. 葡萄球菌濃度對應吸光值的檢量線圖…........................... 葡萄球菌在添加 ALA 及 2.0 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖…………………................................................... 葡萄球菌在添加 ALA 及 1.5 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖………................................................................... 葡萄球菌在添加 ALA 及 1.0 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖………................................................................... 葡萄球菌在添加 ALA 及 0.5 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖………................................................................... 綠膿桿菌濃度對應吸光值的檢量線圖…........................... 綠膿桿菌在添加 ALA 及 2.0 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖…………………................................................... 綠膿桿菌在添加 ALA 及 1.5 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖............................................................................... 綠膿桿菌在添加 ALA 及 1.0 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖…………………………………………………... 綠膿桿菌在添加 ALA 及 0.5 小時光照處理下吸光值的變 化曲線圖................................................................................ 45 45 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55. 細菌在添加 ALA 及進行照光 1.5 小時後，細菌存活率對數值 變化情形................................................................................. 56 葡萄球菌添加 CP 及進行光照 1.0 小時之吸光值變化情形...... 57 綠膿桿菌添加 CP 及進行光照 1.0 小時之吸光值變化情形....... 58 葡萄球菌添加 2.5 mM ALA 及 CP，光照 1.5 小時之吸光值變. 圖 4.5.4. 化情形…………………………………………………….... 59 葡萄球菌添加 5.0 mM ALA 及 CP，光照 1.5 小時之吸光值變. 圖 4.5.5. 化情形.................................................................................... 60 綠膿桿菌添加 2.5 mM ALA 及 CP，光照 1.5 小時之吸光值變. 圖 4.5.6. 化情形.................................................................................... 61 綠膿桿菌添加 5.0 mM ALA 及 CP，光照 1.5 小時之吸光值變. 62. 圖 4.5.7. 化情形.................................................................................... 金黃色葡萄球菌在添加 ALA 及 CP，照光 1.5 小時後，細菌. 63. 圖 4.5.8. 存活率對數值變化情形.......................................................... 綠膿桿菌在添加 ALA 及 CP，照光 1.5 小時後，細菌存活率. 對數值變化情形……………….............................................. 64 viii.
(10) 圖 4.6.1 圖 4.6.2. 抗生素 oxacillin 合併 ALA 誘發光動力作用的抗菌效果... 65 抗生素 oxacillin 合併 ALA 及 CP 誘發光動力作用的抗菌 效果.............................................................................................. 65. ix.
(11) 表目錄 表 1.1 五-胺基酮戊酸光動力抗菌效益在革蘭氏陽性菌的研究成 效……………………….............................................................. 66 表 1.2 五-胺基酮戊酸光動力抗菌效益在革蘭氏陰性菌的研究成 效…….......................................................................................... 67 表 4.6 antibiotic（oxacillin 1µg/disc） susceptibility Testing……………..................................................................... 68. x.
(12) 第一章： 第一章：緒論 在 1929 年 Alexander Fleming 18 發現了可對抗細菌的抗生素「青 ，加上製藥技術提昇，使得抗生素可被大量生產， 黴素（penicillin）」 而被廣泛地使用在治療感染性疾病上，接踵而來的抗生素發現及研 究，使得人們一度認為感染性疾病終將消失。但由於微生物的遺傳變 異，微生物逐漸對抗生素產生抗藥性（antimicrobial resistance） ，使得 之前可容易治療且尋常的感染性疾病越來越難以處理 13，甚至人們可 能會面臨無抗生素可治療感染性疾病的窘境。因此發展出對抗微生物 感染而不產生抗藥性的抗菌治療為當今醫學界所研究的重點之ㄧ。光 動力抗微生物化學療法（Photodynamic antimicrobial chemotherapy； PACT）正具有此優勢 1。 2006 年 Giulio Jori 2 文獻指出光動力療法（Photodynamic therapy； PDT）在致病性微生物感染的治療上具有下列優點： 1、作用範圍廣（a broad spectrum of action）。 2、對抗生素具抗藥性的細菌具有足夠的不活化作用（the efficient inactivation of antibiotic-resistant strains） 。 3、低致突變性（the low mutagenic potential）。 4、對細菌沒有光抵抗性的篩選作用（the lack of selection of photoresistant microbial cells）。. 1.
(13) 故光動力抗微生物化學療法適合細菌感染症的治療。 1900 年 Raab 研究 3 提出 acridine 與可見光的作用下對 Parameciu m caudatum 產生抗菌效果，von Tappeiner 4 證實此過程必需有光與氧 的共同參與，並將此過程命名為光動力效應（Photodynamic effect） 。 而光動力抗微生物化學療法（PACT）係利用光線照射光感物質（Pho ，一般是產 tosensitizers）而產生光毒害性反應（Phototoxic response） 生氧化性損害（Oxidative damage）1。 1990 年 Kennedy 等人研究 5 提出一種新的光感物質前趨物「五胺基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid；ALA）」 ，可許多細胞可自行生合 成 6，並在細胞內可被轉變（transform）成具高度光活化內生吡喀紫 質衍生物（highly photoactive endogenous porphyrin derivatives），如 protoporphyrin Ⅸ（PpⅨ） PpⅨ是一強的光感物質，其可使細胞與組織進行光摧毀作用（Ph otodestruction）7。 由於革蘭氏陰性細菌外膜的複雜性而導致使用天然的或帶陰電 性的吡喀紫質之光動力不活化作用失去效能 8，如 1997 年 Reinhard Sailer 等人研究 9 指出將綠膿桿菌培養在 0.2 mM 之五-胺基酮戊酸中 2.5 小時後，在波長 630 nm、功率（power density）100 mW／cm2 的 雷射光源（Ar+ laser），以光劑量（energy density）400 J／cm2 照射的. 2.
(14) 實驗條件下，並無法得出明顯的光動力抗菌作用。然 2004 年 Chia-Fen Lee 等人研究 10 指出五-胺基酮戊酸（ALA）對綠膿桿菌所進行的光動 力不活化作用是有效之不相吻合的情形。 又 2002 年 Chen 等人之研究 11 指出賦形劑 Carbopol 971P（CP97 1P；CP）可助益 ALA 在口腔癌細胞的光動力之細胞毒殺（cytotoxic） 的效果。 故本研究目的希望能探討 ALA 的光動力抗菌效應及賦形劑 CP 是 否能對 ALA 的光動力抗菌效應有所提升。. 3.
(15) 第二章： 第二章：文獻探討 2.1 五-胺基酮戊酸光動力抗菌效益 胺基酮戊酸光動力抗菌效益 2.1.1 五-胺基酮戊酸光動力效益對革蘭氏陽性菌之抗菌效果 如表 1.1 所示，1999 年 Y. Nitzan21 的研究指出金黃色葡萄球菌在 五-胺基酮戊酸濃度為 0.3 mM，紅光或藍光照射下，光劑量為 50 J／ cm2 時，其存活率下降了 4.2 個對數值，又 2004 年時 Y. Nitzan8 利用不 同的光劑量的光照條件來進行光動力抗菌實驗，結果顯示金黃色葡萄 球菌在五-胺基酮戊酸濃度為 0.38 mM，藍光照射下，光劑量為 100 J ／cm2 時，其存活率下降了 7 個對數值。因此，可知五-胺基酮戊酸光 動力效益對革蘭氏陽性菌之金黃色葡萄球菌確實具有抗菌效應。. 2.1.2 五-胺基酮戊酸光動力效益對革蘭氏陰性菌之抗菌效果 如表 1.2 所示，1997 年 Reinhard Sailer9、1999 年 Y. Nitzan21、K. Szocs21、2002 年 M. Sharma22 及 2004 年 Y. Nitzan8 等研究指出綠膿桿 菌及大腸桿菌…等革蘭氏陰性菌的之五-胺基酮戊酸誘發的光動力抗 菌效應並不明顯，細菌存活率的下降，最多僅有 3.2 個對數值。但在 2004 年 Chia-Fen Lee10 的研究指出綠膿桿菌在五-胺基酮戊酸濃度為 10 mM，紅光照射下，光劑量為 240 J／cm2 時，其存活率下降情形可達 了 8 個對數值以上，相較於之前的研究結果，其五-胺基酮戊酸光動力 效益對革蘭氏陰性菌之抗菌效果可能來自於高度的五-胺基酮戊酸濃 4.
