SDS-PAGE 膠體電泳

A. 10-20%梯度膠片鑄造

1. 準備鑄膠玻璃片擦拭乾淨，選擇合適的間隔條（1.0 mm）

組合起來

2. 鑄膠玻璃片組合後直立放置，準備 10﹪和 20﹪SDS 膠體

溶液（表2-1），在小燒杯混合均勻後，注入梯度鑄膠器，

開啟循環機引流至鑄膠玻璃片組合達預定高度，勿讓氣泡 產生，再輕輕加上一層正丁醇（1-butanol），讓電泳膠面能 成水平；

3. 待膠片凝結後，以濾紙吸去正丁醇，即可進行電泳分析。

B. 電泳方法

1. 將 strip 置於濾紙中瀝乾移除過多液體；

2. 取稀釋 10 倍的電泳緩衝液－Laemmli running buffer【200 mM Glycine 加 25 mM Tris 及 0.025%（w/v）SDS，pH 8.3】

潤濕IPG strip；

3. 鑷子夾起一邊的 strip，其含塑膠面朝玻璃板平貼，沿著 strip 邊緣輕輕朝gel 的上面壓入，避免任何氣泡產生，直到 strip 平貼於gel 上面；

4. 取 5 µl蛋白質marker滴至 5 mm²紙片中，夾起紙片放至strip 旁邊平貼gel上面；

5. 將 agarose buffer【0.5%（w/v）Agarose（Seakem）及 0.002%

（w/v）Bromophenol 溶於 Laemmli running buffer】加熱溶

合strip 及 marker 至固定位置，避免電泳過程中 strip 浮動 影響蛋白進入gel 中；

6. SDS electrophoresis buffer 注入 tank 中，裝上電源蓋，於冷 房以120 voltage 進行電泳；

7. 追蹤染料聚集成藍色細線，並向下泳動，直到藍色細線泳 動至底部，即可終止電泳，進行染色。

C. 膠片染色法

1. 以含有 5% Dichlorodimethylsilane 的氯仿溶液矽化玻璃染 缸表面；

2. 配製 Silver Staining kit，Protein（Amersham Biosciences）

試劑（表2-2）；

3. 取出膠片組合，使玻璃板向上，先除去一側間隔條，再輕 輕撬起玻璃，切除IPG strip，並在膠片的右上方截角作記 號（區別膠片的方向）；

4. 將固定試液倒入玻璃染缸，在染缸上方把上述玻璃板上膠 片挑起一角，小心移動膠片至染缸中；

5. 浸於固定試液中震盪 30 分鐘後，移去固定試液；

6. 加入敏化試液震盪 30 分鐘後，移去敏化試液；

7. 加入超純水洗震盪 3 次，每次 5 分鐘；

8. 加入銀染試液震盪 20 分鐘後，移去銀染試液；

9. 加入超純水洗震盪 2 次，每次 1 分鐘；

10. 加入展開試液震盪至呈色後，移去展開試液；

11. 加入終止試液震盪 10 分鐘後，移去終止試液；

12. 加入超純水洗震盪 3 次，每次 5 分鐘；

13. 加入保存試液震盪 30 分鐘，移去液體後再加入保存試液 震盪30 分鐘。

2.4 維生素 C 含量變化測定

原理：文心蘭的維生素 C 含量測定是將假球莖以 oxalic acid solution 萃取後，利用 MERCK 公司生產的 Ascorbic Acid Test 與 Reflectometer RQflex 分析（Tabata 等人，2002）。

2.4.1 假球莖中維生素 C 的萃取

1. 每克新鮮假球莖以 10 ml oxalic acid（SIGMA，O 0376）solution

1%（w/v）萃取；

3. 收集上清液。

2.4.2 維生素 C 含量測定

1. 將 Ascorbic Acid Test 試紙完全浸漬於粗萃液中約 2 秒鐘；

2. 移除過量的溶液；

3. 啟動 reflectometer 同時静置 15 秒鐘後測量 reflectometer RQ flex plus（MERCK）。

10 % 20 % 30 % Acrylamide / Bis 5.28 ml 10.56 ml 1.5 M Tris-HCl，pH 8.8 4.40 ml 4.40 ml

10 % SDS 0.16 ml 0.16 ml Distilled deionized water 6.48 ml － 50 % glycerol / tracking dye － 0.76/0.44 ml

TEMED 8.00 µl 8.00 µl

10 % APS 65.00 µl 65.00 µl

總 體 積 16.00 ml 16.00 ml

表2-1：鑄膠組成體積配製（10.6 cm × 10.1 cm × 1.0 mm × 4 片）

固 定 試 液 Ethanol

Glutardialdehyde ( 25% w/v ) Sodium thiosulphate ( 5% w/v ) Sodium acetate ( 17 g )

