3.Crude protein 4.Total sugars
3-2 原料來源及處理
本試驗所使用的雞冠，購自台東市場，將所購買的雞冠於自來水中清 洗，把血液以及髒污的部位去除後，將雞冠切成直徑大約1至1.5公 分，分袋包裝，於－20℃下保存。
3-3 雞冠一般化學組成分析
(1)水份測定(A.O.A.C.,1984)。
A. 洗淨坩鍋後置於105℃烘箱乾燥1小時以上，取出恢復到室溫，測 量、紀錄乾燥後重量。
B. 精確秤取樣品5克，再放入105℃烘箱乾燥3~5小時，取出恢復至室 溫秤重,測量並紀錄之。
水分（﹪）＝b－c / b－a × 100 a：坩鍋之重量（g）
b：坩鍋加樣品之重量（g）
c：坩鍋加樣品乾燥至恆重時之重量（g）
(2)灰份測定(A.O.A.C.,1984)。
A. 將坩堝洗淨，置於500℃灰化爐中至少加熱5小時。
B.稱取坩鍋重量,精確秤取樣品，蓋上坩堝蓋，移入灰化爐。 凱氏法（Kjedhl method）
實驗試劑
1. 指示劑（0.2％ methyl red：0.2％ bromocresol green＝1：5）
2. 4%硼酸溶液
50mL，放入250mL 三角燒瓶。
C. 加入3~5滴指示劑（0.2％ methyl red：0.2％ bromocresol green(1：5），連接蒸餾裝置，使冷凝器下端浸入三角瓶之硼酸
2.濃硫酸98%
3.葡萄糖標準工作溶液:精秤0.1g葡萄糖,定量到100mL,此為1mg/mL 葡萄糖標準工作溶液
葡萄糖標準曲線配製
取為2.0 、4.0、 6.0 、8 .0、10.0μg/mL葡萄糖溶液,取上述不同 濃度的1mL葡萄糖溶液,各加入1mL 5% 酚溶液,於10~20秒內加入5mL 濃硫酸溶液,混合均勻放入水浴槽於25℃水浴15分鐘,以分光光度計
2. 醋酸溶液(acetic acid solution):250ml的醋酸加蒸餾水定容至
4000ml，使其濃度為0.5 mol。
3. 丙酮(acetone)
4. 99.5%乙醇(alcohol) 實驗流程
A.秤取回溫的250克雞冠並去除多餘水分，而後加入胃蛋白酶溶液及 醋酸溶液，先以果汁機高速攪均作用大約10至15分鐘後取出。
B.將液體移入大型三角錐瓶並架設攪拌裝置(SHIN KWANG DC-15)，移 至冷藏櫃10℃中持續攪拌24小時(轉速調至6)，使醋酸溶液和胃蛋白 酶溶液和雞冠完全作用。
C.膠原蛋白粗萃取液以高速離心機離心以分離雜質，離心轉速為5000 xg、時間為30分鐘、溫度為10℃，離心後取上層液。
D.把膠原蛋白粗萃取液加入等量的丙酮溶液，將丙酮相(acetone phase)及水相(water phase)，兩相液體分別收集分裝之。
E.懸浮的白色膠原蛋白取出後加入百分之99.5%的乙醇浸泡大約10分 鐘後，再以高速離心機離心以去除乙醇，離心設定的條件是，轉速 為 5000xg，10分鐘，10℃，離心後去除上層液體得可得膠原蛋白。
圖 3-1 膠原蛋白萃取流程圖
註: 丙酮相(acetone phase)及水相(water phase)，兩相液體分別收
集分裝之。
3-4-2玻尿酸萃取 實驗試劑的配製
1.95%乙醇(alocohol)
2.氫氧化鈉(sodium hydroxide)5M 3.丙酮(acetone)
實驗流程
A.將丙酮相(acetone phase)液體取出後倒入分液漏斗，再加入等量 的丙酮，靜置1小時等待其分層，取上層使用。
B.把上層的液體100mL加入三倍量的95%乙醇，再加入5M氫氧化鈉 4mL，在室溫下攪拌12小時使玻尿酸沉澱。
C.將玻尿酸粗萃取液使用高速離心機離心，離心轉速為5000 xg、時 間為10分鐘、溫度為10℃，離心後去除上層液體得可得玻尿酸。
圖 3-2 玻尿酸萃取流程圖
3-4-3 產物分析
(1)玻尿酸薄層層析(Macherey,1990) 實驗試劑