(16) 度及光劑量所致。. 2.2 五-胺基酮戊酸 胺基酮戊酸（ ；ALA） ） 胺基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid； 2.2.1 ALA 是一種光感物質（photosensitizer）的前趨物（precursor） 在細胞內可被轉變具有吡喀紫質（Porphyrins）結構的光感物質， 在適當波長的光線照射下而引發光動力效應。Jian-ming Li 等人 於 1989 年文獻. 11. 指出細胞內之 ALA 的合成反應是 Hemes、. Chlorophylls、Bile pigments 等物質生合成的第一步驟。ALA 有 2 種生物合成路徑，為「the classical Shemin pathway」與「the C5 pathway」。. 2.2.2 the classical Shemin-pathway ： 此路徑存在於動物、真菌、兼性嗜氧菌 （facultative aerobic bacteria）及光合菌（photosynthetic bacteria）等物種中，又稱為 C4 pathway。而 ALA 係由 succinyl coenzyme A（Co A）與 glycine 在 ALA synthase 進行 decarboxylation 所得到。. 2.2.3 the C5 pathway： 此路徑存在於植物、藻類、絕對厭氧菌（strict anaerobic bacteria） 及一些氧合原核生物（oxygenic procaryotes）等物種之中。細胞 內之 ALA 生合成分三步驟： 5.
(17) 1. synthesis of glutamyl-tRNA. 2. reduction with NADPH or NADH to yield glutamic-1-semialdehyde. 3. aminotransference to yield ALA.. 2.2.4 ALA 可轉化成 uroporphyrin, coproporphyrin, protoporphyrin Ⅸ （PpⅨ ）等具高度光活化內生吡喀紫質衍生物，在適當波長的 光線照射下可進行光動力效應。. 6.
(18) 2.3 微生物防治 2.3.1 抗生素作用機轉：抗生素作用概分為 5 類 18 1. 微生物細胞壁合成抑制或破壞細胞壁結構，此類抗生素有 Penicillins, Cephalosporins…。 2. 微生物細胞外膜的破壞，此類抗生素有 Polymyxins…。 3. 微生物核酸、DNA 合成的破壞或修飾其構造，此類抗生素有 Quinolones…。 4. 破 壞 微 生 物 蛋 白 質 合 成 ， 此 類 抗 生 素 有 Aminoglycosides, Tetracyclines…。 5. 破壞微生物能量的代謝，此類抗生素有 Sulfonamides…。. 2.3.2 微生物型態 3 2.3.2.1. 革蘭氏陽性菌細胞外壁（15-80 nm 厚）含多達 100 個 peptidoglycan layers，其由 lipoteichoic acid 與陰電性的 teichuronic acid 緊密組成。此細胞壁具有高度的多孔性 （porosity），因此如 glycopeptides 和 polysaccharides 等分子 量在 30，000-60，000 等許多巨分子被發現擴散至內細胞膜 中。因此此細胞壁並不能擔任一般常用的光感物質（分子量： 1,500-1,800 Da）滲透性障壁（permeability barrier）。. 7.
(19) 2.3.2.2. 相較之革蘭氏陰性菌擁有個附帶 10-15 nm 厚的構造，其位於 peptidoglycan network 外層，其具有一異質性的組成 （heterogeneous composition），包含有孔通道功能（porin function）的蛋白質、及可賦與細菌表面半連續性緻密包裹的 陰電性之 lipopolysaccharide trimers 和 lipoprotein 等蛋白質。 如此結構會抑制宿主的細胞性與體液性防禦因子的穿透，及 引發對一抗生素藥物的抗藥性之機制。僅有分子量小於 600-700 Da 的親水性物質能經該孔通道（porin channels）擴 散進入。此結構可能是促使光動力效應的必要因素。. 2.3.3 世代計算 最常見的細菌繁殖方式為二分法（binary fission），細菌會由一 個分裂成二個；若從一個細菌開始繁殖，則其數目會呈幾何級 數增加：1→2→4→8→16→25 …2n，其中 n 又可稱為世代數 (number of generation)，並假設分裂過程中無細菌死亡。因此， 經過一段時間分裂後總菌數如下表示：. 8.
(20) Nt = 1 ×2n ，Nt：細菌總數 若開始時細菌菌數為 N0 不為 1，則 Nt = N0 ×2n 故細菌繁殖世代數 n＝（log Nt－log N0）／log 2. 若 t0 代表細菌繁殖分裂一個世代的時間，而 t 代表實驗總操作時 間，則預估細菌總數 Nt= N0×2^（t／t0）。. 2.3.4 微生物對抗生素產生抗藥性的機制 2.3.4.1. I.K. Hosein 在 2002 的文獻 12 指出在 1960s 英國政府首先注意 到獸醫畜牧業抗生素的使用與腸道致病原（enteric pathogens） 出現抗藥性趨勢有關聯，而最近數年間醫院發展出許多細菌 對抗生素具有抗藥性，如流行性多重抗藥性金黃色葡萄球菌 （epidemic multiresistant Staphylococcus aureus；EMRSA）、 vancomycin-resistant enterococci（VRE），又社區的 penicillin-resistant pneumococci 發生率升高等情形。細菌抗藥 性可能在某些藥物應用在感染性疾病的治療中出現，原因可 能與對抗感染性疾病合併使用多項抗生素有關。這些具多重 抗藥性的菌株其編碼與抗藥性有關的基因通常由一個單一的 遺傳單位（a single genetic unit）所組成，該遺傳單位可能具 有自我複製的能力（self-replication），如 multiresistance 9.
(21) plasmids；抑或是這些抗藥性遺傳單位可以在細菌細胞之內或 之間進行 genetic transfer。細菌無法藉由單一突變而自發地創 造出複雜的基因系統，大多數的抗藥性感染可能是因為具抗 藥性的菌株自身散播，或是該菌株傳播其抗藥性基因至不同 的菌株或不同種的菌株上所致。故微生物抗藥性的最主要的 問題為攜帶抗藥性基因（resistance-carrying genes）散播的生 態衝擊。. 2.3.4.2. 造成細菌抗藥性的機轉有下列 6 種 13：. 1. 細菌改變細胞壁及細胞膜的結構，降低對抗生素的通透性，使 抗生素無法進入細菌細胞內。 2. 細菌對抗生素作用的標的酵素或蛋白質之基因過度表現(產生) 消耗抗生素。 3. 細菌對抗生素作用的標的酵素或蛋白質的之構造形狀改變，使 抗生素無法結合產生抗菌作用。 4. 細菌改變抗生素作用的生化路徑。 5. 細菌產生特殊酵素分解抗生素或改變抗生素分子形態。 6. 細菌具有可排出抗生素的特殊通道（channel）或幫浦（pump， 如 efflux pump）。 2.3.4.3. 其中，以外流機制（efflux mechanisms）已被廣泛認為是微生 10.
(22) 物對許多種抗生素產生抗藥性的主要原因 14，有些 efflux pumps 選擇性的從細胞內將特殊的抗生素推擠出細胞外，如 多重藥物抗藥性幫浦（Multidrug Resustance Pumps；MDRs） 利用各種作用方式逐出各類結構的化合物 15。 2.3.4.4. 2006 年 George P12 等人之文獻指出在許多革蘭氏陰性桿菌的 染色體中本來就帶有此段輸出幫浦基因但平日未表現，因此 許多革蘭氏陰性桿菌如 P. aeruginosa、 Acinetobacter baumannii 等先天即具有多重抗藥性，一旦外界環境改變(如 酸鹼值、抗微生物製劑等)的介入，該細菌為求適應環境，就 會表現幫浦基因，這一段抗藥基因也可藉由細菌接合以染色 體片段(chromosome)或質體(plasmid)方式再傳至其他菌種。. 2.3.4.5. 這些細菌產生多重藥物抗藥性的原因，可能是細菌本身發生 多次自發性突變(mutation)，或自外界不斷交換及累積藥物抗 藥性基因而來。但近年來微生物學家發現：細菌因環境改變 而內因性表現抗生素輸出幫浦基因，可能是促使細菌發展多 重抗藥的主要原因 16, 20 。. 11.
(23) 2.4 光動力效應 2.4.1 依據 2004 年 Michael R 的文獻指出 16 成功的光動力效應有以下 三種條件： 1. 適當濃度的光感物質。 2. 標的組織存在著豐富的分子氧。 3. 遞送適當功率的光線。. 2.4.2 光感物質（Photosensitizers） 2.4.2.1. 良好光感物質有以下 7 種特性：. 1.. 為已確知化學結構的純物質。. 2.. 其暗毒性最低（minimal dark toxicity）。. 3.. 其細胞毒害性（cytotoxic）僅存在於光照處。. 4.. 可專一地或優先地存留在標的組織。. 5.. 可快數地自人體排出，以減少最低的全身性毒性（systemic toxicity）。. 6.. 可產生大量的單態氧（1O2）或過氧化物（superoxide；O2－） 以進行最大效能的光動力反應。. 7. 在光波長 600-800 nm 處呈現強吸光度，因此波長的光對組織 的穿透性最佳，且此波長的光提供的能量最足夠來產生單態 氧。 12.
