第二章 文獻探討
第三節 成分分析
對於小茴香與白荳蔻精油的成分分析已有許多的研究被發表：
1978 年有研究表示播種日期和種子間距以及施肥處理對小茴香精油 產量的影響[27、28]。2008 年有研究表示小茴香精油的主要成分為 trans-anethole、estragole、fenchone、limonene、α-pinene 和 γ-terpinene [33、34、
35]。2009 年有研究表示小茴香果實在不同的成熟階段時的精油含量變 化。果實從不成熟到成熟時期，其精油含量會隨之而下降[36]。2010 年 有研究表示小茴香萃取物主要成分在水蒸氣蒸餾和超臨界二氧化碳 萃取兩種方法略有不同，但主成分均為 trans-anethole、estragole、
fenchone 和 limonene。另也有研究表明精油含量與單萜成分對氣候條 件（溫度和降雨量）敏感，易受到影響[37、38]。2005 年後陸續有研究 表示白豆荳蔻精油主要成分為 limonene、Eucalyptol、terpineol 和 α-terpinyl acetate[16、28、39、40、41、42、43]。2008 年有研究表示白荳蔻果實在不 同的成熟階段時的精油含量變化。果實從不成熟到成熟時期，其精油 含量會隨之而增加[16、44]。
綜上回顧大致可整理出小茴香與白荳蔻精油之主要化學成分，如 下表：
17
p-Cymene Limonene
(Z)-β-Ocimene
(E)-β-Ocimene
γ-Terpinene OH
Fenchyl alcohol
o
exo-Fenchyl acetate
18
endo-Fenchyl acetate O
(E)-Anethole
Germacrene D
3-Carene
exo-Fenchol O
α-Campholenal
trans-Limonene oxide
19
cis-Sabinene hydrate
p-Anis aldehyde
O
n-Nonane n-Decane Dodecene
n-Tetradecane n-Pentadecane 1-Tetradecene
表二 白荳蔻精油成分
α-Thujene α-Pinene β-Pinene
20
p-Cymene D-Limonene
(E)-β-Ocimene
γ-Terpinene α-Terpinolene
OH
1-Octanol
o
Eucalyptol
HO
trans-Sabinene hydrate
OH
Terpinene 4-ol
HO
21
α-Terpinyl acetate
O
H
H
(E)-Citral
O O
δ-Terpinyl acetate
O O
H
Geranyl acetate
O O
H
Neryl acetate
HO
22
第四節 小茴香及白荳蔻精油應用
關於小茴香和白荳蔻精油的應用已有許多研究，尤其是在抗菌和 抗氧化方面，另外在其他方面如驅蟲、化妝品等也都有研究。
1999 年 Qiu S.等人發表包含白荳蔻在內八種芳香植物揮發油和水萃 取物的藥理活性比較。發現這些芳香植物萃取物對胃液和胃粘膜血流 量的分泌有增加的效果[19]。
此外也有研究指出小茴香精油具有抗氧化活性[12、45、46、47、48、49、50、51]。 小茴香精油具有抗菌活性[11、13、52、53、54、55、56、57]。
2003 年 Ozbek H. 等人發表 小茴香精油具有保肝作用：由急性四氯 化 碳 給 藥產 生的 肝 毒 性 通過 茴香精 油 可 以降 低血清 穀 草 轉氨 酶
（AST），丙氨酸轉氨酶（ALT），鹼性磷酸酶（ALP）和膽紅素濃度
[58]。
2007 年 Choi IH.等人發表 白豆蔻精油對松材線蟲有殺蟲活性[59]。 2015 年 Wakabayashi K.A.等人發表 小茴香精油對曼氏吸血蟲的驅蟲 效果[60]。
2015 年 Ibrahim S.Y.等人發表白荳蔻精油有抗皮膚癬菌活性[61]。 此外也有研究指出白荳蔻精油具有抗菌活性[10、12、62、63]。白荳蔻精油 具有抗氧化活性[12、51]。
由以上文獻知道小茴香與白荳蔻精油可以應用在不同的方面上，
23
尤其在抗菌、抗氧化、驅蟲等方面上有良好的效果。
另在坊間也有利用，小茴香精油改善肌膚鬆垮和毛孔粗大問題，