第三章 結果與討論

一、代謝甘露聚醣相關酵素的活性分析

有關種子與果實如何利用儲存於細胞壁的甘露聚醣已經廣泛地被 研究，文心蘭的假球莖雖然含有大量甘露聚醣，然而於開花過程中如 何代謝甘露聚醣則尚未有文獻報導。

以組織拓印分析代謝甘露聚醣相關酵素的研究中，Downie 等人

（1994）是使用 phytagel 取代 agarose 作為凝固劑，其中 phytagel 的 組成為 glucuronic acid、rhamnose 和 glucose。然而曾比較以 0.75%

（w/v）agarose 和 0.7%（w/v）phytagel 的效果，發現在以 phytagel 當作凝固劑的 locust bean gum 基質中酵素呈色不明顯 (結果未顯 示) ，而以 agarose 當作凝固劑的呈色效果較佳。此外，Downie 等人

（1994）提出組織拓印的結果會受反應時間、溫度、pH 值和基質濃 度影響。由於不同來源的 endo-β-mananase 具有不同的最適溫度和 pH 值；而且增加基質濃度會影響擴散反應，因而相對降低組織拓印的效 果。

不論以假球莖的 disc（圖 3-2）或橫切片（圖 3-3）的結果明顯說

3-3 亦顯示在假球莖剛膨大階段，組織拓印呈色反而加深，推測花梗 發育初期階段是合成與分解甘露聚醣的途徑同時進行，而且合成甘露 聚醣的活性可能大於分解途徑；相對地，花梗發育後期分解甘露聚醣 的活性可能大於合成途徑。此外，剛抽梗前的假球莖中心所呈色明顯 較周圍組織為深（圖 3-2 與圖 3-3），推測假球莖內的酵素是呈現不 均勻的分布。

Endo-β-mannanase 及 β-mannosidase 是分解甘露聚醣的兩大類酵 素，在蕃茄（Mo 和 Bewley，2003）、紫花苜蓿（lucerne）、長角豆

（carob）、美國皂莢（honey locust）、關華豆（guar）和大豆（soybean）

等植物的種子萌芽過程中，endo-β-mannanase 和 β-mannosidase 皆有 活性的表現（McCleary 和 Matheson，1975）。圖 3-4A 顯示，自由態 的endo-β-mannanase 在假球莖四個階段都有表現，且隨花序盛開而有 增加的趨勢；然而自由態的 β-mannosidase 只在花梗發育初期表現較

高，花梗分叉後活性即大幅降低（圖 3-5A）。因此推測文心蘭在花

梗發育初期，甘露聚醣的降解是 endo-β-mannanase 與 β-mannosidase 共同參與；但是於花梗分叉後則轉變成以endo-β-mannanase 為主要的 代謝途徑。事實上，這兩類酵素表現未呈現相互協調性的現象亦存在 蕃茄種子內，即高的 endo-β-mannanase 活性未相對地具有高活性的 β-mannosidase，反之亦然（Mo 和 Bewley，2002；2003）。

除了自由態的分解酶，假球莖內亦存在結合態的β-mannanase（圖 3-4B）與 β-mannosidase（圖 3-5B），而且在不同階段的假球莖中存 在與自由態活性相當的結合態β-mannanase（圖 3-4B）；相對地，結 合態的β-mannosidase 亦是如自由態的 β-mannosidase 只在抽梗初期表

現較高的活性（圖 3-5B），尤其在剛抽梗的階段；而花梗分叉後，

結合態的 β-mannosidase 活性亦明顯降低。相較於種子，不論是蕃茄

（Mo 和 Bewley，2002；2003）或萵苣（Halmer 和 Bewley，1979；

Ouellette 和 Bewley，1986），endo-β-mannanase 只表現自由態，並不 存在結合態，而 β-mannosidase 又只表現結合態；但是在成熟的蕃茄 果實，果皮又有結合態的endo-β-mannanase 活性（Bewley 等人，2000；

Bourgault 等人，2001）。由於蕃茄種子（Groot 等人，1988）和果實 中（Tong 和 Gross，1988；Banik 等人，2001）所含的甘露聚醣主要 為 galactomannan；而萵苣種子所含的甘露聚醣主要為 galactomannan 或 galactoglucomannan（江，2002），完全不同於假球莖內的純甘露 聚醣，因此文心蘭假球莖內的 endo-β-mannanase 與 β-mannosidase 是 異於種子或果實的調控機制。

關於參與合成甘露聚醣的 GDP-mannose pyrophosphorylase 表 現，北方墨漬法分析 GDP-mannose pyrophosphorylase 基因在假球莖

（圖 3-6），尤其在假球莖剛膨大階段，此結果與甘露聚醣含量變化 及組織拓印活性分析的結果有一致性，顯示在花梗分叉前，假球莖內 合成甘露聚醣的活性是大於分解方向，而在花梗分叉後合成方向的活 性明顯降低，是以分解途徑為主。