(24) 2.4.2.2. 光感物質的種類概略分為兩大類如下：. 2.4.2.2.1 第一大類為具有 porphyrin-related structures 者，又細分成以 下 7 種： 1. Hematoporphyrin derivate and other porphyrin photosensitizers：如 photofrin, tetraarylporphyrins 之 TPP （tetraphenylporphyrin）與 TPPS4, Dendrimeric porphyrin derivatives, amine-modified porphyrins 2. Core-Modified Porphyrins：如 21-thia- and 21-selenaporphyrins 3. 5-Aminolevulinic Acid and Protoporphyrin Ⅸ 4. Phthalocyanines and Related Compounds 5. Chlorin and Bacteriochlorin Derivatives from Naturally Occurring Soures 6. Synthetic Chlorins 7. Core-Expanded Porphyrins 2.4.2.2.2 第二大類為 Non-porphyrin photosensitizers，有以下 6 種： 1. Mitochondrial localization of the cationic dyes rhodamine 123 and AA1 2. Heavy-atom analogues of cationic dyes 3. Heavy-atom analogues of Rh-123 and AA1 4. Methyl blue and related compounds 5. Other cationic dyes 6. Merocyanine 540 and related structures. 13.
(25) 2.4.3 作用機制 2.4.3.1. 光動力效應（Photodynamic effect）1. 光動力效應係由特定波長的光激發存於細胞中的光感物質產生 反應性物質而摧毀細胞。 2.4.3.1.1 當一分子的某原子（具π-system）吸收具某些能量的光時， 該原子會產生一個電子轉變（an electronic transition）成單激 發態（singlet excited state，即 electron spins paired），此後該 分子可能會藉由電子的或物理的（例如：光、熱）方式失去 該能量而回到原基礎態（ground state） ，或進行轉變成三激發 態（triplet excited state，即 electron spins unpaired），此時該 三激發態分子可能會進行電子衰退回復成基礎態、或是與分 子周圍的物質進行氧化還原反應（redox reaction） 、或是將其 激發的能量（excitational energy）轉換給氧分子（triplet-state molecule）而導致成不穩定的單態氧（labile singlet oxygen）。 此分子鼓動氧化還原反應或形成單態氧的能力端賴三態分子 產生的量而成。 2.4.3.2. 光動力損傷有兩種型態. 2.4.3.2.1 Type Ⅸ photodamage：第一種型態係因光感物質之電子或氫 原子的抽提作用（abstraction）產生自由基，與其周圍的氧分. 14.
(26) 子作用形成產生反應性氧物種（reactive oxygen species； ROS） ，接著與附近的標的生物分子進行氧化還原反應。在微 生物內部的水產生 Type Ⅸ 反應，使微生物內部的羥基自由基 （hygroxyl radicals）增加，而與生物分子（如胞膜）反應， 或彼此結合成過氧化氫（hydrogen peroxide）產生細胞毒害 （cytotoxic）的結果。如胞膜上未飽和分子磷脂質的丙烯基 氫（allylic hydrogens）產生抽提作用而形成自由基，接著與 氧作用產生脂質過氧化物（lipid hydroperoxide） ，而使得胞膜 失去其完整性及流通性，和滲透性（permeability）增加。 2.4.3.2.2 Type Ⅸ photodamage：第二種型態當三態光感物質轉換能量 給氧分子，單態氧即形成，並快速立即與周圍的生物分子（如 細胞壁、核酸等）作用，因單態氧的半衰期甚短，故其作用 距離短（通常僅有數微米），僅限於局部。 2.4.3.2.3 一般較被接受在光氧化的微生物細胞損傷（photooxidative microbial cell damage）上的主要路徑是 Type Ⅸ photodamage 。單態氧也會與細胞壁及細胞膜上的分子作 用，但與 Type Ⅸ photodamage 仍有些不同，如與 cholesterol 作用，Type Ⅸ 反應會形成 cholesterol-7α或 7β -hydroperoxide，但 Type Ⅸ 反應僅會形成 5α-isomer。. 15.
(27) 2.4.3.2.4 而細胞壁（及膜）上的胺基酸如色胺酸（tryptophan）會與單 態氧進行環化加成作用（cycloaddition）而形成甲醯苯胺 （formanilide derivative），甚至會進一步形成胜肽交聯 （peptide crosslinking） 、如甲硫胺酸基（methionine residues） 會與單態氧作用產生 methionine sulphoxide。 2.4.3.2.5 一般已知，核酸是主要是作用在鳥糞嘌呤基（guanosine residues）上，然 Type Ⅸ 反應是藉由 hydoxyl radical 攻擊五碳 醣基，而 Type Ⅸ 反應是經由單態氧攻擊鳥糞嘌呤鹽基 （guanine base）位置。. 16.
(28) 2.4.4 ALA 在生物中所扮演的角色 17 2.4.4.1. ALA 在生物中所扮演的角色為生物體內合成 porphyrins 的前 趨物（precursor）。. 2.4.4.2. 光活化的 porphyrins（photoactivated porphyrins）對許多的微 生物如革蘭式陽性菌、黴漿菌及酵母菌等具有細胞毒害活 性，是微生物光敏化作用（photosensitization）的必要作用物 質。. 2.4.4.3. 藉由 porphyrin photoactivation reactions 誘發的細胞損害可能 是 ROS（reactive oxygen species；反應性氧物種）形成所致。. 2.4.4.4. 下列兩種狀況，主要是可見光激發之 Type Ⅸ 光化學反應所產 生的單態氧所致。 1.. 吸收光子後的 porphyrin 分子會被激發成單態激發態. （excited singlet state），其經內能系統（intersystem）作用 （crossover）形成三態激發態（excited triplet state）。此三態 激發態之 porphyrin 分子較穩定，會與水中的氧反應，並轉移 能量給此基本態的氧分子（3O2）形成具反應性的單態氧 （1O2）。 2.. 而其他的 ROS 如 hydroxyl radicals、superoxide ion 與. biomolecule radicals 等是由 porphyrin 與 320-360nm 波長的光 17.
(29) 線作用下所產生。 2.4.5 Photodynamic inactivation of microbial cells. 2.4.5.1. 在 S. aureus 的模式時，當對數生長期的細菌受少劑量的 porphyrin 與光線照射下，細菌的生長會被抑制，而停止，2 小時後 99％的細菌死亡，10 小時後已無任何存活的細菌被偵 測出。但使用遲緩期的細菌進行實驗發現僅少量的細菌被殺 死，而大多數的細菌呈無影響地繼續繁殖（使用 hematoporphyrin derivative （HpD）充任 porphyrins）。在提 高 porphyrin 劑量下細菌才被殺死。. 2.4.5.2. 一般而言，光動力作用導致革蘭氏陽性菌存活率少於 0.01 ％ 的最適當光敏化條件：在酸鹼度為 6.5、porphyrin 劑量為 10 μg／ml、6mW／cm2 的光源下。. 2.4.5.3. 革蘭氏陰性菌對 porphyrin 所誘發的光損傷具有抵抗性，除非 其外膜結構去除。. 2.4.5.4. protoporphyrin（PP） 、deuteroporphyrin（DP） 、hematoporphyrin （HP）等濃度在 1-50 ug／ml 時對細菌有類似的光動力效 應，但經修飾過或合成之具有不同側鏈之 porphyrins 對細菌 是無光動力效應。. 18.
(30) 2.4.6 Porphyrin binding to bacterial cells. 2.4.6.1. 革蘭氏陰性菌之細胞壁阻礙 porphyrin 與細胞膜結合。此藉由 將革蘭氏陰性菌之外膜去除而形成 spheroplasts 時，此 spheroplast 之光動力效應與金黃色葡萄球菌相似。故微生物 光敏化作用（photosensitization）的必要條件為 porphyrin 對 細胞質膜（cytoplasmic membrane）的結合。. 2.4.6.2. 革蘭氏陰性菌之外膜與特殊細胞壁的 peptidoglycan 等構造阻 礙 porphyrin 與細菌內膜結合。. 2.4.6.3. 細菌細胞壁之結構如同海綿一般，會吸收 porphyrin，此由 porphyrin uptake 的偽陽性反應證實。. 2.4.6.4. 細菌細胞膜對 HPD 的結合受酸鹼度調控；金黃色葡萄球菌在 酸鹼度為 6.5 時的結合度最大，酸鹼度為 7.6 時最小，此結果 由光動力效應得出。. 2.4.6.5. 將在暗處與 porphyrin 培養一段時間的細菌培養基洗去 porphyrin，將細菌種至無 porphyrin 的新鮮培養基後照光，發 現細菌生長受到抑制。. 19.
