(Phytohemagglutinin, PHA)刺激之增生反應，而添加 0.45% NaB 可增加 PBMC 分泌干擾素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)之能力，但卻顯著降低脾臟細胞
經 PHA 刺激之增生反應(P < 0.05)。由以上結果顯示，飼料添加未包覆之 NaB 並未能影響離乳仔豬之生長性能、腸道發育或微生物菌相，但會依其 添加濃度影響 PBMC、脾臟及派亞氏結淋巴細胞之免疫反應。
前言 前言 前言 前言
離乳仔豬因離乳與環境緊迫，易遭到外來病源菌感染，因此配製離乳仔 豬飼料時，額外添加天然生長促進劑以取代抗生素之使用，此天然生長促 進劑須具備優良抗菌能力、免疫促進效果及腸道黏膜滋養性等特性，進而 改善離乳仔豬生長效率。丁酸為 4 個碳之短鏈脂肪酸，可經腸道微生物發 酵飼料纖維生成，具有降低飼料酸鹼值及殺菌功能，且同時也促進鈉離子 與水分子之吸收，有助於預防離乳仔豬下痢，而腸道可直接利用其作為能 量來源，促進腸道黏膜生長成熟，但其量在仔豬離乳後降低(Mathew et al., 1996)，故離乳仔豬飼料添加丁酸可能具有改善離乳仔豬生長效率之潛能。
前人研究發現丁酸之生理功能，可能包括降低飼料酸鹼值及殺菌之能力 (Fay and Farias, 1975)，且透過簡單擴散直接進入腸細胞達到快速吸收之功 效(Englehardt et al., 1989)，同時也會伴隨吸收鈉離子及水分子進入腸細胞，
減少腸道中水含量而有助於預防離乳仔豬下痢。腸細胞直接利用簡單擴散 進入細胞中之正丁酸作為能量來源，進而促進腸細胞分化成熟(Smith et al., 1998)。依據 Galfi 及 Bokori (1990)之研究發現，餵食 7 kg 離乳仔豬 0.17% 丁
酸鹽(Sodium butyrate, NaB)至 102 kg 肥育期豬隻結束，可提高隻日增重 23.5%及飼料利用效率 11.8%，進而降低飼料成本 9%並增加豬隻售價 13%。
而且在添加 NaB 之豬隻腸道生理方面，發現可提高迴腸乳酸菌/大腸桿菌比 之比例及其絨毛長度並降低胃潰瘍發生。而且在新生仔豬餵食人工乳添加 0.30% NaB 證實，添加 NaB 可 藉由增加血 中胰臟多肽及膽囊 收縮素 (Cholecystokinin)濃度之機制，進而提高仔豬之隻日增重及小腸絨毛發育 (Kotunia et al., 2004)。
飼料添加 NaB 對豬隻免疫能力影響之研究尚很少，於體外試驗添加 2 mM NaB 可 顯著抑制豬周邊血液單核細胞 (Peripheral blood monocytes, PBMC)增生反應，但卻又可增加干擾素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)之濃度 (Weber and Kerr, 2006)，另外之試驗在體外培養小鼠脾臟細胞，添加 0.2-0.6 mM NaB 則可提高其抗綿羊紅血球抗體力價及介白素-2 (Interleukin-2, IL-2) 分泌量(Kishiro et al., 1994)，但若添加量增加至 1.5 mM NaB 則會抑制淋巴 細胞免疫能力(Cavaglieri et al., 2003)。大鼠飼料中添加 NaB 可減緩腸道發炎 感染之症狀(Venkatraman et al., 2003)，但飼料添加 NaB 是否可增加離乳仔 豬之免疫反應仍不清楚。因此本試驗，乃探討飼料中添加不同濃度 NaB 對 豬隻生長性能、消化道發育及免疫反應之影響，以評估飼料添加 NaB 之效 果。
