文獻回顧

甘露聚醣（mannan）普遍存在植物和微生物的細胞壁（Gübitz 等 人，1996），屬於細胞壁儲存性多醣（cell wall storage polysaccharides，

CWSP），可依照結構細分為純的甘露聚醣（pure mannans）、葡萄糖

甘露聚醣（glucomannans）與半乳糖甘露聚醣（galactomannans）（Avigad 和 Dey，1997；Buckeridge 等人，2000）。純的甘露聚醣具有 90%以 上的β 1→4 鍵結 manopyranosyl 殘基為骨幹，和 10%以下的半乳糖以 α 1→6 鍵結取代甘露糖組成。半乳糖甘露聚醣主要以 β 1→4 鍵結的 D-mannose 為骨幹，帶有 α 1→6 鍵結的 D-galactose 側鏈，甘露糖與 半 乳 糖 的 比 例 變 化 由 1 比 1 至 4 比 1 。 葡 萄 糖 甘 露 聚 醣 由 β-glucopyranosyl 和 β-mannopyranosyl 殘基以大約等比例組成骨幹，

並且含有 3 至 6%以 1→6 鍵結的 galactopyranosyl 殘基。半乳糖甘露 聚醣廣泛存在豆科種子中（McCleary 和 Matheson，1976；Avigad 和 Dey，1997；Twaddle 等人，2003），純的甘露聚醣結構與半乳糖甘露 聚醣有關，但呈現水不溶性。Avigad 和 Dey（1997）提到葡萄糖甘露 聚 醣 則 是 存 在 於 單 子 葉 植 物 如 百 合 科 （Liliaceae ）、 石 蒜 科

（Amaryllidaceae）和鳶尾科（Iridaceae）的球莖、塊莖，而這些球莖 與塊莖亦常同時發現有澱粉存在。

甘露聚醣主要是存在於細胞壁，例如單子葉植物的蜜棗（Phoenyx dactylifera）和大象牙椰子（Phytelephas macrocarpa），也存在雙子葉 植物（Buckeridge 等人，2000）。綠咖啡豆（Wolfron 等人，1961）的 種子、胡椒（Watkins 等人，1985）和芹菜（Jacobsen 和 Pressmann，

百合屬植物的球莖（Matsuo 和 Mizuno，1974；Wozniewski 等人，

1992 ）， 蘭 科 Orchis morio L（ Franz， 1979） 及 天 南 星 科 蒟 蒻 Amorphophallus konjac（Sugiyama 等人，1973）的塊莖中也具有甘露

聚醣。在蕃茄（Groot 等人，1988） 和萵苣（Halmer 和 Bewley，1979）

的甘露聚醣可提高胚乳的硬度（Buckeridge 等人，2000）；然而百合 科 Lilium Testaceum 球莖中的葡萄糖甘露聚醣，則與植物儲存水分和 調節滲透勢有關（Wozniewski 等人，1992）。

參與甘露聚醣分解的酵素主要是endo-β-mannanase（EC 3.2.1.78）

與β-mannosidase（EC 3.2.1.25），前者是內切酶，水解由 3 個以上甘 露糖組成的寡聚合物（DP＞3，mannose oligomers），產生甘露雙糖

（mannobiose）和甘露三糖（mannotriose）（Beaugiraud 和 Percheron，

1968；Reese 和 Shibata，1965）；而後者是糖解酵素（glycosidase），

可 分 解 甘 露 雙 糖 和 甘 露 三 糖 ， 也 具 有 甘 露 聚 醣 外 切 酶

（exo-mannopolysaccharase）的作用（McCleary 和 Matheson，1975）。

Endo-β-mannanase 參與特定組織細胞壁的分離（disassemble）或 消化（digest），並且降解甘露聚醣而使植物組織軟化（Toorop 等人，

1996；Filichkin 等人，2004）。在單子葉、雙子葉和裸子植物的種子 內常有許多endo-β-mannanase 的異構酶（Dirk 等人，1995），會水解 甘露聚醣內的鍵結，進而軟化組織的細胞壁（Nonogaki 等人，2000），