(31) 2.4.7 Possible mechanisms of bacterial photoinactivation. 2.4.7.1. 細菌之光動力不活化作用的 5 種進程：. 1. porphyrin 被細菌細胞壁吸收進入。 2. porphyrin 與內膜結合。 3. 此結合作用在無光線存在下進行，且對細胞無毒性。 4. porphyrin 可能被轉移至細胞質中。 5. 細菌的光不活化作用係藉由 porphyrin 與內膜結合或是進入細 胞質中產生。. 2.4.7.2. 光不活化效應（photoinactivation）產生的效應依序為：. 1. 細菌繁殖減少。 2. 快速的細菌死亡，及明顯的菌落數（colony-forming units）減 少。 3. 細菌生長抑制也伴隨著快速的碳 14 葡萄糖的消耗 （14C-glucose consumption）。 2.4.7.3. 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope；TEM） 可以顯示出 porphyrin photoinactivation 後 1 小時的現象；. 1. 大多數的細菌無法完成細胞壁合成及細胞分裂。 2. 存活的細菌藉著未完成的隔膜(septa)與親代或鄰近的細胞連 結。 20.
(32) 3. 在 3 小時後大多數的細菌熔解（lysis） ，或有少部份的細菌呈 現停止於未完成的分裂相中。 4. 存活的金黃色葡萄球菌的質體（plasmid）無法被誘發合成或 編碼 penicillinase。 5. 受到 photosensitization 的革蘭式陽性菌具有間體（mesosome） 及其正分裂的細菌（dividing cells）其近隔膜（septum）處有 複層（multilamellar structure）結構等現象出現。 6. 當光動力處理的時間越久，間體出現的頻率會越多，且間體 的體積會越來越大。. 21.
(33) 第三章： 第三章：材料與方法 3.1 材料 3.1.1 菌株（ ） 菌株（Bacterial strains） 3.1.1.1. 革蘭氏陽性菌菌株： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；BCRC 11863、ATCC 29213). 1. 大小：菌的大小約為 1μm,菌落的直徑大小約為 2～4 mm。 2. 菌落特徵：在 agar plate 上則有不透明圓形、凸起，直徑為 2 ～4 mm 的白色或金色的菌落。 3. 適合生長的環境：. 3.1.1.2. （1）. Growing at a temperature range of 6 to 46℃. （2）. 適合生長的溫度：30～37℃. （3）. 生長的 pH 值：4.2～9.3. 革蘭氏陰性菌菌株： 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa；BCRC 11864、ATCC 27853). 1. 大小：菌的大小約為 1.5～3.0μm 長，0.5～0.8μm 寬，多具 菌毛或由藻多醣組成類似莢膜的外膜，使其菌落成黏稠狀， 此菌不產生胞子。 2. 菌落特徵：能在培養基上快速生長成光滑圓形的菌落，具綠. 22.
(34) 色螢光色澤及特殊的芳香氣味。 3. 適合生長的環境： （1） 適合生長的溫度：25～37℃。 （2） 生長的 pH 值：5～7。. 3.1.1.3. 培養法： 將菌株種至 NB（Nutrient Broth）液態培養基中在 37℃培養 24 小時，勾取菌液塗布至 NB 瓊膠（Nutrient Broth Agar）固 態培養基中在 37℃下培養 24 小時，如此操作三次，以使菌株 活化，呈對數生長形態。. 23.
(35) ） 3.1.2 藥劑（ 藥劑（reagent） 3.1.2.1. 5-Aminolevulinic acid hydrochloride（ALA．HCl）：6. 3.1.2.1.1 分子量為 167.61 Da， 化學名：5-amino-4-oxo-pentanoic acid、 別名：delta-aminolevulinate、γ-keto-δ amino valerate 3.1.2.1.2 解離常數（dissociation constants）為 pKa1 = 3.90 及 pKa2 = 8.05 ，在酸鹼度低至 2-2.25 的酸性環境下，其胺基質子化 （NH4+） ，化學結構安定，購自 Sigma （St. Louis, MO, USA, LOT No L700902 229） ，如圖 1 所示。 3.1.2.1.3 Stock Solution： 秤取 0.0168 g 之 ALA 溶於 PBS 緩衝溶液中，混合均勻，得 濃度為 100 mM ALA 儲備溶液，置於冷處避光儲存，1 小時 內進行實驗操作。 3.1.2.2 Carbopol 971P（CP971P；CP）19（由台灣大學醫學院光電研 究所陳進庭教授提供） 3.1.2.2.1 mw：1.25x106 Da 化學名：Carbomer, 別名：Carbopol, Acritamer, acrylic acid polymer, polyacrylic acid. 24.
(36) 3.1.2.2.2 由高分子量的 acrylic acid 所聚合而成，由 pentaerythritol 的 allyl ether 鍵結，含 56-68％caeboxylic acid(COOH)基，常應 用於外用皮膚製劑，口服製劑等賦形劑，如圖 2 所示。。 3.1.2.2.3 Stock Solution： 秤取 0.5 g 之 CP 溶於逆滲透去離子純水（ddH2O）中，混合 均勻，得濃度為 0.5％（w／v）CP 儲備溶液，置於冷處儲存。 3.1.2.3 DifcoTM Nutrient Broth 3.1.2.3.1 Becton, Dickinson and Company,生產 3.1.2.4 BBLTM Agar Granulated 3.1.2.4.1 Becton, Dickinson and Company,生產 3.1.2.5 Sensi-DiscTM 230906（4330906） LOT No. ch.-B 6046411 3.1.2.5.1 1 µg OXACILLIN／Disc 3.1.2.5.2 Becton, Dickinson and Company,生產. 25.
(37) 3.2 儀器 3.2.1 ELISA-reader MICROPLATE AUTOREADER EL311, BIO-TEK INSTRUMENTS.，測定使用波長 595 nm。 3.2.2 Low Temperature Incubator, LE-509, YIH DER. 3.2.3 光源（由台灣大學醫學院光電研究所陳進庭教授提供），如圖 3 所示。 3.2.3.1. Red light with a wavelengh of 630±5 nm was chosen and the output power was set at 30 mW／cm2.. 3.2.3.1.1 光劑量（light dose）的計算： light dose（ （ J／ ／ cm2） = output power（ （mW／ ／cm2）× illumination time（ （sec） ）／1,000. 26.
(38) 3.3 實驗流程與操作方法 3.3.1 細菌檢量線實驗 20： 3.3.1.1. 在細菌活化後測定在對數期的細菌濃度與吸光度的相對關係 曲線。. 3.3.1.2. 取各種濃度的細菌菌液在光度計（ELISA-reader, λ=595 nm） 下測定其吸光度。. 3.3.1.3. 將各濃度的菌液用 PBS 溶液為溶劑進行 10-1 倍的序列稀釋 （serial dilution），取適當濁度的稀釋菌液 100 μl 塗佈於固 態瓊脂培養基上，在培養箱中 370C 下培養 16-18 小時後記算 菌落數，推算原菌液濃度，在與對應的吸光值作圖求取該細 菌檢量線。. 3.3.2 光動力實驗 光動力實驗： 3.3.2.1. 將種於 NB 液態培養基的菌液依實驗所需將 ALA 及 CP 添加 至菌液中，混勻(均避光)，儲放 60 分鐘. 3.3.2.2. 取 0.0, 1.0, 2.5, 10.0 mM ALA-細菌混合液 200 μl 置入 well 中照光（波長：630±5 nm、輸出功：30 mW／cm2），光照時 間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0 等小時。. 3.3.2.3. 在實驗操作時每 15-30 分鐘使用 ELISA-Reader 測定各實驗組 之 OD。 27.
(39) 3.3.2.4. 在光照完成後取 100 μl 菌液，以 PBS 溶液為溶劑，採 10-1 倍的序列稀釋方式稀釋，取稀釋後的菌液 100μl 塗布至瓊膠 固態培養基上，之後將此瓊膠培養基置培養箱中 370C 避光培 養，14-18 小時後記數瓊膠培養基上菌落數。. 3.3.3 結合抗生素之光動力抗菌實驗： 結合抗生素之光動力抗菌實驗： 3.3.3.1. 菌株為對抗生素 oxacillin 具有 intermediate susceptibility 之 Staphylococci，其抑制圈直徑為 11-12 mm。. 3.3.3.2. 將菌液均勻塗布至瓊膠培養基上. 3.3.3.3. 之後將含有抗生素（Oxacillin）的 disc 貼附. 3.3.3.4. 滴加 10μl 各含有 2.5, 5.0 mM ALA, 0.0％, 0.001％, 0.01％ CP 與 NB 之混合液至 disc 上，370C 下避光靜置 1 小時。. 3.3.3.5. 將 disc 照光（波長：630±5 nm、輸出功：30mW／cm2）1.5 小時（162 J／cm2）. 3.3.3.6. 照光後將 disc 置培養箱中 370C 避光培養，14-18 小時後觀察 瓊膠培養基上的抑菌圈大小. 28.
(40) 3.4 實驗目的 3.4.1 探索 ALA-induced photodynamic antimicrobial effect on gram positive and negative bacteria. 3.4.2 瞭解賦形劑 CP 是否對 ALA-induced photodynamic antimicrobial effect 有所助益。 3.4.3 探討 ALA-induced photodynamic effect 是否能助益抗生素 oxacillin 的抗菌效果。 3.4.4 評估利用微生物在吸光度的變化作為快速檢測抗菌效果檢測 法。. 29.