材料與方法 材料與方法 材料與方法 材料與方法 一、試驗處理
選取 48 頭三週齡離乳雜交仔豬(平均體重 6.18 kg)，依體重逢機分配於 四處理組，試驗處理為添加 0 (對照組)、0.15、0.30 及 0.45% NaB，NaB 以 未覆型式的 NaB 添加(Merck, Germany)。基礎飼料組成以玉米-大豆粕-乳清 粉為主，並以玉米澱粉調整重量，基礎飼料組成和營養分含量分別列於表 1-1，營養分含量符合 NRC (1998)營養推薦量標準。本試驗涉及之動物試 驗，動物之使用、飼養與試驗內容係依據宜蘭大學實驗動物管理委員會批 准之試驗準則進行。
二、動物處理
每處理組有 12 頭仔豬，個別飼養於具良好通風設備之動物舍中，溫度 維持在 27±2℃間，飼料與水任食，飼養至 6 週齡(平均體重約 15.79 kg)。試 驗期間每天觀測仔豬下痢狀態，豬隻每週秤重及結束時秤重，並記錄飼料 採食量。每處理 2 欄，每欄飼養 2 頭，重複 3 次，於試驗開始後 21 天犧牲 動物，豬隻先由頸靜脈抽血後，經靜脈注射 Thiamylal sodium 25 mg/kg 體重 (杏林新生製藥，台灣)，其後再給予 4%鹵乙烷氣體麻醉，並屍解取出內臟 秤重，試驗並分別摘取胃黏膜、胰臟、與距胃幽門部 50 和 75%位置之空腸 與迴腸段組織及黏膜，每處理 4 頭仔豬經快速液態氮冷凍後保存於-80℃，
待分析黏膜 DNA、蛋白質及消化酵素活性。經收集小腸中段至盲腸全段之 食糜，立即送回實驗室分析微生物菌相，部分樣品經-80℃冷凍儲存，以待 分析黏液蛋白濃度。血液 PBMC 與消化道相關淋巴組織(Gut associated lymphoid tissue, GALT)分別測定淋巴細胞之增生反應以及分泌 IFN-γ與 IL-10 之能力。試驗亦摘取空腸和迴腸段組織泡於中性福馬林溶液(J. T.
Baker, AA Deventer, Holland)，以進行組織切片作為觀測小腸黏膜形態，並 分析血漿、膽汁、小腸黏膜及食糜之 IgA 濃度以及血球形態變化。
三、試驗分析
(1)消化道組織結構與酵素活性分析
經固定於 10%中性福馬林中之小腸黏膜組織樣品，以石蠟包埋行橫切 後，每頭豬隻樣品切成 6 μm 厚之薄片以蘇木精(Hematoxylin)和伊紅(Eosin) 染色後，使用單眼 40 倍光學顯微鏡(Olympus BX50)鏡檢 10-15 個外觀完整 之絨毛，絨毛長度由腺窩(crypt)開口至絨毛頂端，腺窩深度由腺窩基部至腺 窩開口距離。
內臟器官重量比，以體重相對重量表示(g/kg 體重)，胃黏膜、胰臟及小 腸黏膜組織經以電動(Pro 2000, PRO Sci. Inc., USA)與手動均質機均質後，依 Labarca and Paigen (1980)之方法以胎牛胸腺 DNA(Sigma Chemical Co., USA)為標準，以螢光光譜儀(Hitachi F3010 型，Japan)，分析樣品 DNA 濃
表 1-1. 基礎飼料配方和營養分組成
Table 1-1. Formula and nutrient composition of basal diet
Item Day 0 to 21
c Sodium butyrate substituted for corn starch.
度，並以 BCA 測定套組(Pierce Inc., USA)分析蛋白質含量。
食糜樣品秤重記錄，經冷凍乾燥後經添加含 0.02 M 疊氮化鈉之生理食 鹽水均質，再離心並以酒精(最終濃度 60%)沉澱過夜，最後依 Honda et al.