可能參與種子的發芽（Bewley，1997）。種子發芽的過程會伴隨著發 生甘露聚醣的消耗，水解產生的小分子會被迅速利用而不會被累積

（Reid，1971；McCleary 和 Matheson，1974；Herold 和 Lewis，1977）。 在豆科植物中，endo-β-mannanase 降解多醣所釋出的糖類提供種子胚 芽生長（圖1-5）（McCleary 和 Matheson，1975；Reid 等人，1977；

Marraccini 等人，2001），也參與發芽後期胚乳細胞壁所含半纖維素

（hemicellulose）的運移（Reid 等人，1977）。蕃茄種子在發芽期間 有很高的 endo-β-mannanas 活性，高度的安定性並存在很多異構酶

（Voigt 和 Bewley，1996；Toorop 等人，1996），但不存在於發育未 完全的蕃茄種子中（Bourgault 等人，2001）。蕃茄種子在胚根形成前，

endo-β-mannanase 的活性先表現在胚乳冠，胚根出現時側胚乳中的酵 素活性明顯增加（Groot 等人，1988；Nonogaki 等人，2000），而後 種子發芽。第一個endo-β-mannanase 基因－LeMan1 是從已萌芽的蕃 茄種子所分離出來，在種子發芽後，LeMan1 表現在整個胚乳，參與 胚乳細胞壁所儲存的甘露聚醣之運移（Bewley 等人，1997）；而 LeMan2 是表現在萌芽中的蕃茄種子，而且只表現在胚乳的珠孔區（micropylar region），可以軟化胚乳冠（endosperm cap）致使胚根從種子出現

（Nonogaki 等人，2000）。Mo 和 Bewley（2002；2003）提出在蕃茄

蕃 茄 種 子 構 造 相 似 ， 即 其 胚 被 胚 乳 包 圍 ， 胚 根 由 胚 乳 珠 孔 尖 端

（microplar tip）突出，此部位為胚乳冠（endosperm cap），因此胚乳 細胞壁的分解軟化對降低種子發芽之機械限制是重要的關鍵（江，

2002）。萵苣（Lactuca sativa）（Halmer 和 Bewley，1979）和苜蓿

（ Medicago sativa ）（ McCleary ， 1978 ） 的 種 子 胚 乳 都 含 有 endo-β-mannanase。

除了種子的發芽外，endo-β-mannanase 存在成熟蕃茄的果皮

（Bewley 等人，2000；Banik 等人，2001），與果實成熟軟化有關

（Bewley 等人，2000；Bourgault 等人，2001；Bourgault and Bewley，

2002）。 Bewley 等人（2000）和 Bourgault 等人（2001）提出成熟的 蕃 茄 果 實 中 endo-β-mannanase 【 LeMan3 （ GenBank accession no.

AF290893）和 LeMan4（Bourgault 和 Bewley，2002）】可能與果實最 外層細胞的外壁緊密連結，其作用與果實成熟有關，是高鹽溶解性酵 素（結合態），而且果皮有磨損或經清洗後都會造成endo-β-mannanase 不均勻的分布。

Filichkin 等人（2004）首次提出在蕃茄的成熟花粉與花藥亦有 endo-β-mannanase 的基因表現（LeMan5）。發育中的蕃茄花藥，於花 藥裂開（dehiscence）前會產生膈膜（septum）細胞壁的降解與裂口

（stomium）的軟化，這種型態明顯改變是與 LeMan5 mRNA 與

endo-β-mannanase 活性的表現有關。

Endo-β-mannanase 通 常 是 屬 於 多 樣 酵 素 系 統 （ multi-enzyme systems），具有時間性（temporal）與組織特異性，並由荷爾蒙調控 表現（Kontos和Spyropoulos，1996；Toorop等人，1996；Voigt和Bewley，

1996；Still和Bradford，1997a，b）。Ni和Bradford（1993）在蕃茄種 子被激勃素（gibberellin，GA）誘發細胞壁水解酶的模型中，即預測 endo-β-mannanase活性受到離層酸（abscisic acid，ABA）調控。由於 胚乳中的激勃素會促進蕃茄種子發芽，亦導致胚乳冠（endosperm cap）