(41) 第四章： 第四章：實驗結果與討論. 4.1 實驗一： ）所對應細菌（ 實驗一：ELISA-reader 測定的吸光值（ 測定的吸光值（OD） 所對應細菌（S. aurus） ）濃度（ ／ml） ）的檢量線 濃度（108 cfu／ 4.1.1 如圖 4.1 所示，培養於 NB 的金黃色葡萄球菌濃度與 ELISA-reader 測得的吸光值具有相對正比增加的關係，可應用 此檢量線求得約略的菌液濃度。. 4.2 實驗二 實驗二： ：金黃色葡萄球菌之 金黃色葡萄球菌之 ALA 誘發光動力抗菌效應 4.2.1 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進 行紅光光照 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 小時之實驗結果與討論，如圖 4.2.1、 4.2.2、4.2.3、4.2.4 所示。. 4.2.2 細菌未添加 細菌未添加 ALA 且未照光之對照組： 且未照光之對照組： 4.2.2.1. 當細菌未添加 ALA 且未照光之對照組，其吸光值（OD of ELISA-reader）的變化均呈逐漸上升的趨勢，此現象顯示金 黃色葡萄球菌呈現正常繁殖生長的情形。而細菌未添加 ALA 但有照光者，OD 的變化均也呈現逐漸上升的趨勢，甚至與 未加 ALA 未照光者接近，此現象顯示紅光光照對金黃色葡萄 球菌繁殖生長的情形無影響。. 30.
(42) 4.2.3 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照 2 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：216 J／ 4.2.3.1. 金黃色葡萄球菌添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之各實驗 組，自照光開始，各組的吸光值均呈逐漸下降的趨勢（其中 以添加 1.0 mM ALA 者下降趨勢似乎較為平緩） ，其結果顯示 金黃色葡萄球菌在添加 ALA ㄧ小時後照光 2 小時的操作時， 可能有抑制金黃色葡萄球菌的繁殖生長情形，甚至可能有抗 菌效果。. 4.2.4 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照 1.5 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：162 J／ 4.2.4.1. 金黃色葡萄球菌在添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時 後，在紅光照射 1.5 小時期間均呈吸光度下降的趨勢，雖其 下降趨勢較光照 2.0 小時者平緩，其結果顯示金黃色葡萄球 菌在添加 ALA ㄧ小時後照光 1.5 小時的操作上，可能有光動 力抗菌效果。. 4.2.4.2. 在光照停止後各 ALA-treated 者之吸光值及不再下降，呈現 平緩的情形，其可能表示著細菌生長繁殖呈現抑制情形。. 4.2.4.3. 其細菌存活情形，如圖 4.4.5。當 ALA 為 1.0 mM 時細菌下降 了 6 個對數值，2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 者之細菌下降了近 8 個對數值，其結果顯示 ALA 誘發的光動力抗菌效應：. 10.0 mM ALA treated＞5.0 mM＞2.5 mM＞1.0 mM 31.
(43) 4.2.5 細菌添加 、 0.5 小時（ ／cm2） 細菌添加 ALA 且光照 1.0、 小時（光劑量： 光劑量：108, 54 J／ 者： 4.2.5.1. 在光照停止之前各實驗組之吸光值變化情形均與前光照 2.0 或 1.5 小時者相似，但在光照停止後各 ALA-treated 組均呈現 吸光值上升情形，其吸光值上升趨勢似乎與 ALA 濃度成反向 關係，即 ALA 濃度越高者吸光值增加趨勢越平緩，上升趨勢 強度為：1.0＞2.5＞5.0≧10.0 mM ALA 者，又以光照 0.5 小 時者最明顯，此現象可能表示 0.5 小時的光照時間在本實驗 條件下無法產生足夠光動力抗菌效應。. 32.
(44) 實驗三： ：綠膿桿菌濃度對應 ELISA-reader 的檢量線實驗 4.3 實驗三 4.3.1 如圖 4.3，培養於 NB 的綠膿桿菌濃度與 ELISA-reader 測得的吸 光值具有相對正比的關係，可應用此檢量線求得約略的菌液濃 度。. 實驗四： ：綠膿桿菌的 ALA 誘發光動力抗菌效應 4.4 實驗四 4.4.1 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行紅光 光照 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 小時之實驗結果與討論，如圖 4.4.1、4.4.2、 4.4.3、4.4.4 所示。. 4.4.2 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照時間 2 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：216 J／ 4.4.2.1 在未照光前 1 小時中，各實驗組（除細菌添加 10.0 mM ALA 組之外）及對照組其吸光值的變化均呈逐漸上升的趨勢，此 現象顯示綠膿桿菌呈現正常繁殖生長的情形，然濃度過高的 ALA 可能會影響綠膿桿菌的正常繁殖生長 4.4.2.2 綠膿桿菌中添加 2.5, 1.0 mM ALA 的各實驗組的吸光值變化 趨勢也ㄧ致，其結果顯示綠膿桿菌在添加 2.5, 1.0 mM 等濃度 的 ALA 之處理對綠膿桿菌並無抑制其繁殖生長的影響，呈現 與未添加 ALA 之對照組相類似的繁殖生長速率。 4.4.2.3 添加 10.0, 5.0 mM ALA 的綠膿桿菌未照光時其生長繁殖未如 33.
(45) 其他各實驗組快速的原因，可能是受 ALA 的低酸鹼度及受 ALA 誘發的光動力效應所影響。 4.4.2.4 未添加 ALA 的綠膿桿菌之照光組與未照光組在光照期間中， 二組之各時間點的吸光度相近及增加速率相似，其表示細菌 繁殖生長在 2 小時的光照下並無影響。 4.4.2.5 綠膿桿菌添加 10, 5.0, 2.5 及 1.0 mM ALA 之各實驗組，自照 光開始，各組的吸光值均呈逐漸下降的趨勢，尤其是添加 10 mM ALA 處理的實驗組，其吸光值下降情形與其他各組比較 下最為明顯，且也是最低。其結果顯示綠膿桿菌在添加 10.0, 5.0, 2.5, 1.0 mM 等濃度的 ALA ㄧ小時後照光 2 小時的操作有 抑制綠膿桿菌的繁殖生長情形，甚至可能有抗菌效果。. 4.4.3 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照時間 1.5 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：162 J／ 4.4.3.1 綠膿桿菌在添加 ALA ㄧ小時後，在紅光照射 1.5 小時期間均 呈吸光度下降的趨勢，其結果顯示綠膿桿菌在添加 ALA ㄧ小 時後照光 1.5 小時的操作有抑制綠膿桿菌的繁殖生長情形及 可能有抗菌效果。 4.4.3.2 在紅光照射結束後，添加 2.5, 1.0 mM ALA 之實驗組的吸光度 有逐漸增加的情形，顯示 ALA 在此二濃度的光動力抗菌效應 不佳，而含 5.0, 10.0 mM ALA 之實驗組的吸光度呈平緩情 34.
(46) 形，顯示 ALA 在此二濃度的光動力抗菌效應較前二濃度好。 4.4.3.3 其細菌存活情形，如圖 4.4.5 所示：當 ALA 為 1.0 mM 時細菌 下降了近 4 個對數值，2.5 mM 時細菌下降了近 5.3 個對數值， 5.0 mM 時細菌下降了近 6.5 個對數值，10.0 mM 時細菌下降 了 8 個對數值。 4.4.3.4 結果顯示 ALA 誘發的光動力抗菌效應： 10.0 mM ALA treated＞5.0 mM ALA＞2.5 mM ALA＞1.0 mM ALA. 4.4.4 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照時間 1.0 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：108 J／ 4.4.4.1 在光照時間 1.0 小時的添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之 各實驗組，結果顯示在 10.0 及 5.0 mM ALA 處理下，各實驗 組菌株較有明顯 ALA 誘發光動力抗菌效應，但在光照後細菌 仍有逐漸快速生長的趨勢。而在 2.5 及 1.0 mM ALA 處理下， 各實驗組菌株無明顯 ALA 誘發光動力抗菌效應。 4.4.5 細菌添加 ／cm2）者： 細菌添加 ALA 且光照時間 0.5 小時（ 小時（光劑量： 光劑量：54 J／ 4.4.6 在光照時間 0.5 小時的添加 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA 之各實驗 組，結果顯示各實驗組雖在光照期間吸光值均有下降或平緩的 情形，但在光照之後各實驗組吸光值均呈明顯上升的現象，顯 示 0.5 小時的 ALA 誘發光動力效應並不顯著，可能是光照時間 不足所導致。 35.