(1980)之螢光測定法分析黏液蛋白濃度。
胃、胰臟、空腸與迴腸黏膜樣品經添加 1% Triton X-100 之生理食鹽水 均質，胃黏膜之胃蛋白酶活性(EC 3. 4. 23. 1)依 Rick and Fritsch (1974)之方 法分析，胰臟之胰蛋白酶(EC 3. 4. 21. 4)、凝乳蛋白酶(EC 3. 4. 21. 1)活性分 別依 Geiger and Fritz (1984)與 Geiger (1984)之方法分析，空腸與迴腸黏膜分 別分析鹼性磷酸酶(EC 3. 1. 3. 1)、胺基胜肽酶(EC 3. 4. 11. 2)、蔗糖酶(EC 3.
2. 1. 23)、乳糖酶(EC 3. 2. 1. 48)及麥芽糖酶(EC 3. 2. 1. 20)活性則分別依 Petersen et al. (2002)之方法分析。
(2)食糜微生物菌相
腸道食糜微生物菌中之大腸桿菌以 Coliform agar (Merck, Germany)培 養在 37℃下 24 小時，而乳酸菌以 Rogosa SL agar (Becton Dickinson, USA) 培養在 37℃ 下 48 小時並計算菌落數目。
(3)血球與體液 IgA 分析
血液經血球分析儀(Sysmex XT-1800i, Japan)，測定白血球、紅血球、嗜
中性球、淋巴細胞、單核細胞數目及血紅素濃度。血漿、膽汁、小腸黏膜 及其食糜之 IgA 濃度，分別以酵素鍵結免疫吸附法之商業套組分析(Bethyl Lab Inc., USA)，樣品分別以×7500、×500、×500 及×10000 倍稀釋，以配合 標準溶液濃度標準。蛋白質含量以 BCA 測定套組分析(Pierce Inc., USA)。
(4)淋巴細胞增生反應分析
PBMC 與 GALT(脾臟、派亞氏結及腸繫膜淋巴結)淋巴細胞之增生能力 參考 Boyum (1968)之方法，將組織磨碎後經 100-meshes 不鏽鋼濾網過 篩後以 Histopaque (密度 1.077, Sigma H8889)離心分離並純化後，將細胞調 整至 1×106/mL 。此淋巴細胞培養於含 10%胎牛血清之 RPMI-1640 培養液 中(Life Technologyies Inc., USA)。細胞存活率以 trypan blue exclusion 法測 定皆達 95%以上。淋巴細胞之增生能力依 Schultz and Adams (1978)之 方法，測定其對 5μg/mL 伴 刀豆球蛋白(concanavalin A, con A)、
10 μg/mL 植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)及 5μg/mL 美洲商陸 裂殖原(pokeweed mitogen, PWM) (Sigma Chemical Co., USA)刺激培養 72 h 後，添加 10μCi 3H-胸腺嘧啶(specific activity 80 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech.)共同培養 18 小時後，測定各處理之 count per minute (cpm)值/對照組未經裂殖原刺激之 cpm 值，以計算其增生指數。
(5)細胞激素濃度分析
PBMC 與 GALT 淋巴細胞(1×106/mL/well)，經以 1 mg/mL con A 刺激 培養 24 小時後，離心 250 × g 10 分鐘後抽取上清液，經-80℃冷凍保存，
再 以 酵 素 鍵 結 免 疫 吸 附 法 之 商 業 套 組 測 定 IFN- γ 與 IL-10 濃 度 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (Pierce Inc., USA)。
四、統計分析
試驗之各項資料採用 SAS (1999)統計軟體，依 GLM (general linear models) 程 序 進 行 變 方 分 析 ， 並 以 鄧 肯 氏 多 變 域 測 定 法 (Duncan’s multiple range test)比較處理組平均值間之差異顯著性。
結果 結果 結果 結果 一、生長性能
試驗期間豬隻健康狀態良好，豬隻之存活率達 98%，飼料添加 NaB 對 離乳仔豬生長性能之影響列於表 1-2，試驗豬隻體重從開始試驗時之 6.18 kg 增加至試驗結束時之 15.79 kg，飼料添加 NaB 未影響離乳仔豬隻日增重、
飼料採食量及飼料利用效率。試驗期間之體重變異程度在各處理間也未有 顯著改變。但飼料添加 0.45% NaB 可稍微改善飼料利用效率(8%)卻未達顯 著水準。