軟化；而離層酸則抑制發芽與胚乳冠軟化（Groot和Karssen，1992；

Toorop等人，1996 和 2000；Mo和Bewley，2003）。在蕃茄種子缺乏 激勃素（GA₄₊₇）基因－gib1 的突變株，發現內生性激勃素會誘導 endo-β-mannanase活性（Groot等人，1988）。

相較之下，植物種子中較少發現 β-mannosidase，目前只發現在 豆科植物紫花苜蓿（Medicago sativa）及角豆樹（Ceratonia siliqua）

的子葉、胚乳（McCleary 和 Matheson，1975）；白三葉草（Villarroya 等人，1978）與印度藕豆（guar）（McCleary，1988）種子中；以及 菊科的萵苣（Ouellette 和 Bewley，1986）種子中。Mo 和 Bewley（2002）

指出在茄科的蕃茄種子發芽後期的側邊胚乳（lateral）及胚乳珠孔

種子純化的β-mannosidase 已得到 LeMside1 基因序列，而比對蕃茄的 β-mannosidase 胺 基 酸 序 列 是 屬 於 糖 基 水 解 酶 家 族 （ Glycosyl Hydrolases Family 1，GHF1），但是由於沒有其它植物的 β-mannosidase

資料庫可參考，目前與非植物物種序列間的相似度很低（Mo 和

Bewley，2002）。

組織拓印（Tissue print）是利用分解甘露聚醣的酵素擴散釋於含 有基質的凝固劑中，酵素會裂解 galactomannan 的基質與染劑－剛果 紅（Congo red）作用，形成與酵素濃度成比例的透明區域。Locust bean gum 基質是一個以 1→4 鍵結的 β-D-mannopyranosyl 為骨幹，帶有 1→6 鍵結的 α-D-galactopyranosyl 側鏈的化合物。而染劑剛果紅則對含有 連續性β 1→4 鍵結的 D-glucopyranosyl，β 1→3 鍵結的 D-glucans 及 galactoglucomannans 的多醣具有高度專一性（Wood，1980），可與內 切酶作用的寡聚合物結合；相對地，與外切酶如 α-galactosidase 或 β-mannosidase 的作用則顯得較不敏銳（Downie 等人，1994）。此方 法可簡易並且有效的定出單一種子內部組織中 endo-β-mananase 之活 性位置 (Toorop 等人，1996；Nonogaki 等人，1998；Nonogaki 和 Morohashi ， 1999) ， 也 可 用 於 分 析 果 實 、 球 莖 和 真 菌 的 endo-β-mananase 活性（Downie 等人，1994），作為定性與定量的參 考準則。

合 成 甘 露 聚 醣 主 要 的 酵 素 是 GDP-mannose pyrophosphorylase，又名GTP-α-D-Mannose-1-P guanylyltransferase（EC 2.7.7.13 ）， 催 化 GTP 和 mannose-1-phosphate （ Man-1-P ） 轉 換 成 GDP-Mannose和無機焦磷酸鹽（PPi）的可逆反應（Davis等人，2004）。 其中GDP-mannose在三種代謝途徑中扮演重要角色，第一種是在醣蛋 白的生合成途徑中，GDP-mannose提供膜蛋白與分泌性醣蛋白進行氮 連結寡聚糖（N-linked oligosaccharides）所需的甘露糖苷（mannosyl）

基；其次GDP-mannose 是細胞壁生合成所需的活化態鳥糞嘌呤甘露 糖；第三種是GDP-mannose亦是生合成維生素C（ascorbic acid）的重 要前驅物。Keller等人（1999）利用反義基因抑制馬鈴薯GDP-mannose pyrophosphorylase的表現，不僅造成了葉片細胞壁內甘露糖含量比野 生株少了30 至 50%，而且轉殖株葉片的維生素C減少了 44 至 72%。

