方法

本實驗以膽道結紮手術作為誘導大鼠之急、慢性肝毒性的方法，

除瞭解在其急、慢性肝毒性中肝功能，另外分別就其及急性期和慢性 期肝毒性之纖維化程度作分析外，更利用免疫化學染色和螢光雙重染 色作為分析 BMP-7 之蛋白質表現位置，以及使用 RT-PCR 來觀察 核酸（mRNA）之表現量的差異。

一、實驗動物分組：

實驗前將大鼠隨機分為四組 每組 6 隻

Sham control group：對照組，施以剖腹手術，未做膽道結紮手術，為 期4 週

BDL 3D group：施以膽道結紮手術，為期 3 天 BDL 2W group：施以膽道結紮手術，為期 2 週 BDL 4W group：施以膽道結紮手術，為期 4 週

二、膽道結紮手術：

將大白鼠用乙醚迷昏後，以腹腔注射 (intra-peritoneal, I.P.) 的方

的中線將皮層與肌肉層剪開，打開其腹腔翻開其他臟器，沿著肝臟的 各肝葉向下找，於十二指腸上方可找到總膽管 (Common bile duct)，

將總膽管上下兩端以手術用縫合線結紮綁緊，總膽管中間以剪刀剪 斷，將所有臟器歸位後，注入約2ml 的生理食鹽水，將肌肉層與皮層 縫合，注射一劑抗生素 (Ancillina, 約 0.5ml) ，於傷口處塗上碘酒，

待大鼠回復活動力後在送回動物中心飼養，飼養時間分別為期3 天、

2 週、4 週。

犧牲時，將大白鼠用乙醚迷昏後，剖腹採下腔動脈血，取下全部肝臟。

三、肝功能測定-血清生化值

由下腔動脈採血所收集之血液於室溫靜置 1 小時使其凝固，再以 3000rpm，4℃離心 10 分鐘，來分離血清。取上清液以自動生化測定 儀測定GOT、GPT、Total bilirubin、ALP。

四、組織脫水、包埋與切片

將肝臟組織浸泡於 10％中性福馬林固定至少 24 小時後，再移至 水槽以流動的水沖洗約15 分鐘。接著進行組織脫水，置入組織脫水 機 Duplex process，依一定程序以漸增濃度之酒精 70％ alcoholÆ 80

％ alcoholÆ 80％ alcoholÆ 95％ alcoholÆ 95％ alcoholÆ 100％

alcoholÆ 100％ alcoholÆ 二甲苯 (Xylene) Æ XyleneÆ 軟蠟

(Paraffin) Æ Paraffin，此過程經 1４小時後，再於蠟缸中取出組織用 Tissue block system 進行包埋固定，最後進行組織切片，厚度 5µｍ，

置放玻片於室溫通風一天使其乾燥。

五、組織染色 (Hematoxylin ＆ Eosine stain；H/E stain)

將各別含有肝臟組織切片的玻片置於 65℃烘箱 30 分鐘至溶 蠟，再用二甲苯 (Xylene) 浸泡 5 分鐘共 3 次使之脫蠟，接著浸泡於 濃度漸減之酒精 (100％ alcohol，5 分鐘Æ 100％ alcohol，5 分鐘Æ 95

％ alcohol，5 分鐘Æ 95％ alcohol，3 分鐘Æ 75％ alcohol，3 分鐘) 水化後，以流動的水沖洗3 分鐘，將玻片置於 Hematoxylin 染缸浸 泡30~90 秒，使細胞核呈藍色，再以流動的水沖洗 10 分鐘，將玻片 置於 Eosine 染缸浸泡 30~60 秒，使組織纖維與細胞質呈不等程度的 粉紅色。接著浸泡於濃度漸增之酒精 (75％ alcoholÆ 95％ alcoholÆ 95％ alcohol Æ 100％ alcoholÆ 100％ alcohol) 進行脫水，再經 Xylene 浸潤組織後，以封片膠封片放置於室溫下通風致乾燥，於光 學顯微鏡 (Olympus，BX50) 觀察並照相。

六、免疫組織化學染色法 (Immunohistochemistry stain；IHC) 將含有肝臟組織切片的玻片置於 65℃烘箱 30 分鐘至溶蠟，再用 二甲苯 (Xylene) 浸泡 5 分鐘共 3 次使之脫蠟，接著浸泡於濃度漸減 之酒精 (100％ alcohol，5 分鐘Æ 100％ alcohol，5 分鐘Æ 95％

alcohol，5 分鐘Æ 95％ alcohol，3 分鐘Æ 75％ alcohol，3 分鐘)水化 後，以流動的水沖洗3 分鐘。將玻片放置於含 0.01M Citrate buffer (pH antibody)，而對照組則加入 1X PBS 緩衝液作為 Negative control，