(47) 4.5 實驗五 實驗五： ：賦形劑 CP 對 ALA 誘發光動力抗菌效應的影響 4.5.1 此實驗的目的在於測試賦形劑 CP 的添加是否對細菌會造成影 響？ 4.5.1.1. 實驗結果如圖 4.5.1 所示，金黃色葡萄球菌在僅添加了賦形劑 CP 一小時後照光 1.0 小時，實驗結果顯示各實驗組吸光值增 加，其中含 0.001％ CP 者吸光值上升趨勢最高，與未添加 CP 者幾乎完全相同，顯示添加 CP 的細菌在光照下並無抑制 細菌生長繁殖的情形。. 4.5.1.2. 實驗結果如圖 4.5.2 所示，綠膿桿菌菌在添加了賦形劑 CP 一 小時後照光 1.0 小時，實驗結果顯示各實驗組吸光值均呈現 增加趨勢，但各組吸光值增加趨勢不一，增加趨勢斜率越大 者其 CP 濃度越低，此現象可能與 CP 賦予的低酸鹼度有關，。. 4.5.2 賦形劑 CP 對 ALA 誘發光動力抗菌效應的影響無非是使其效應 無效、更有效或是不影響，依前項實驗得知 2.5，5.0 mM ALA 在光照的操作下，其光動力抗菌效應介於敏感與不敏感之間， 故利用此二濃度之 ALA 合併 CP 來測驗賦形劑 CP 對 ALA 誘發 光動力抗菌效應的影響 4.5.3 細菌添加 2.5, 5.0 mM ALA 及 0.0％, 0.001％, 0.005％, 0.01％等 濃度的 CP971P ㄧ小時後進行光照 1.5 小時之實驗結果與討論，. 36.
(48) 如圖 4.5.3、4.5.4、4.5.5、4.5.6 所示。. 4.5.4 細菌在 2.5, 5.0 mM ALA 合併 0.0％ ％, 0.001％ ％, 0.005％ ％, 0.01％ ％等 濃度的 CP 進行光照 1.5 小時者： 小時者： 4.5.4.1. 金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌在 ALA 及 CP 處理下ㄧ小時，在 紅光照射 1.5 小時期間均呈吸光度下降的趨勢，且在光照之 後各實驗組吸光值均呈現平緩無上升的情形，而 ALA 合併 0.001% CP 者與僅含有 ALA 者吸光值趨勢相似，由此顯示賦 形劑 CP 可能對細菌之 ALA 誘發的光動力抗菌效應並無助 益，抑或是吸光值變化敏銳度不明顯。. 4.5.4.2. 在進行細菌序列稀釋及 plate counting 後得知各實驗組之細菌 濃度及其存活率變化情形. 4.5.4.2.1 如圖 4.5.7 所示，當 1.0 mM ALA 合併 0.0%, 0.001% CP 時金 黃色葡萄球菌存活率下降 6 個對數值，0.005％時細菌存活率 下降了近 6.7 個對數值，0.01％時細菌下降了近 8 個對數值等 結果顯示，賦形劑 CP 對 ALA-PDT 有幫助。 4.5.4.2.2 又如圖 4.5.8 所示，當 ALA 合併 0.0%, 0.01% CP 時綠膿桿菌 存活率均下降有 1.8 個對數值以上之結果顯示，賦形劑 CP 對 ALA-PDT 有幫助。 4.5.4.2.3 綜上結果得知，CP 對 ALA 誘發的光動力抗菌效應稍有助 37.
(49) 益，而 CP 濃度越高細菌存活率下降情形的可能原因也或許 是來自其低酸鹼度所導致。. 38.
(50) 實驗六： ：抗生素 oxacillin 合併 ALA 誘發光動力作用的抗菌效 4.6 實驗六 果 4.7 如表 4.6 及圖 4.6.1, 4.6.2 所示，由實驗結果看來 ALA 誘發的光 動力效應對 oxacillin 呈現半敏感性（intermediate）之葡萄球菌的 抗菌作用，使呈敏感性反應（sensitive），可證明 ALA 誘發的光 動力抗菌作用對抗生素 oxacillin 具有抗藥性的菌株具有抗菌效 果，且隨 ALA 濃度增加而增加。 4.7.1 單一賦形劑 CP 對 oxacillin 半敏感性（intermediate）葡萄球菌作 用也有抗菌效果，且對於 ALA 誘發的光動力抗菌作用具有增益 的效果。. 39.
(51) 第五章： 第五章：結論與建議 5.1 五-胺基酮戊酸誘發之光動力效應對金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌是 具有作用的。 5.1.1 綜合文獻探討及進行實驗操作證明五-胺基酮戊酸誘發之光動力 效應對金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌是具有抗菌效用的。 5.1.2 對金黃色葡萄球菌而言，五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效應 的條件為五-胺基酮戊酸濃度為 1.0 mM 及光劑量為 162 J/cm2 時 是有效的。 5.1.3 對綠膿桿菌而言，五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效應的條件 為五-胺基酮戊酸濃度為 2.5 mM 及光劑量為 162 J/cm2 時是有效 的。 5.2 五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌作用，依添加的五-胺基酮戊酸而 言，是金黃色葡萄球菌優於綠膿桿菌。 5.3 五-胺基酮戊酸誘發之光動力效應對綠膿桿菌具有作用的原因可能 在高濃度的五-胺基酮戊酸參與有關。 5.4 五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效果與光照時間有關，在光劑量 小於 108 J／cm2 時是無明顯的光動力抗菌效應。 5.4.1 因此光動力抗菌實驗僅測定光劑量 162 J／cm2，依各實驗組吸 光值的變化情形，當光劑量低於 108 J／cm2 時，吸光值在光照 40.
(52) 停止後未完全呈現下降或是持平的趨勢，或許在光劑量小於 108 J／cm2 時是無明顯的五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效應。 5.5 利用 ELISA-reader 測得微生物生長繁殖情形的應用在抗菌效應的 操作上是一快速又可立即知悉抗菌效用的好方法。 5.5.1 以往利用菌液序列稀釋與 plate counting 的方式是為最準確的方 法，然操作時間過長，需要 12-18 小時以上方可得知結果，又因 操作的熟稔度及無污染的要求，可能更加長了操作時間。而光 度計利用顆粒性物質散射光線的原理綜合了微生物快速生長繁 殖的特性，使用 ELISA-reader 測得微生物生長繁殖情形，來瞭 解抗菌效應，可在一短暫的時間內，得知微生物生長繁殖是否 受抑制的方式來立即知悉抗菌效用。 5.6 合併賦形劑 CP 對於五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效果是有增 益的。 5.6.1 在藥劑學的觀點上，賦形劑的使用目的為使藥品方便投與給 藥，在不影響藥品安定性及藥效要求下，使藥品有效成份在生 物體上呈現最大的吸收及作用，並非在於促進藥品有效成份的 藥理作用，故賦形劑的條件是需要不影響藥效作用的物質為 之，但此賦形劑 CP 除增加五-胺基酮戊酸誘發之光動力抗菌效 果外，其本身似乎有抗菌效果，尤其在搭配光照下，對抗生素. 41.
(53) oxacillin 不甚有效的葡萄球菌卻有明顯的抑制作用，就現在醫界 對具抗生素抗藥性微生物（如 MASA, COSA，皆為葡萄球菌屬 微生物）無可多樣藥品可選擇的窘境，似乎是一項良好的選擇。 5.7 單一的賦形劑 CP 對於對抗生素 oxacillin 有耐受性的葡萄球菌有抗 菌效果，合併五-胺基酮戊酸誘發之光動力作用的抗菌效果更佳。 5.7.1 以在接未來的研究中，應對賦形劑 CP 的抗菌機轉應有更大的投 入。. 42.
(54) 參 考 文 獻. 1.. Mark Wainwright. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1998；42, 13–28.. 2.. Jori G, Fabris C, Soncin M, Ferro S, Coppellotti O, Dei D, Fantetti L, Chiti G, Roncucci G. Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic. 3.. principles and perspective applications. Lasers Surg Med. 2006 Jun;38(5):468-81. Raab O. Uber die wirkung fluoriziender stoffe auf infusorien. Zeit Biol 1900；. 4.. 39；524-546 von Tappeiner H. Zur kenntis der lichtwirkenden（fluoreszierender） stoffe. Dtsch Med Wochen 1904；1：579-580. 5.. Kennedy JC, Pottier RH, Pross DC. Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical experience. J Photochem Photobiol B 1990;6:143–8.. 6.. 7.. 8.. 9.. Haydée Fukuda, Adriana Casas, Alcira Batlle. Molecules in focus Aminolevulinic acid: from its unique biological function to its star role in photodynamic therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37 (2005) 272–276 LiWei Ma﹐Saulius Bagdonas﹐Johan Moan. The photosensitizing effect of the photoproduct of protoporphyrin Ⅸ. J. Photochem. Photobiol.﹐B﹐2001；60： 108-113. Yeshayahu Nitzan, Mali Salmon-Divon, Einav Shporen and Zvi Malik. ALA induced photodynamic effects on Gram positive and negative bacteria. Photochem. Photobiol. Sci.；2004：3, 430–435 Reinhard Sailer , Wolfgang S.L. Strauss, Karsten Kiinig, Angelika Riick, Rudolf Steiner. Correlation between porphyrin biosynthesis and photodynamic inactivation of Pseudomonas aeruginosa after incubation with 5-aminolaevulinic acid. J. Photochem. Photobiol.﹐B﹐1997；39：236-242.. 10. Lee CF, Lee CJ, Chen CT, Huang CT.δ-Aminolaevulinic acid mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on Pseudomonas aeruginosa planktonic and biofilm cultures. J. Photochem. Photobiol. B. 2004 Jul 19;75(1-2):21-5. 11. Hui-Chun Chen, Tsuimin Tsai, Design of a 5-Aminolevulinic Acid Delivery System for Photodynamic Diagnosis of Oral Premalignant and Malignant Lesions. 2002. Thesis Master of Sceince Grsduate Institute of Biomedical Materials, Taipei Medical University. 12. Jian-ming Li, Ormond Brathwaite,1 Sharon D. Cosloy,2 and C. S. Russell3. 43.