此外，Conklin等人（1997；1999）藉由在阿拉伯芥中維生素C缺失的 突變株－vtc1，證實GDP-mannose pyrophosphorylase參與維生素C的生 合成。綜合上述結果，GDP-mannose pyrophosphorylase同時參與細胞 壁的形成與維生素C的活性表現。Szumilo等人（1993）與Ning和Elbein

（1999）則提出鎂（Mg²⁺）、鈷（Co⁺）和錳（Mn²⁺）金屬離子會增 加GDP-mannose pyrophosphorylase的活性表現。在低等真核生物如

中，GDP-mannose pyrophosphorylase參與細胞壁蛋白質和葡萄聚醣的 共價鍵結（Warit等人，2000；Sacchetti等人，2004）。

维生素C 存在於所有高等植物（Loewus，1999），在植物抗氧化 系統中是一個重要成分（Pallanca 和 Smirnoff，2000；安等人，2004），

對於植物的生長和代謝影響甚鉅，可以延緩衰老，尤其是當植物暴露

於臭氧污染逆境的環境下。維生素 C 亦有多項功能，包括參與通透

膜電子傳遞（Horemans 等人，1994）、光合作用（Smirnoff，2000；

Tabata，2002；安等人，2004）、抵抗植物病蟲害（Smirnoff，2000；

Pastori 等人，2003）、使用於金屬和外來異物的解毒性（Smirnoff，

2000）、植物生長調控（Loewus，1999；Smirnoff，2000；Pastori 等 人，2003）、氧化還原訊息傳遞（Smirnoff，2000；Tabata 等人，2001）、

調節細胞週期以及支撐細胞結構等（Smirnoff，2000；Tabata，2001 和2002；安等人，2004）。

動物是藉由肝臟（哺乳動物和棲鳥）或腎臟（爬蟲類和鳥類）合 成維生素 C（Bánhegyi 等人，1997；Davey 等人，1999）；而靈長類

（primates）、天竺鼠（guinea pig）、少數的蝙蝠（bats）及燕雀類

（passeriform birds）因為缺乏生成維生素 C 最後步驟的 gulonolactone oxidase（Bánhegyi 等人，1997），因而不具有製造維生素 C 的能力，

必須依賴植物作為營養來源（Pallanca 和 Smirnoff，2000）。

蛋白質在活體細胞中是一個一級效應分子（primary effector molecules），而且生理過程常因特殊的組織所限制。高等植物是複雜 的生物體，由多種極為專門的細胞組成組織和器官，每種細胞類型有 不同的生理作用，對於詳盡的監控蛋白質表現將有助於我們剖析控制 植物生長發育的生物學過程（Schad 等人，2005）。二維電泳是一個 老舊的方法，它能夠同時分離成千上萬的多胜肽（polypeptides）

（Schlags 等人，2005），對於由複雜的混合物中區隔和定量蛋白質種 類是極其有益的分析工具（O’Farrell，1975）。儘管基因體序列解碼 帶給生物科技研究上很大進展，然而真正影響細胞生理狀態的是基因 產物－蛋白質。不同於基因的層次，蛋白質的功能常常需要經過後轉 譯修飾(post-translational modification)，如磷酸化（phosphorylation）、

醣化（glycosylation）、甲基化（methylation）（Xiong 和 Zhu，2001）

等來達成，而且蛋白質可利用本身結構的多樣性，同時具有不同的功 能，來完成複雜的細胞內訊號傳遞等工作。近年來二維膠體電泳技術 的改良，再現性顯著地提高，分析靈敏度的增加與蛋白質資料庫 (ExPASy)的日趨完備，可以直接挖取二維膠體上斑點，透過蛋白質定 序儀或質譜儀得知其部份胺基酸序列，配合已知蛋白質資料庫之搜尋 與比對，就可得知該蛋白質斑點身份及後轉譯修飾（Sperling，2001）。

由於文心蘭在花梗發育過程中，假球莖內的多醣以不同型式作儲 存，在抽梗初期，當代假球莖內富含粘質物，經由熱水萃取、酒精沉

由於文心蘭在花梗發育過程中，假球莖內的多醣以不同型式作儲 存，在抽梗初期，當代假球莖內富含粘質物，經由熱水萃取、酒精沉