Wozniewski等人（1992）提到百合科（Lilium testaceum）的球莖 中存在葡萄糖甘露聚醣，是甘露糖和葡萄糖以 7 比 3 的比例組成。百 合球莖的endo-β-mannanase是主要分解葡萄糖甘露聚醣的酵素，可能 位於球莖細胞的薄壁組織（parenchyma），另外也有β-mannosidase和 β-glucosidase活性。萌芽時β-mannanase的作用可生成較低分子量的短 鏈葡萄糖甘露聚醣（M_r 3000；DP_n=20），此短鏈甘露聚醣可以更快速 簡易的被利用，同時可能作為與水鍵結的基質，在不需要依賴過多外 界環境的水分，即足夠提供球莖萌芽；開花後，球莖才開始生合成較 高分子量的葡萄糖甘露聚醣。由於文心蘭花梗發育過程中，分解甘露 聚 醣 的 β-mannosidase ， 與 合 成 甘 露 聚 醣 的 GDP-mannose pyrophosphorylase，都主要參與剛萌芽和剛抽梗的花梗發育初期，而 分解甘露聚醣的endo-β-mannanase，則存在於整個花梗發育過程直到 花盛開階段，因此在花盛開階段endo-β-mannanas的作用可能會產生小 分子量的甘露聚醣，此現象是異於百合科球莖。

由酵素活性分析結果顯示，受個體差異性影響頗大，和樣本取自 假球莖中間部，或接近表皮部亦會影響酵素活性結果。臆測文心蘭的 生長季節或假球莖發育時期的時間差異等諸多因素，可能也會影響酵 素活性表現，相關的論點還待詳細的實驗加以證實。

二、當代假球莖內維生素 C 的含量分析

植物維生素 C 的生合成與六碳糖代謝可能是交替的（alternate）

途徑（Davey 等人，1999；Tabata 等人，2002），可經由多個路徑完 成維生素 C 的生合成。GDP-mannose pyrophosphorylase 亦是參與維

生素 C 合成的重要酵素之ㄧ，因此測定假球莖內維生素 C 的含量。

以Ascorbic Acid Test 試紙分析的初步實驗結果顯示（圖 3-7），開花 前的假球莖富含維生素C，濃度高達 700 mg/l 以上，尤其在假球莖剛

膨大階段，維生素C 含量明顯高於剛抽梗、花梗分叉及花盛開階段。

進一步以reflectometer RQ flex plus 定量維生素 C 的含量（圖 3-8），

在剛膨大的假球莖內維生素C 含量可達 8.0 g / kgfwt，隨著花梗的抽

長，假球莖內維生素 C 的含量明顯降低。因此維生素 C 的含量變化

與 GDP-mannose pyrophosphorylase 的活性具有明顯相關性。雖然維 生素C 影響植物的生長和代謝，具有抵抗病蟲害的功能（Smirnoff，

葉片的病毒結果（附錄1），顯示東亞蘭嵌紋病毒（Cymbidium mosaic virus）在花梗發育過程中一直存在，並不會因剛膨大的假球莖具有高

含量的維生素 C 而嵌紋病毒有減少的趨勢，因此維生素 C 與文心蘭

抗病似乎無直接關係。

三、當代假球莖內蛋白質體的分析

從不同階段的假球莖萃取可溶性蛋白質，進行 10 至 20%梯度 SDS

電泳及硝酸銀染色後，切取表現明顯差異的蛋白質，利用質譜分析蛋 白質的種類。圖 3-9 顯示在 20 kDa 附近，花梗分叉後的假球莖內存 在大量的蛋白質並未在剛膨大及剛抽梗的假球莖內表現，切取差異的 上下兩條條帶，經質譜儀分析結果下方條帶無法比對出蛋白質身分，

而上方條帶是mannose binding lectin（圖 3-10）。Barre 等人 ( 1997 ) 提出 Curculigo latifolia 果實所含植物甜味蛋白（curculin）是一種非 功能性的 mannose binding lectin；蘭科植物如對葉蘭屬（Listera ovata）、鈴蘭屬（Epipactis helleborine）、蕙蘭屬（Cymbidium）（Van

Damme 等人，1994）和天麻（Gastrodia elata）（Liu 等人，2005），

與石蒜科中國水仙（Narcissus tazetta）（Ooi 等人，1998），天南星 科半夏（Pinellia ternata）（Yao 等人，2003），菊科菊芋（Helianthus tuberosus）（Nakagawa，2003），紅豆杉科的紅豆杉（Taxus media）

（Kai 等人，2004），及百合科蘆薈Kidachi aloe（Aloe arborescens Miller var. natalensis Berger）（Liu 等人，2005）等植物中皆發現含有 mannose binding lectin。動物的免疫性疾病如風濕性關節炎等，亦和 mannose binding lectin 有關，免疫系統相關的功能性蛋白質表現在文心蘭花梗 發育過程中是很有趣的現象，但目前其發生的原因和作用等詳細機制 還無法清楚了解。

假球莖萃取可溶性蛋白質後，進行二維電泳的結果（圖 3-11），

分別將電泳膠片上花梗發育過程四個時期都出現的斑點，以及只在特

分別將電泳膠片上花梗發育過程四個時期都出現的斑點，以及只在特