有緊實除細紋的作用。在消化系統方面，小茴香與白荳蔻精油皆有幫 助消化、利尿、的效果。
24
第三章 材料與方法
第一節 儀器與材料 1. 氣相層析質譜儀：
(a)型號：Thermo Scientific™ ISQ Single Quadrupole GC-MS (b)廠商：Thermo
2. GC 管柱：
(a)型號：TG-SOC(Length：30m, I.D：0.25mm, Film：0.25um) (b)廠商：SUPELCO
3. 固相微萃取針：
(a)型號：100μm PDMS, 75μm Carboxen-PDMS, 65μm PDMS-Divinylbenzen
(b)廠商：SUPELCO 4. 經皮穿透系統:
(a)型號：Hanson Diffusion (b)廠商：Hanson
5. 高壓液相層析儀
(a)型號：pump：L-2130 Detector：L-2455 (b)廠商：HITACHI
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6. HPLC 管柱
(a)型號：Aqu-ODS-W 5μm (4.6mm × 250mm) (b)廠商：BIOSIL
7. Strat-M® Membrane：Merck 8. Acetone 試藥級：Macron 9. Ethyl acetate 試藥級：Macron 10. Methanol 試藥級：Macron 11. 石油醚 分析級：Macron
12. Petrifilm™ Aerobic Count Plate：3M 13. Petrifilm™ Coliform Count Plate：3M
14. Petrifilm™ Staph Express Count Plate and Disk：3M 15. Petrifilm™ Yeast and Mold Count Plate：3M
16. 其他：蒸餾裝置、索氏脂肪抽取器、加熱包
26
第二節 萃取方法
1. 頂空固相微萃取管(HS-SPME)：
分別將購自藥廠的小茴香和白豆蔻取 2 公克放置在樣品瓶中，以 Parafilm 封住瓶口後，分別使用 100μm PDMS、75μm Carboxen-PDMS、65μm PDMS-Divinylbenzen 之固相微萃取管(SPME)吸附 1 小時後，經氣相層析質譜儀分析。
2. 水蒸餾法：
分別將購自藥廠的小茴香和白豆蔻取 200 公克與 4 公升的水，一 起放入5 公升的燒瓶一起蒸餾 4 小時，蒸氣經冷凝管冷凝後收集，
取其油層。
3. 水蒸氣蒸餾法：
分別將購自藥廠的小茴香和白豆蔻取 200 公克和 4 公升的水，放 入5 公升的燒瓶，藥材放置在篩版上，隔水蒸餾 4 小時，蒸氣經 冷凝管冷凝後收集，取其油層。
4. 溶劑萃取法：
分別將購自藥廠的小茴香和白豆蔻取 40 公克以紗布包好後，放入 索氏脂肪抽取器，以 400 毫升的石油醚進行 4 小時萃取，萃取完 畢後將萃取液濃縮。
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第三節 成分分析
在本研究中利用氣相層析質譜儀進行成分分析。
本研究中將各種萃取方法所得萃取物，利用氣相層析質譜儀進行成分 分析。
分析條件：
入口溫度：230℃
烘箱溫度：250℃
載氣：超高純氦氣 載氣流速：1mL/min
60℃維持 3 分鐘後，以每分鐘 4℃升溫至 90℃，以每分鐘 10℃
升溫至200℃，以每分鐘 15℃升溫至 250℃維持 5 分鐘。
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第四節 經皮吸收測試
本實驗採用 Hanson 經皮吸收垂直擴散槽(如圖 5)，進行經皮吸收試 驗。上端為含與不含精油的維生素C(Vit C)或 Methylparaben(MP)的簡 易乳液，下端為生理食鹽水，在上下容器間所用的穿透障壁為 Strat-M®高分子薄膜，而外層則為控制在37℃的水浴。
圖5 Hanson 經皮吸收垂直擴散槽[64]
實驗步驟：
1. 配置維生素 C(Vit C)或 Methylparaben(MP)簡易乳液：在 20mL 樣 品瓶中加入 3mL 甘油、Methylparaben 0.1g、7mL 水、維生素 C 0.1g 和0.1mL Tween 20 均勻混合。