皆於4 ℃下反應 16 小時 (overnight)，再以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖 5 分鐘，連續 3 次。接著加入含有 biotin-conjugated 之二級抗體 (Second antibody) ，於 37℃下反應一小時，再以 1X PBS 緩衝液浸泡 震搖5 分鐘，連續 3 次。接著加入 Avidin-Biotin Complex Kit (10µl A + 10µl B +100µl 1X PBS, ABC kit) 於 37℃下反應一小時，再以 1X

PBS 緩衝液浸泡震搖 5 分鐘，連續 3 次。再加入 DAB 呈色劑 (0.05g DAB + 100ml 1X PBS + 67µl H2O2) 反應 3~5 分鐘至呈色，再以二次 水浸泡震搖5 分鐘，連續 3 次。接著浸泡於 Hematoxylin 中 40 秒作 為背景染色，再以流動的水沖洗10 分鐘。放置於烘箱中使其乾燥，

再浸泡於二甲苯 (Xylene)，便可使用封片膠封片放置於室溫下通風致 乾燥後，於光學顯微鏡 (Olympus，BX50) 觀察並照相。

七、膠原纖維的特殊染色 (Masson-Trichome stain)

將切片脫臘，脫水處理，標本用 Bouin's 固定液固定﹐若用其他 固定液所固定者﹐在切片染色前﹐必須在用 Bouin's 重新固定一晚﹐

或在 56℃ 溫箱中泡浸一小時。涼後洗於流動自來水中﹐直到切片表 面上之黃色完全洗去為止。再用 DDW 沖洗一次，Weigert's iron hematoxylin 10 分鐘，DDW 沖洗 10 分鐘，染 Biebrich scarlet-acid fuchsin 6-15 分鐘，DDW 沖洗 10 分鐘，Phospomolydic

/phosphotungstic acid 10-15 分鐘，Aniline blue 5-10 分鐘，1% acetic acid 3-5 分鐘。利用 95%酒精連續脫水二次，利用 100%酒精連續脫水二 次，利用 Xylene 連續清洗 3 分鐘三次﹐然後封片。

八、核糖核酸 (Ribonucleic acid；RNA)的萃取

將暫存放於-80℃的肝臟組織取出秤重分裝 (0.2g /管)，將其放入 2.0 ㏄滅菌平底離心管 (ependoff) 中，加入 400µl Tri-solution reagent 於4℃環境下以組織均質機進行均質，每 10 秒休息一次避免過熱，

再用 23G、26G 針頭反覆均質。接著加入 600µl Tri-solution reagent 進行震盪混勻後，於冰上靜置5 分鐘。接著加入 200µl 的 chloroform 進行震盪混勻，再放於冰上靜置5 分鐘。接著於 4℃ 離心 13000 rpm，45 分鐘。離心後，抽取 200µl 上清液放於另一個 1.5 ㏄滅菌離 心管中，接著加入 200µl Isopropanol 和 200µl PS＆PG Removal solution 進行震盪混勻。接著於 4℃ 離心 12000 rpm，1 小時。離心

將抽取所得的 Total RNA 取 2 µg，利用電泳的方式 (1.0% agarose gel) ，根據 RNA 18S、28S 的表現情況來判定 RNA 質的好壞。

十、反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription- polymerase chain reaction；RT-PCR)

取 0.2 ml 之微量離心管，將含有 1 μg 之 RNA 萃取液及所要測 之 primer 各 0.5 μl 與 one step RT-PCR 試劑充分混合，以聚合連鎖 反應之儀器進行反應， 將所得的 DNA 產物以電泳分析法來評估 mRNA 含量的改變。配置 1.0% agarose gel (0.5 g agarose + 50ml 0.5X TBE buffer + 2.5 μl EtBr)，用微波爐 (750W, 40sec) 加熱溶解後，置 於造膠台中靜置冷卻；將含有 7 μ1 RT-PCR 產物與 1 μ1 6X DNA loading dye 充分混合，加入膠的 well 中，以 100V 跑電泳 25 分鐘，

以數位UV 照相裝置照相並存電腦檔，用密度分析軟體 Gel-Pro Analyzer V. 3.0 分析，以每組之 GAPDH 為基準值，比較各組之相 對變化。

One-Step RT-PCR 試劑量：

RNA (0.5μg/μl) 2μl 5X Reaction Mix 5μl

Anti-sense Primer(10μM) 0.5μl Nuclease free water to 25μl

RT-PCR反應條件：

cDNA synthesis 50℃ 30’

95℃ 2’

PCR cycle(35 cycles) 94℃ 1’

55℃ 1’

72℃ 1’

Final extension 72℃ 4’

Hold 4℃ ∞

十一、肝臟組織冷凍切片的製作

將大白鼠犧牲之後，將其肝臟取下，取一小部分肝臟留作冷凍切 片之用，將此部分肝臟以鋁箔紙及 OCT 包埋液包埋，浸泡於已預先 用乾冰預冷的 -30 ℃ Isopenyenane 燒杯中靜置，使其凝固後，最後 以冷凍切片機，將肝臟組織切至厚度為 15µm 於 -80 ℃冰箱保存。