1. 展開劑:methanol/0.01M potassium phosphate buffer(1:1) 2. 染劑:(0.1% alcian blue、50% alcohol、10mL acetic acid加入
蒸餾水定量至300mL / 0.04g bromocersol green加入95% alcohol 定量到100ml.(1:1 v/v))
實驗流程
A.取矽膠薄層板(silica gel TLC)裁切適當大小在由底部向上三公分 處及12公分處劃上各一水平線。
B.將兩相液體water phase 、acetone phase與膠原蛋白標準品溶液 以毛細管在底部三公分處，滴上水溶液等待其乾燥。
(2)膠原蛋白薄層層析(Macherey,1990) 實驗試劑
1. 展開劑:1M acetic acid / 1M hydrochloric acid(1:1)、0.5M sodium acetate,加入water/methanol(20%)
2. 染劑:添加1% ninhydrin至pyridine/glacial acetic (5:1,v/v) 實驗流程
A.取矽膠薄層板裁切適當大小在由底部向上三公分處及12公分處劃 上各一水平線。
B.將分層的兩相溶液water phase 、acetone phase與膠原蛋白 type 1標準品水溶液以毛細管在底部三公分處，滴上水溶液等待其乾燥。
羥脯胺酸含量分析(hydroxyproline assay) (藍等，2006)
實驗試劑
1. Citrate buffer solutions pH 6.8：26g citrate，14g sodium hydroxide和78g sodium Acetate溶於500ml蒸餾水中，加入250ml n-propyl alcohol，用蒸餾水定量1000mL。此液於4℃在深色瓶中 保存，可穩定幾個星期。
2. Chloramine T 試劑：溶解1.41g chloramine T於100mL citrate buffer solutions（現配現用）。
3. P-dimethylaminobenzaldehyde reagent：35mL perchloric acid.
［60%（m/m）］，稱取10g p-dimethylaminobenzaldehyde,，緩慢 加入65mL isopropyl alcohol（現配現用）。
4.Hydroxyproline.標準儲備液，500μg/mL：準確稱hydroxyproline 標準品50.0mg，用少量水溶解於100mL容量瓶中，加入一滴3 mol/L 硫酸酸定容至刻度。該溶液在4℃下能穩定至少一個月。
5.Hydroxyproline標準工作液：吸取5mL hydroxyproline標準儲備液
500ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容（臨用前配），濃度5μg/mL。
羥脯胺酸(hydroxyproline)標準曲線配製
配製羥脯胺酸濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μg/mL。吸 取4mL上述稀釋好的溶液於具塞試管中，加入2mL chloramine T，搖
勻後在室溫下放置20min，加入2mL p-dimethylaminobenzaldehyde
1. 林格試液: (860mg sodium chloride, 30mg potassium chloride
和33mg calcium chloride 加蒸餾水定量至100mL pH 7.0。
(3)膠原蛋白SDS-PAGE 電泳分析(Nagai, et al., 2000) 實驗試劑
