微陣列生物晶片 (Microarray)

細胞的成長、功能和新陳代謝的運作，最基本的就是由DNA 到蛋白質的過程，DNA 首 先轉錄成為RNA，隨後 mRNA 再轉譯成為蛋白質。在人類基因體定序和註解完成之後，

基因體科學的下一步是分析轉錄體 (Transcriptome)，也就是分析研究整個基因體的基因 表現狀況。微陣列生物晶片(Microarray)提供一個平行分析基因表現(Parallel Analysis of Gene Expression)的技術，可以同時偵測成千上萬個基因的表現程度。使用 Microarray 技 術來觀測人類組織、細胞株(Cell Lines)和物種的基因表現，在目前生物和醫學研究上已 經成為十分重要的工具。Microarray 本身又依照製造方式的不同分為 cDNA microarray 和寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)兩種。

2.2.1 cDNA Microarray

cDNA microarray 的製造方式是將 PCR 放大的 cDNA 片段(ESTs)高密度的點在玻片上，

平均每平方公厘上有10-50 個點[Schena 1995]，cDNA 片段的來源是由 cDNA 收藏庫中 挑選出來的選殖珠(clone)構成，每個選殖株有一組編號(clone ID)。cDNA 是 mRNA 反轉 錄為DNA 後的基因片段(ESTs)，已先行將不具轉錄功能的 intron 片段去除。

實驗時，將兩組不同的mRNA 樣本反轉錄為 cDNA 並標上螢光染色劑。一組是所要實 驗樣本的 mRNA，其所反轉錄的 cDNA 被標上 Cy5 螢光染色劑；另一組為參考組，其 cDNA 被標上 Cy3 螢光染色劑。將這兩組 cDNA 混合一起之後，放到 cDNA Microarray 做雜交(Hybridization)，再用雷射光或是 CCD Camera 探查 Microarray 上面 Cy3 和 Cy5 信號的強度，所測出來強度的比率Cy5/Cy3 ，為實驗組相對於參考組的基因表現程度，

完整流程如圖 2.2.1-1 所示。每次實驗處理方式不同，所得到結果的反應強度不同，然 後將結果進行生物統計的分析，通常可以用來測試已經建立的生物學假說[Brown 1999]。

<圖2.2.1-1 cDNA Microarray實驗流程圖>本圖取自聯合國糧食及農業組織。A.將樣本細 胞和參考細胞中的mRAN 經過淬取出來，B.反轉錄為 cDNA 並染上螢光染色劑 Cy5 和 Cy3 後，C.將樣本和參考細胞的 cDNA 混和後，D.放到微陣列上做雜交(Hybridization)，

E.最後利用雷射光或 CCD Cramer 掃瞄基因的表現，將所得的數據放入電腦計算，以紅 黃綠色呈現基因表現比率(Cy5/Cy3)的高低。

2.2.2 寡核苷酸微陣列 (oligonucleotide Microarray)

第二種用來平行分析基因表現的微陣列技術，是由Affymetrix 公司所設計的寡核苷酸微 陣列(oligonucleotide Microarray) 又叫 GeneChip[Lockhart 1996；Lipschutz 1999]，以下 簡稱oligo array。Oligo array 並不如同 cDNA Microarray 由已定序的 cDNA 資料庫中選 擇 EST 來當作雜交(Hybridization)的點，而是利用電腦演算法運算後所設計出來。將已 知的或預測基因的基因序列，分成 11~20 個長度為 25-mer 足以代表該基因的片段作為 雜交的單位Probe，如<圖 2.2.2-1 Probe>所示。Affymetrix 為每個基因片段 Probe 的集合 訂定一個Probe Set ID。

每個Probe 實際上是由一對序列組成，完全配對的序列 Perfect match(PM)和只有一個鹼 基差異的序列 Mismatch reference(MM)，設計用來計算短的核苷酸序列有交互雜交 (Cross-Hybridization)的情形。根據 MAS 5.0 pre-processing 的算法，PM 減掉 MM 訊號強 度平均的差異，所得到的結果代表基因的表現值，如<圖 2.2.2-2 PM-MM>所示。Probe 的製造方式是利用光刻蝕法( photolithography )和化學物質所合成出來的序列，利用這樣 的方式可使單位面積所能包含的基因數目更多，如圖2.2.2-3 所示。

<圖2.2.2-1 Probe>

圖中EXON是DNA中真正會轉錄成mRNA的部分，oligonucleotide Microarray用數個比 較短的序列(Probe)來代表一段完整的 mRNA，每個 Probe 實際上是由一對序列組成如<

圖2.2.2-2 PM-MM>。

<圖2.2.2-2 PM-MM>

每 對 Probe 是 由 一 對 只 有 差 一 個 核 苷 酸 的 序 列 Perfect Match(PM)和 Mismatch

reference(MM)所組成，PM 和 MM 只有位在序列中間的核苷酸有差異，這樣可以避免

cross-hybridization，基因的表現量是計算同一個Probe set中所有Probe的PM強度減去 MM強度的平均值。

<圖2.2.2-3 Affymetrix probe design>本圖取自 Affymetrix Crop. http://www.affymetrix.com

2.2.3 cDNA Microarray 和 oligonucleotide Microarray 之比較

cDNA Microarray 和 oligo Microarray 都分別有其優缺點，表 2.2.3-1 和表 2.2.3-2 整理了 兩種Microarray 的主要差異。Microarray 實驗資料有很高的可再利用性，在研究疾病的 基因表現時，如果能這兩種Microarray 的實驗結果結合在一起比較，則能得到更多精確 的基因表現資料。

表 2.2.3-1 Microarray 比較表一

比較項目 cDNA Microarray Oligo Microarray

索引子(identifier) Clone Image ID Probe Set ID

來源(source) cDNA 收藏庫 電腦計算

製造方式 PCR 放大 化學合成

交互雜交 (cross-hybridization)

常發生，影響實驗誤差 利用(PM-MM)解決

長度 100-mer 以上 20~25-mer

表 2.2.3-2 Microarray 比較表二

比較項目 cDNA Microarray Oligo Microarray

視覺呈現 Two color (Cy5, Cy3) One color

基因表現差異計算 只能分析兩倍以上的差異

[Claverie 1999]

對於兩倍差異以內 有較好的解析能力

單位面積包含基因的密度 低 高

基因表現值的型態 相對值 絕對值

不同實驗室做的實驗 可否一起比較計算

不一定

要看參考樣本是否相同

可

透過scaling factor 調整

成本 低 高