表 1-2. 飼料添加丁酸鹽對離乳仔豬生長性能之影響
Table 1-2. Effect of diets supplemented with butyrate on growth performance of weaned pigs
Item N-Butyrate (%)
0 0.15 0.30 0.45 SEM
Body weight (BW)
Initial (kg) 6.74 6.66 6.53 6.60 0.24
Final (kg) 15.65 15.15 15.54 15.33 0.53
BW variation
Initial (%) 11.62 8.69 10.08 12.93 2.66
Final (%) 9.42 8.46 4.89 8.09 2.70
Average daily gain (g/day) 424.2 404.6 429.1 415.9 18.01
Feed consumption (g/day) 546.1 517.4 550.9 494.6 35.92
Gain/feed (g/g) 0.77 0.79 0.78 0.83 0.04
二、腸道發育
飼料添加 NaB 對離乳仔豬器官重量之影響列於表 1-3，飼料添加 NaB 未顯著影響離乳仔豬器官重量。飼料添加 NaB 對離乳仔豬小腸絨毛形態之 影響列於表 1-4。結果發現，飼料添加 NaB 未顯著影響離乳仔豬小腸絨毛 形態。飼料添加 NaB 對離乳仔豬胃黏膜、胰臟及小腸黏膜 DNA 與蛋白質 含量之結果列於表 1-5。結果發現，飼料添加 NaB 未顯著影響離仔豬上述 組織或黏膜之 DNA 與蛋白質含量。飼料添加 NaB 對離乳仔豬小腸食糜黏 液蛋白濃度之結果列於表 1-6。飼料添加 NaB 未顯著影響離乳仔豬小腸食 糜黏液蛋白濃度，僅發現飼料添加 0.45% NaB 可得到最高之空腸食糜黏液 蛋白濃度，其值較對照組約增加 12%。飼料添加 NaB 對離乳仔豬胃黏膜、
胰臟及小腸黏膜消化酵素活性之結果列於表 1-7。飼料添加 NaB 未顯著影 響離乳仔豬所有消化酵素之活性。
三、腸道微生物菌相
飼料添加 NaB 對離乳仔豬腸道菌相之結果列於表 1-8。發現飼料添加 NaB 未顯著影響離乳仔豬迴腸與盲腸之大腸桿菌數、乳酸菌數及乳酸菌/大 腸桿菌比例，但卻發現添加 0.45% NaB 可較對照組增加迴腸食糜乳酸菌/大 腸桿菌之比值達 28%，但因標準機差過大而未達顯著差異水準。
表 1-3. 飼料添加丁酸鹽對離乳仔豬器官重量之影響
Table 1-3. Effect of diets supplemented with butyrate on organ weights of weaned pigs
Item N-Butyrate (%)
0 0.15 0.30 0.45 SEM
Body weight (kg) 15.65 15.15 15.54 15.33 0.52
Stomach (g/kg) 6.53 6.53 6.58 6.48 0.20
Pancreas (g/kg) 2.51 2.39 2.48 2.51 0.08
Small intestine (g/kg) 41.34 39.52 41.59 41.98 1.18
Liver (g/kg) 25.37 25.55 26.57 27.15 0.70
Kidney (g/kg) 5.23 5.81 5.45 5.52 0.18
表 1-4. 飼料添加丁酸鹽對離乳仔豬小腸絨毛形態之影響
Table 1-4. Effect of diets supplemented with butyrate on small intestine villus morphology of weaned pigs
Item N-Butyrate (%)
0 0.15 0.30 0.45 SEM
Jejunum
Villus height (μm) 322.4 319.7 338.9 314.7 14.15
Crypt depth (μm) 212.9 211.2 218.1 204.8 6.37
Villus/crypt ratio 1.55 1.53 1.59 1.57 0.08
Ileum
Villus height (μm) 215.6 221.9 213.1 233.1 8.35
Crypt depth (μm) 179.0 188.5 189.0 188.6 7.63
Villus/crypt ratio 1.24 1.20 1.16 1.27 0.05