1. 5X running buffer pH 8.3: Tris 90 mM 54.5 g、EDTA·2Na 2.5 mM 4.7 g、Boric acid 80 mM 24.8 g、加水800 mL 溶解，以NaOH 調pH至8.4後，加水至1000 mL，室溫保存。使用時以蒸餾水稀釋 五倍。
2. 蛋白質變性液(protein denaturing solution):取distilled water 4mL，pH6.8的0.5M tris-HCl 1mL，glycerol 1mL，10%SDS 1.6mL，2-β-mercatoethanol 0.4mL， 0.05%(w/v) bromophenol blue 0.2mL移入褐色瓶並貯存於4℃下備用。
3. Fixing solution
取250mL isopropanol，100mL glacial acid，以去離子水定量至 650mL，並貯存於4℃下備用。
4. 膠片染色液(CBR R250)
0.25% comassie Brillant R250，25% isopropanol 7% acetic acid 再以蒸餾水定量至1000mL，貯存於室溫下備用。
A .膠片(PIERCE,4~20% PreciseTM GEL)以固定夾固定後，於電泳槽 (Mini-protein，BIO-RAD)中注入running buffer。
B .以微量注射器吸取10μL 樣品液，注入stacking gel 之凹槽中。
C. 啟動電源供應器，以110V之電力條件進行泳動。
D.當藍色指示劑到達離膠片底部約0.5cm時即停止泳動。
E.將膠片從裝置上取下，將膠片取出，將膠片置於有蓋之塑膠盒
，加入染色液後於震盪器染色30分鐘。
1.牛血清蛋白(bovine serium albumin,BSA) 2.Bio-Rad染劑(dye reagent)
蛋白質標準曲線配製
1.以牛血清蛋白(bovine serium albumin, BSA)為標準品,配置濃度 0.5~50μg/mL為標準品。
2. 取樣品以蒸餾水定量至200mL，在加入1000μL的Bio-Rad染劑 (dye reagent)，反應5分鐘，再用分光光度計在波長595nm測量各 個不同濃度標準溶液的吸光值,然後以濃度對吸光值作圖，即可得 到蛋白質濃度標準曲線。
實驗流程
取樣品以蒸餾水定量至200μL,在加入1000μL的Bio-Rad染劑,反應5
分鐘,再以利用分光光度計在波長595nm測量吸光值,將之代入標準曲 線後，再乘以稀釋倍率，可得蛋白質濃度。
(5)膠原蛋白等電點測定(王，2001) 實驗試劑
1. 3%醋酸溶液
2. 6 mol/L 氫氧化鈉 實驗流程
將所萃取出的膠原蛋白溶解於3%醋酸溶液中,在緩慢滴入6 mol/L 氫 氧化鈉,直至發生沉澱,此時用pH meter測定其pH值。
3-6 玻尿酸特性分析
(1)玻尿酸濃度分析(Bitter,1962) 實驗試劑
1. 硼砂硫酸液: 稱取2.38 g 四硼酸鈉(Sodium tetraborate)，溶於 250 mL 濃硫酸中。
2. Carbazole試液: 稱取0.125 g carbazole 溶於100 mL 無水乙醇，
保存於4℃冰箱（約可保存三個月）。
葡萄糖醛酸標準曲線配製
值為本質黏度( [η]，intrinsic viscosity)。最後利用Mark-Houwink方 程式(陳，1996)來推算玻尿酸的分子量：[η]=KMa，此時K=0.029，
a=0.80。
t：幾丁聚醣溶液通過毛細管b、d 兩處所需的時間 t0：溶劑通過毛細管b、d 兩處所需的時間
C：樣品的濃度
圖 3-2 Ubbelohde 黏度計
圖 3-3 應用外插法求極限黏度
四 結果與討論
4-1 雞冠一般化學特性