(55) 5-Aminolevulinic Acid Synthesis in Escherichia coli. Journal of bacteriology, May 1989, p. 2547-2552 13. I.K. Hosein, D.W. Hill, L.E. Jenkins and J.T. Magee, Clinical significance of the emergence of bacterial resistance in the hospital environment. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement. 2002, 92, 90-87 14. Poole, K. 2005. Efflux-mediated antimicrobial resistance. J. Antimicrob. Chemother. 56:20–51. [Online.] doi:10.1093/jac/dki171. 15. George P. Tegos and Michael R. Hamblin1, Phenothiazinium Antimicrobial Photosensitizers Are Substrates of Bacterial Multidrug Resistance Pumps. Antimicrobial agent and chemotherapy, Jan. 2006, p. 196–203 16. Michael R. Detty, Scott L. Gibson, and tephen J. Wagner, Current Clinical and Preclinical Photosensitizers for Use in Photodynamic Therapy. Journal of medicinal chemistry. 2004, Volume 47, Number 16. 17. Z. Malik, J. Hanania and Y. Nitzan, Bactericidal effects of photoactivated porphyrins–an alternative approach to antimicrobial drugs, J. Photochem. Photobiol., B, 1990, 5, 281–93. 18. Theodrore M. Brody, Joseph Larner, Kenneth P. Human pharmcology： molecular to clinic.Third edition, 1998 19. Raymond C Rowe, Paul J Sheskey and Sian C Owen. Handbook of pharmaceutical Excipients. Fifth Edition 2006 20. Kathleen Park Talavo, Foundations in Microbiology fifth edition. 2005, McGraw-Higher Education. 21. Y. Nitzan and M. Kauffman, Endogenous Porphyrin Production in Bacteria by δ -Aminolaevulinic Acid and Subsequent Bacterial Photoeradication, Lasers Med Sci 1999, 14:269–277 22. Mrinalini Sharma. Harsha Bansal and Pradeep Kumar Gupta, Photodynamic inactivation of antibiotic resistant strain of Pseudomonas aeruginosa by porphyrins induced by δ-aminolaevulinic acid, Indian J Med Res 116, September 2002, pp 99-105 23. K. Szocs, F. Gabor, G.. Csik, J. Fidy, δ-Aminolaevulinic acid-induced porphyrin synthesis and photodynamic inactivation of Escherichia coli B. J. Photochem. Photobiol. B：Biol. 50（1999）8-17. 44.
(56) 附. 錄. 圖附錄. 圖 1. 五-胺基酮戊酸的化學結構. 圖 2. Carbopol 971P（CP）的化學結構. 圖 3. 光源，紅光，波長：630±5 nm，功率：30 mW／cm2.. 45.
(57) OD(ELISA-reader). 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0. 50. 100. 150. 200. 250. 細菌濃度(108 cfu/ml). 300. 350. 400. R2 = 0.9804. 圖 4.1. OD(ELISA-reader) vs Staphylococcus aureus(108 cfu/ml ) Calibration Curve. 46.
(58) ALA-induced PDT on S. aureus 0.25. light 2 216 J/cm. without light with light. 0.20 OD of ELISA-reader. light + 1.0 mM ALA light + 2.5 mM ALA 0.15 light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.2.1 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 2 小時之實驗結果，●代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者且 未照光者、○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 2 小時者、○代表添加 1.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 2 小時者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之金黃色 葡萄球菌照光 2 小時者、○ ○標記者代表添加 5.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 2 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 10.0 mM ALA 照光 2 小時者。. 47.
(59) ALA-induced PDT on S.aureus 0.25 without light with light. 0.20 OD of ELISA-reader. light + 1.0 mM ALA. light 162 J/cm2. light + 2.5 mM ALA 0.15. light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.2.2 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者 且未照光者、○ ○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 1.5 小時者、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、○ ○標記者代表添加 5.0 mM ALA 之金黃色葡 萄球菌照光 1.5 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 10.0 mM ALA 照光 1.5 小時 者。. 48.
(60) ALA-induced PDT on S. aureus. 0.25 without light. OD(ELISA-reader). light 108 J/cm2. with light. 0.20. light + 1.0 mM ALA light + 2.5 mM ALA. 0.15. light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.2.3 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.0 小時之實驗結果，●代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者 ○代表添加 且未照光者、○ ○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 1.0 小時者、○ 1.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.0 小時者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.0 小時者、○ ○標記者代表添加 5.0 mM ALA 之金黃色葡 萄球菌照光 1.0 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 10.0 mM ALA 照光 1.0 小時 者。. 49.
(61) ALA-induced PDT on S. aureus 0.25 without light. OD (ELISA-reader). 0.20. with light. Light. light + 1.0 mM ALA. 54 J/cm2. light + 2.5 mM ALA. 0.15. light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.2.4 金黃色葡萄球菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 0.5 小時之實驗結果，●代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者 且未照光者、○ ○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 0.5 小時者、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 0.5 小時者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA ○標記者代表添加 5.0 mM ALA 之金黃色葡 之金黃色葡萄球菌照光 0.5 小時者、○ 萄球菌照光 0.5 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 10.0 mM ALA 照光 0.5 小時 者。. 50.
(62) OD(ELISA). 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0. 500. 1000. 1500. 2000. 2500. 3000. 3500. 8. 菌液濃度(10 cfu/ml). R2 = 0.9965. 圖 4.3 OD(ELISA-reader) vs Pseudomonas aeruginosa(108 cfu/ml ) Calibration Curve. 51.
(63) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light. OD (ELISA-reader). 0.20. with light. light 216 J/cm2. light + 1.0 mM ALA 0.15. light + 2.5 mM ALA light + 5.0 mM ALA. 0.10. light + 10.0 mM ALA. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.4.1 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 2 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌未添加 ALA 者且未照光、○ ○代表 綠膿桿菌未添加 ALA 照光 2 小時、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 2 小時、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之綠膿桿菌照光 2 小時、○ ○標記者代表添 加 5.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 2 小時、●代表綠膿桿菌添加 10.0 mM ALA 照 光 2 小時。. 52.
(64) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light with light light + 1.0 mM ALA light + 2.5 mM ALA light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. OD(ELISA-reader). 0.20. 0.15. light 162 J/cm2. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.4.2 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌未添加 ALA 者且未照光、○ ○代 表綠膿桿菌未添加 ALA 照光 1.5 小時、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之綠膿桿菌照 光 1.5 小時、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.5 小時、○ ○標記 者代表添加 5.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.5 小時、●代表綠膿桿菌添加 10.0 mM ALA 照光 1.5 小時。. 53.
(65) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light. OD(ELISA-reader). light 108 J/cm2. with light. 0.20. light + 1.0 mM ALA light + 2.5 mM ALA 0.15. light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.4.3 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.0 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌未添加 ALA 者且未照光、○ ○代 表綠膿桿菌未添加 ALA 照光 1.0 小時、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之綠膿桿菌照 光 1.0 小時、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.0 小時、○ ○標記 者代表添加 5.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.0 小時、●代表綠膿桿菌添加 10.0 mM ALA 照光 1.0 小時。. 54.
(66) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light. OD(ELISA-reader). 0.20. with light. light. light + 1.0 mM ALA. 54 J/cm2. light + 2.5 mM ALA. 0.15. light + 5.0 mM ALA light + 10.0 mM ALA. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. time (min). 圖 4.4.4 綠膿桿菌添加 0.0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 mM ALA ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 0.5 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌未添加 ALA 者且未照光、○ ○代 表綠膿桿菌未添加 ALA 照光 0.5 小時、○ ○代表添加 1.0 mM ALA 之綠膿桿菌照 光 0.5 小時、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 之綠膿桿菌照光 0.5 小時、○ ○標記 者代表添加 5.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 0.5 小時、●代表綠膿桿菌添加 10.0 mM ALA 照光 0.5 小時。. 55.