十二、間接性免疫化學螢光雙重染色法 (indirect double immunofluorescence assay)

將大白鼠的肝臟冷凍切片 (15 µm) 置於室溫下靜置 10 分鐘，加 入 4 % Para formaldehyde 於室溫下靜置 10 分鐘，running water 10 分鐘，以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖 3 次，每次 5 分鐘。往後的每個 步驟需注意避免讓組織呈現乾燥的情況。在使用 0.1M Citrate acid buffer (PH 6.0) 微波 750W 加熱 10 分鐘用以增加抗原和抗體的結 合 ，以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖 3 次，每次 5 分鐘。浸泡 1 % Triton X-100/PBS 室溫下靜置 20 分鐘，以擦手紙吸去 1 % Triton

X-100/PBS，以 1X PBS 緩衝液浸泡震搖 3 次，每次 5 分鐘。加入 阻斷試劑 (5 % Skim milk) 於 37 ℃ 反應 overnight，以防止之後抗 體的非特異性結合，降低其偽陽性。以擦手紙吸去 Skim milk 之後，

以1X PBS 緩衝液潤濕一次，加入 PBS 稀釋後的一級抗體 (Primary antibody) 於 4 ℃ 反應 overnight。以 0.01 % Tween20/PBS 緩衝液 浸泡震搖3 次，每次 10 分鐘，用以洗去 Primary antibody ，加入 PBS 稀釋後的二級抗體 (Secondary antibody) 於 37 ℃ 反應一小時。以 0.01 % Tween20/PBS 緩衝液浸泡震搖 3 次，每次 5 分鐘，用以洗去

時。以 0.01 % Tween20/PBS 緩衝液浸泡震搖 3 次，每次 5 分鐘，用 擦手紙拭去多餘的 0.01 % Tween20/PBS 緩衝液，用封片膠封片。用 共軛焦顯微鏡 (Lecia TCS SP2) 下觀察並分析照相。

十三、蛋白質萃取

將暫存放於 -80℃的肝臟組織取出秤重分裝 (0.2g /管)，將其放 入2.0 ㏄滅菌平底離心管 (ependoff) 中，加入 400µl RIPA reagent 於 4℃環境下以組織均質機進行均質，接著加入 600µl RIPA reagent 補 滿至1ml 進行震盪混勻後，離心 12000rpm，4^oC，20 分鐘，收集上 清液。

十四、蛋白質定量

根據 BCA^TM Protein Assay Kit 實驗操作手冊進行實驗。將蛋白 質液置於沸水中煮5分鐘，迅速放置冰上，取部份蛋白質液出來稀釋 100倍後進行訂量，取 25μl 蛋白質稀釋液和 25μl 等倍稀釋的標準溶 液 BSA 加入 96 well ELISA microplate，加入 200μl working

reagent，37^oC反應30分鐘，以 ELISA reader 測 562nm 吸光值。根 據標準曲線計算樣品蛋白質濃度。

十五、西方點墨法 (Western blot)

將蛋白質用 1X sample buffer 稀釋成 10 mg/ml，置於沸水煮5分 鐘，迅速放置冰上，取 20μl 蛋白質分別加入膠體凹槽中，利用 8 % SDS-PAGE 及 100V 電壓分離蛋白質。

轉漬 (transfer) 時，先將轉漬槽、濾紙、NC 膜用 transfer buffer 沾濕，再取下 SDS-PAGE，將 stacking gel 去除，留下 separating gel，

依序將濾紙、NC 膜、separating gel、濾紙，疊在轉漬槽上，蓋上蓋 子，以 90mA 轉漬2小時30分，轉漬期間在 4^oC 下進行，轉漬完成 後，將已附著蛋白質的 NC 膜放置於 5% 脫脂奶粉中，於室溫下作 用2小時進行 blocking 後取出。

將 blocking 的 NC 膜從 5% 脫脂奶粉中取出後，用 TTBS 洗 20分鐘，接著將 NC 膜置於一級抗體中，4 ℃ 下反應16小時

(overnight)，用 TTBS 洗4次，每次15分鐘，接著將 NC 膜置於接有 biotin-conjugated 之的二級抗體中，室溫下作用1小時後取出，用 TTBS 洗4次，每次15分鐘，接著將 NC 膜置於接有 ABC kit (100µl A + 100µl B + 10ml TTBS) 中，室溫下作用1小時後取出，用 TTBS 洗 4次，每次15分鐘，最後以 ECL 試劑組呈色，利用富士冷光螢光照

十六、統計分析方法

本研究實驗數據以平均值±標準差 (Mean±SD) 來表示。在比較 各組間差異時，採用變異數分析 (One-Way Analysis of Variance;

One-Way ANOVA) 各組間的變異，當組間變異達統計上顯著差異，

進一步以LSD (Least Significant Difference) 進行事後檢定。