雞肉不可食部份（inedible portion of meat）含有大量之蛋白質如 膠原蛋白、彈性纖維蛋白、角蛋白以及血液蛋白等（陳,2000）。
本實驗所使用的雞冠平均為 35g,表 4-1 為雞冠的一般化學組成成份, 其水份、灰份、粗蛋白、總糖量分別為 83、0.2、9.25、5.92﹪,由 結果中發現雞冠中水分含量最高,推論這是由於雞冠中富含黏液,導 致水分含量較高,而粗蛋白在雞冠成分中也有 9.25%,而灰份、總糖量 在雞冠成分中所佔的百分比較低，經換算雞冠內粗蛋白中含有 80%的 膠原蛋白，而雞冠中總糖內含有 72%的玻尿酸。
圖 4.1 總糖標準曲線
表 4-1 雞冠之一般化學組成
4-2 薄膜層析
由於雞冠是玻尿酸含量為最高的動物組織，所以萃取膠原蛋白後想測 試是否在兩相液體中有玻尿酸的成分在，所以將玻尿酸及膠原蛋白的 標準品分別配置與丙酮相與水相做薄膜層析，在圖 4-2 (A)可看出除 了膠原蛋白標準品有跑出,但是在丙酮相與水相並無跑出,而在 4-2(B) 中可發現玻尿酸與由丙酮相所萃取出的玻尿酸跑出的 Rf 值相同，於 是可推測在萃取完膠原蛋白的上層液丙酮相中有玻尿酸的成分，於是 之後便取丙酮相來做玻尿酸後續的萃取液。
圖 4-2 薄膜層析 A. 膠原蛋白薄膜層析圖
B. 玻尿酸薄膜層析圖
4-3 膠原蛋白濃度測定
由於膠原蛋白中含有大量的羥脯胺酸(hydroxyproline)，這是這類蛋白 A
羥脯胺酸(hydroxyproline)來做標準曲線，最後再回推即可得膠原蛋 白濃度。以樣品所測出的吸光值帶入在圖 4-3 標準曲線，再乘以稀釋 倍數，即得到羥脯胺酸的濃度 0.29 mg/mL，而羥脯胺酸在膠原蛋白 內佔 12.5%故將所得到的濃度乘上 12.5，故樣品所測得的膠原蛋白濃 度為以膠原蛋白粗萃取中所萃取出的膠原蛋白濃度為 3.6mg/mL，而 在丙酮相中第二次所萃取出的膠原蛋白濃度為 0.4mg/mL，而兩次所 萃取的膠原蛋白濃度濃度相加為 4 mg/mL，而經換算得到膠原蛋白的 純度為 57%，而回收率為 85%，影響膠原蛋白的純度是由於不同的萃 取方法所能萃出的膠原蛋白含量會有差異性，且本實驗所採用的方法 中在後續處理方面並未有純化的過程，使得有非膠原蛋白的物質在其 中，之後若能在此有後續的研究相信能提高膠原蛋白的純度。
圖 4-3 羥脯氨酸(hydroxyproline)標準曲線
圖 4-4 雞冠萃取出膠原蛋白濃度(1)由膠原蛋白粗萃取液中第一次萃 取出膠原蛋白(2)由丙酮相中第二次萃取出膠原蛋白
4-4 膠原蛋白蛋白質濃度測定
由於在雞冠的成分分析中可發現,雞冠除了水分之外其蛋白質含量為 高, 經由實驗測出萃取出膠原蛋白產物的總蛋白量,在比對膠原蛋白 含量即可得知在萃取過程中雜蛋白去除是否完全，故我們測定所得到 樣品的蛋白質濃度為 13.4.mg/mL 與相同使用醋酸溶液處理 24 小時的 5.24mg/mL(傅等,2004)相比來的高，而在此數據中可看出樣品中蛋白 質濃度有 13.4mg/mL，但是在膠原蛋白濃度測定的結果中只 4mg/mL，
由此數據可看出此樣品中雜蛋白去除的不夠完全，導致膠原蛋白的純 度偏低。
4-5 膠原蛋白等電點測定
當蛋白質溶液處於某一 pH 時，蛋白質游離成正、負離子的趨勢相等，
即成為兼性離子(zwitterion,淨電荷為 O)，此時溶液的 pH 值稱為蛋 白質的等電點(isoelectric point,簡寫 pI)。當到達等電點時蛋白 質會沉澱,而樣品所測出的等電點為 pH 6.5，亦即再此 pH 下會產生 沉澱,所以等電點可用來對於膠原蛋白分離的一個指標。
圖 4-5 蛋白質標準曲線
4-6 蛋白質電泳（SDS–PAGE）
(1)膠原蛋白類型鑑定
電泳是普遍來觀察膠原蛋白二級結構的工具(Deyl, et al.,2000)並
電泳是普遍來觀察膠原蛋白二級結構的工具(Deyl, et al.,2000)並