(67) ALA濃度（ｍＭ）. 0.0. 1.0. 2.5. 5.0. 10.0. log(survival fraction). 0. S. aureus. -3. P. aeruginosa. -4.1 -5.3 -6. -6.0. -6.5 -8.0. -9. -8.0. -8.0. ALA-induced PDT. 圖 4.4.5 金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌在添加 ALA 及進行照光 1.5 小時後，細菌存 活率對數值變化情形. 56.
(68) S. aureus with CP 0.25 without light. OD of ELISA-reader. 0.20. with light light + 0.001% CP. light. 0.15 light + 0.005% CP. 108 J/cm2 light + 0.01% CP. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. time (min). 圖 4.5.1 金黃色葡萄球菌添加 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等濃度的 CP ㄧ小 時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.0 小時之實驗結果，●代表金黃色葡萄球菌 未添加 CP 者且未照光者、○ ○代表金黃色葡萄球菌未添加 CP 照光 1.0 小時者、 ●標記者代表添加 0.001% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.0 小時者、● ●標記者代 表添加 0.005% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.0 小時者、●代表金黃色葡萄球菌 添加 0.01% CP 照光 1.0 小時者。. 57.
(69) P. aeruginosa with CP 0.25 without light OD of ELISA-reader. 0.20. light. with light. 108 J/cm2. light + 0.001% CP. 0.15. light + 0.005% CP light + 0.01% CP. 0.10 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. time (min). 圖 4.5.2 綠膿桿菌添加 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等濃度的 CP ㄧ小時後進 行波長 630±5 nm 紅光光照 1.0 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌未添加 CP 者 且未照光者、○ ○代表綠膿桿菌未添加 CP 照光 1.0 小時者、● ●標記者代表添加 0.001% CP 之綠膿桿菌照光 1.0 小時者、● ●標記者代表添加 0.005% CP 之綠膿桿 菌照光 1.0 小時者、●代表綠膿桿菌添加 0.01% CP 照光 1.0 小時者。. 58.
(70) ALA-induced PDT on S. aureus. 0.25 without light with light. 0.20 OD of ELISA-reader. light + 2.5 mM ALA. light 162 J/cm2. light + ALA + 0.001% CP 0.15. light + ALA + 0.005% CP light + ALA + 0.01% CP. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.5.3 金黃色葡萄球菌添加 2.5 mM ALA 及 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等 濃度的 CP ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表 金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者且未照光者、○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 1.5 小時者、● ●代表添加 2.5 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、 ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 及 0.001% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時 者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 及 0.005% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 2.5 mM ALA 及 0.01% CP 照光 1.5 小時者。. 59.
(71) ALA-induced PDT on S. aureus 0.25 without light with light 0.20. light 162 J/cm2. light + 5.0 mM ALA. OD of ELISA-reader. light + ALA + 0.001% CP light + ALA + 0.005% CP 0.15. light + ALA + 0.01% CP. 0.10. 0.05. 0.00 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.5.4 金黃色葡萄球菌添加 5.0 mM ALA 及 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等 濃度的 CP ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表 金黃色葡萄球菌未添加 ALA 者且未照光者、○代表金黃色葡萄球菌未添加 ALA 照光 1.5 小時者、● ●代表添加 5.0 mM ALA 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、 ●標記者代表添加 5.0 mM ALA 及 0.001% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時 者、● ●標記者代表添加 5.0 mM ALA 及 0.005% CP 之金黃色葡萄球菌照光 1.5 小時者、●代表金黃色葡萄球菌添加 5.0 mM ALA 及 0.01% CP 照光 1.5 小時者。. 60.
(72) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light with light. OD of ELISA-reader. 0.2. Light 162 J/cm2. light + 2.5 mM ALA light + ALA + 0.01% CP. 0.15. light + ALA + 0.005% CP light + ALA + 0.01% CP. 0.1. 0.05. 0 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.5.5 綠膿桿菌添加 2.5 mM ALA 及 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等濃度的 CP ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌 未添加 ALA 者且未照光者、○ ○代表綠膿桿菌未添加 ALA 照光 1.5 小時者、● ● 代表添加 2.5 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、● ●標記者代表添加 2.5 mM ALA 及 0.001% CP 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、●標記者代表添加 2.5 mM ALA 及 0.005% CP 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、●代表綠膿桿菌添加 2.5 mM ALA 及 0.01% CP 照光 1.5 小時者。. 61.
(73) ALA-induced PDT on P. aeruginosa 0.25 without light with light light + 5.0 mM ALA light + ALA + 0.01% CP light + ALA + 0.005% CP light + ALA + 0.01% CP. OD of ELISA-reader. 0.2. 0.15. light 162 J/cm2. 0.1. 0.05. 0 0. 20. 40. 60. 90. 120. 150. 180. time (min). 圖 4.5.6 綠膿桿菌添加 5.0 mM ALA 及 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 等濃度的 CP ㄧ小時後進行波長 630±5 nm 紅光光照 1.5 小時之實驗結果，●代表綠膿桿菌 未添加 ALA 者且未照光者、○ ○代表綠膿桿菌未添加 ALA 照光 1.5 小時者、● ● 代表添加 5.0 mM ALA 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、● ●標記者代表添加 5.0 mM ALA 及 0.001% CP 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、●標記者代表添加 5.0 mM ALA 及 0.005% CP 之綠膿桿菌照光 1.5 小時者、●代表綠膿桿菌添加 5.0 mM ALA 及 0.01% CP 照光 1.5 小時者。. 62.
(74) % CP 0. ALA. ALA+0.001% CP. ALA+0.005% CP. ALA+0.01% CP. log(survival fraction). 0. -3. -6. -5.7. 1.0 mM ALA. 2.5 mM ALA. 5.0 mM ALA. 10.0 mM ALA. -6.0 -6.7. -8.0. -8.0. -8.0. -8.0. -9. ALA+CP PDT on S. aureus. 圖 4.5.7 金黃色葡萄球菌在添加 ALA 及 CP，照光 1.5 小時後，細菌存活率對數 值變化情形. 63.
(75) % CP 0. ALA. ALA+0.001% CP. ALA+0.005% CP. ALA+0.01% CP. log(survival fraction). 0. -3. -6. -3.8. -3.9. -5.1. -5.4. -7.0 -8.0. -7.2 -8.0. -9. 1.0 mM ALA. 2.5 mM ALA. 5.0 mM ALA. 10.0 mM ALA. -4.7 -7.1 -8.0. -5.6 -8.0. ALA + CP PDT on P. aeruginosa. 圖 4.5.8 綠膿桿菌在添加 ALA 及 CP，照光 1.5 小時後，細菌存活率對數值變化 情形. 64.
(76) antibiotic susceptibility testing 30 抑制圈直徑(mm). 25 20 15. 12. 14. 12. 18. 17. 16. 12. 12. 23. 20 12. 11. 10 5 0 實驗組. oxacillin disc. + NB. + 1.0 mM ALA. + 2.5 mM ALA. + 5.0 mM ALA. + 10.0 mM ALA. 圖 4.6.1 抗生素 oxacillin（1 μg/disc）合併 ALA 光照 90 分鐘的 antibiotic susceptibility Testing 實驗結果.□：代表未照光者,■：代表照光者.. antibiotic susceptibility testing 30 抑制圈直徑(mm). 25 20 15. 12. 14. 14. 21. 20. 19 14. 14. 26. 23 14. 14. 10 5 0 oxacillin disc. 實驗組. + 0.01% CP. + 1.0 mM ALA + 0.01% CP. + 2.5 mM ALA + 0.01% CP. + 5.0 mM ALA + 0.01% CP. + 10.0 mM ALA + 0.01% CP. 圖 4.6.2 抗生素 oxacillin（1 μg/disc）合併 ALA 與 CP 光照 90 分鐘的 antibiotic susceptibility Testing 實驗結果.□：代表未照光者,■：代表照 光者. 65.
(77) 表附錄 表 1.1 五-胺基酮戊酸光動力抗菌效益在革蘭氏陽性菌的研究成效 ALA 光劑量 (mM) (J/cm2 ). 菌株. log(N/N0). incubation time （hr）. -2.2. 0.3. 50. S. aureus. 50 100 50 0.38. 100 50 100 50 100. S. aureus S. epidermidis Streptococcus faecalis B. cereus. -4.2. 光源. 波長. 功率. (nm). (mW/cm2). White light, tungsten lamps. 140. red light, Universal ARC lamp. 600-700. 80. -4.2. blue light, Universal ARC lamp. 400-500. 80. -2.8. HeNe laser beam. 632.8. 15. 407-420. 20. 12. 出處. 1999 Y. Nitzan21. -4.55 -7 -4.8 -7 0. 4. blue light(CL-420–1 system； CureLight Ltd, Israel). 0 -1.05 -1.89. 66. 2004 Y. Nitzan8.
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