2. 首先將 Hanson 經皮吸收垂直擴散裝置組裝完成。
3. 上端為含與不含精油的維生素 C(Vit C)或 Methylparaben(MP)簡易 乳液，下端為生理食鹽水，並於下端放置磁性攪拌石，置於攪拌器 上攪拌。
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4. 在不同的時間點抽取下層溶液以高效能液相層析分析。
5. HPLC 分析條件：
移動相：70% deuterium depleted water+30%MeOH 分析時間：30 分鐘
流速：1mL/min 吸收波長：254 nm
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第五節 抗菌活性
在本研究中利用挑戰性測試法進行抗菌活性測試。
挑戰性測試法
在樣品中接種特定菌種之懸浮菌液，再加入一定的抗菌劑，微生物在 樣品中生長會受到抑制，導致微生物逐步衰老死亡，當抗菌成分濃度 不足時，微生物會在樣品中生長繁殖，微生物數量不會降低。
實驗步驟：
1. 準備四種菌株(大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，酵母菌，黴菌)的活菌 懸浮混合菌液。
2. 配置 5%精油：在 20mL 樣品瓶中加入 0.5mL 精油、0.5mL 甘油、
9mL 水和 0.1mL Tween 20 均勻混合。
3. 將上述精油的基礎乳液添加 1mL 混合菌液後，放入 20mL 樣品瓶 中攪拌混和，常溫放置，測量 0 天與 28 天的菌落數目。
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第四章 結果與討論
第一節 各種萃取方法之精油的成分探討
固相微萃取(Solid phase micro-extraction，SPME)是一種簡單、快 速且不需使用溶劑的萃取技術。此項技術近年來被廣泛運用於複雜物 質之萃取分析。如水中微量芳香化合物萃取、多環芳香族化合物
（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）之萃取、水中及食品中揮 發性氯化物之微量分析、水中多氯聯苯（polychlorobiphenyls, PCBs）、 水中農藥之分析、魚體中有機金屬的分析、空氣中有機污染物、尿液 與其他基質內的安非他命及其他藥物的分析[65]。
頂空固相微萃取(headspace-SPME，HS-SPME)中「頂空」指的是樣 品與瓶蓋之間的氣體部分。適用於吸附揮發性高的分析物。頂空固相 微萃取吸附成分是散佈在空氣中的揮發性成分，所吸附的成分貼近於 氣相真實成分的組成，可協助判斷香味來源主要是哪些成分。
在 SPME 中分別使用 65μm PDMS-Divinylbenzen、75μm Carboxen-PDMS 和 100μm Carboxen-PDMS 三種不同材質的吸附針。其中 65μm Carboxen- PDMS-Divinylbenzen 主要用於吸附揮發性物質、胺類、硝基芳香類化合物。
75μm Carboxen-PDMS 主要用於吸附氣體和小分子量化合物。100μm PDMS 則是用於吸附揮發性物質。材質的不同會影響吸收的成分及佔 比，吸附微探針之長度(65μm，75μm，100μm)主要影響吸附量。
32
蒸餾法，又可以分為水蒸餾法(Water distillation)和水蒸氣蒸餾法 (Steam distillation)。兩者最主要區別在於萃取物是否浸泡在水中，浸 泡在水中為水蒸餾法(Water distillation)，隔開水不浸泡材料是為水蒸 氣蒸餾法(Steam distillation)。
索氏萃取法，在不適用蒸餾法時，可利用低極性有機溶劑如石油 醚、甲苯等萃取其精油的方法。適用於對熱敏感或精油含量較少的材 料之萃取法。
33
4.1.1.小茴香的萃取分析
4.1.1.1 小茴香以 65μm PDMS-Divinylbenzen 進行 HS-SPME
使用 65μm PDMS-Divinylbenzen 的固相微萃取管進行小茴香的 SPME 萃取，並以氣相層析質譜儀分析(圖 6)，可發現其主要成份有 3 支明顯訊號峰，經比對資料庫後發現在 7.43 的訊號化合物為 D-Limonene(薴烯)。在 9.89 的訊號為 Fenchon。在 13.4 的訊號為 Estragole(草蒿腦)。其中以 Estragole 為主要成分，其滯留時間及含量 比如表三。其餘成分含量較少。
圖6 小茴香以 65μm PDMS-Divinylbenzen 進行 HS-SPME 之 GC-MS 分析圖
表三 小茴香以 65μm PDMS-Divinylbenzen 進行 HS-SPME 之成分表
RT 化合物 面積百分比
7.43
D-Limonene
13.2
34 9.89
O H3C
H3C
CH3
Fenchon
11.4
13.4
O
Estragole
75.5
35
4.1.1.2 小茴香以 75μm Carboxen-PDMS 進行 HS-SPME
改用 75μm Carboxen-PDMS 的固相微萃取管進行小茴香的 SPME 萃取，並以氣相層析質譜儀分析(圖 7)，發現其成分與以 65μm PDMS-Divinylbenzen 所 得 的 成 分 分 布 大 致 相 同 ， 其 主 要 成 分 為 D-Limonene(薴烯)、Fenchon 及 Estragole(草蒿腦)。D-Limonene(薴烯)明 顯比 65μm PDMS-Divinylbenzen 吸附量提高。在 25.03 的訊號為 Octacosanol。其餘成分含量不明顯。
圖7 小茴香以 75μm Carboxen-PDMS 進行 HS-SPME 之 GC-MS 分析 圖
表四 小茴香以 75μm Carboxen-PDMS 進行 HS-SPME 之成分表
RT 化合物 面積百分比
7.2
D-Limonene
43.6
36
37
4.1.1.3 小茴香以 100μm PDMS 進行 HS-SPME
改以 100μm PDMS 的固相微萃取管進行小茴香的 SPME 萃取，
並以氣相層析質譜儀分析(圖 8)，發現與 65μm PDMS-Divinylbenzen 和所得成分相近，但主成分Estragole(草蒿腦)含量更高(表五)。
圖 8 小茴香以 100μm PDMS 進行 HS-SPME 之 GC-MS 分析圖
38
在頂空固相微萃取(HS-SPME)中，使用三種不同的吸附針，分別
為65μm PDMS-Divinylbenzen、75μm Carboxen-PDMS 和 100μm PDMS。由分析結果得知這三種吸附針吸附的主要成分都是
Estragole。在 75μm Carboxen-PDMS 中 Limonene 較多。顯示不同的 材質對吸附的成分確有影響，但不影響主要成分的吸附。
39
40 19.38
O H
O H H
3-Methoxycinnamaldehyde
2.6
22.76
Nonadecane
24.3
23.3
HO
O
n-Hexadecanoic acid
3.7
24.64 HOO H
H
Oleic acid
2.8
41
4.1.1.5 小茴香以水蒸氣蒸餾法進行萃取
使用水蒸氣蒸餾法萃取小茴香精油，進行氣相層析質譜儀分析，
可發現其主要成份亦為 Estragole(草蒿腦)。與內標準品面積比值為 2.07。(在 22.76 的訊號，為添加內標準品 Nonadecane。) 其餘成分含 量均較少。
圖10 小茴香以水蒸氣蒸餾法進行萃取之 GC-MS 分析圖
表七 小茴香以水蒸氣蒸餾法進行萃取之成分表
RT 化合物 面積百分比
13.66
O Estragole
47.2
22.76 Nonadecane 22.7
26.73
O
1 4-Octadecenal
2.6
28.58
HO
Octacosanol 27.5
42
在小茴香精油中，分別使用水蒸餾法與水蒸氣蒸餾法中，可以發
現 兩 種 方 法 的 主 要 成 分 皆 為 Estragole( 草 蒿 腦 ) ， 在水 蒸 餾法 中 Estragole 佔比較高。而所得精油量是水蒸餾法較高(13mL，水蒸氣蒸 餾法：3mL)。
43
4.1.1.6 小茴香以索氏萃取法進行萃取
使用索氏萃取法(溶劑為石油醚)萃取小茴香精油，進行氣相層析 質譜儀分析，可發現原主要成分Estragole(草蒿腦)訊號消失，且 SPME
使用索氏萃取法(溶劑為石油醚)萃取小茴香精油，進行氣相層析 質譜儀分析，可發現原主要成分Estragole(草蒿腦)訊號消失，且 SPME